Name: 단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 펨토리터 물방울 배열을 이용한 단일 DNA 분자 기반 대규모 병렬 단백질 합성 방법을. 이 기술은 효소 활성을 신속하고 정량적으로 측정하여 복잡한 단백질 정제 없이 생명공학 연구를 효율화합니다.

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이 작품은 JSPS KAKENHI 교부금 번호 JP18K14260및 해양-지구 과학 기술에 대한 일본 기관의 예산에 의해 지원되었다. 특성화 시설을 제공해 주신 데구치 시게루(JAMSTEC)와 이쿠타 테츠로(JAMSTEC)에게 감사드립니다. 상용 소프트웨어 지원에 대한 다카이 켄(JAMSTEC)에 감사드립니다. 마이크로패브릭은 도쿄대학교 다케다 센탄치 슈퍼클린룸에서 실시되었으며, 일본 교육문화체육관과학부(MEXT)의 '나노기술 플랫폼 프로그램', 일본 보조금 번호 JPMXP09F19UT00087이 지원되었다.

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FemDA의 매우 균일하고 안정적이며 생체 적합성을 기반으로 한 고정량 측정은 다른 연구와 는 다른 독특한 특징인 이산 분포를 가능하게 했습니다. 우리는 체계적으로 최적화하고이 논문에서 미세 제조 및 액적 형성 과정을 자세히 설명했다. 설정된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
첫째, 직사각형 얇은 유리 기판상의 고점성 CYTOP 폴리머의 균일한 코팅은 크게 결과 기판의 품질을 결정한다. 배율이 높은 객관적렌즈의 일반적으로 짧은 작동 거리를 감안할 때(단계 6.1 참조), 얇은 커버 유리를 사용해야 합니다. 얇고 유연한 기판에 고품질의 스핀 코팅은 일반적으로 까다롭습니다. 우리는 아직 가능한 모든 설계를 테스트하지 않았지만 동일한 직사각형 치수를 가진 다중 구멍 진공 척이 스핀 코팅에 잘 작동한다는 것을 발견했습니다. 커버 유리 기판의 중앙에 CYTOP 폴리머를 떨어뜨리고 즉시 스핀 코팅을 시작하는 것이 중요합니다(1.3.2 단계 참조). 난이도의 정도는 기판의 형상과...

연구원은 바이오/화학 반응을 수행하기 위해 반응기를 사용합니다. 원자로의 크기를 줄이고 시약 소비를 낮추면서 작업 효율을 높이기 위해 실험 처리량을 늘리기 위한 상당한 노력이 이루어지고 있습니다. 두 측면 모두 연구원들을 무거운 작업부하에서 해방시키고 비용을 절감하며 연구 개발 속도를 높이는 것을 목표로 합니다. 우리는 반응 량과 처리량의 관점에서 원자로 기술의 개발에 대한 명확한 역사적 로드맵을 가지고 : 단일 비커 / 플라스크 / 테스트 튜브, 밀리리터 튜브, 마이크로리터 튜브, 마이크로리터 8튜브 스트립, 마이크로리터 96/384/1536웰 플레이트, 미세유체 나노리터/피콜리터/펨톨리터 반응기1,,2,,3,,4,,5,6,7.,7 지난 수십 년 동안 반도체 산업의 집적 회로 칩에 트랜지스터의 특징 크기를 축소하는 유사, 바이오 / 화학 마이크로 반응기는 볼륨 감소 및 시스템 통합을 겪고있다. 이러한 소규모 도구는 세포 기반 또는 세포가 없는 합성 생물학, 바이오 제조 및 고처리량 프로토타이핑 및 스크리닝8,9,9,10,,11,,12에지대한 영향을 미쳤다. 이 논문은 독특한 물방울 어레이 기술 개발에 대한 최근의 노력을 설명하고 합성 생물학 및 분자 선별 커뮤니티14의기본 기술인 CFPS13에서의 적용을 보여줍니다. 특히, 우리는 의도적으로 모든 사람이 FemDA 장치에 액세스 할 수 있도록 최적화된 저비용 프로토콜을 제공합니다. 소형 화된 장치에 대한 저렴한 비용과 취급하기 쉬운 프로토콜은 대학의 교육 목적에 기여하고 기술을 전파하는 데 도움이 될 것입니다.
FemDA는 평면 유리 기판에 1cm2 당 106의 초고밀도에서 펨토리터 방울을 준비합니다. 우리는 기판상에 마이크로 챔버 어레이를 생성하기 위해 미리 정의된 위치에서 유리 기판에 소수성 폴리머, CYTOP15를코팅하고 선택적으로 에칭 (제거) CYTOP. 따라서, 생성된 마이크로챔버는 소수성 측벽(CYTOP) 및 친성 바닥(glass)으로 구성된다. 패턴 표면 위로 물과 기름이 순차적으로 흐르면 물을 밀고 마이크로 챔버로 밀봉 할 수 있습니다. 소수성 소수성 구조는 마이크로 챔버 외부의 물을 격퇴하고, 개별 미세 반응기를 격리하고, 펨톨리터 공간 내부에 작은 수성 용액을 유지하는 데 필수적입니다. 독특한 성질은 수유 물방울과 지질 이중층 마이크로컴파트먼트16,,17의제조를 성공적으로 위해 적용되었다. 프로토타입장치(16)에비해, 먼저 CYTOP 폴리머의 완전한 제거뿐만 아니라 유리 바닥의 완전한 노출을 실현하기 위해 미세 제조 공정을 최적화했습니다. CYTOP은 유리, 플라스틱 및 실리콘과 같은 기존 미세 반응기 재료보다 표면 장력 (19 mN /m)보다 낮은 특수 불소 폴리머입니다. 그것의 좋은 광학, 전기 및 화학 적 성능은 이미 미세 유체 장치(18,19,,20,,21,22, 22,,,,23,,24)의표면 처리에 활용되었다. FemDA 시스템에서는 CYTOP 표면에서 오일의 좋은 습윤을 달성하기 위해 오일의 표면 장력은 고체표면(25)보다낮아야 한다. 그렇지 않으면, 고체 표면과 접촉하는 액체 오일은 표면 위로 퍼지기보다는 구형이 되는 경향이 있다. 게다가, 우리는 몇몇 대중적인 퍼플루오로카본 오일 (예를 들면, 3M FC-40)16 및 하이드로 플루오로에테르 오일 (예를 들면, 3M Novec 시리즈)는 정량측정에 치명적이고 방울 중 교차 오염의 관점에서 의심할 것이다 CYTOP의 비정질 형태결과로 CYTOP를 용해할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 다행히도, 우리는 낮은 (&19 mN/m) 표면 장력13을전시하는 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 확인했습니다. 또한 선택된 오일및 기능에 용해할 수 있는 새로운 계면활성제를 보다 낮은 농도(0.1%, 적어도 10배 이상 낮은 것으로 보고된 인기 대상자26,,27)13을발견했다. 그 결과 물/오일 인터페이스는 계면활성제에 의해 안정화될 수 있다. 오일의 높은 증발 속도 때문에, 오일플러시에 이어, 우리는 마이크로 챔버를 밀봉하는 첫 번째 오일을 대체하기 위해 또 다른 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 적용했다. 우리는 첫 번째 오일 (ASAHIKLIN AE-3000 와 0.1 wt % SURFLON S-386) "플러시 오일"과 두 번째 오일 (Fomblin Y25)을 각각 "밀봉 오일"이라고 부릅니다.
2단계 오일 밀봉 전략은 정교한 계측 없이 몇 분 안에 펨토리터 액적 배열의 견고한 형성을 실현할 수 있습니다. 증발 문제로 인해 피콜리터부피(28)보다작은 미세 반응기를 생성하는 것이 어려운 것으로 간주되고 있다. FemDA는 미세 반응기/물방울 의 제조에 사용되는 재료와 공정을 체계적으로 최적화하여 이 문제를 해결했습니다. 결과 물방울의 몇 가지 주목할 만한 특징은 높은 균일성 (또는 단백성), 안정성 및 펨토리터 척도에서 생체 적합성을 포함한다. 액적 볼륨의 변형 계수(CV)는 3%에 불과하며(미세한 이미지에 대한 비네팅 보정 없이), 세계에서 가장 작은 CV로, 이는 매우 병렬 및 정량적 측정을 보장합니다. 펨토리터 액적은 실온의 방울 중 교차 오염 없이 최소 24시간 동안 안정적이며, 이는 신뢰할 수 있는 타임코스 측정에 유용합니다. 생체 적합성에 관해서는, 이전에 어렵거나비효율적인,것으로 여겨졌던 펨토리터 액적물에서 단일 복사 템플릿 DNA로부터 다양한 단백질을 합성하는 데성공했다. 왜 FemDA에서 합성 될 수 있는 몇몇 단백질이 그밖 물방울 시스템에서 합성될 수 없는지 해명할 가치가 있을 것입니다. FemDA는 단순히 기술적 진보가 아니라 단백질 수율(액적의 형광 강도에 의해 반영되는)을 각 액적의 템플릿 DNA 분자 수와 연관시킬 수 있는 전례 없는 정량적 측정을 실현했습니다. 그 결과, FemDA 기반 CFPS의 형벌 강도의 히스토그램은 동일한 피크-투-피크 간격의 가우시안 분포의 합계에 의해 멋지게 장착될 수 있는 이산 분포를 보였다. 더욱이, DNA 분자의 상이한 수를 포함하는 물방울의 발생 확률은 푸아송분포(31)에딱 맞다. 따라서, 각 액적에서 상이한 단백질 수율은 이산 분포에 기초하여 정규화될 수 있다. 이 중요한 기능을 사용하면 효소 활동 정보를 다른 미세 반응기 플랫폼과 함께 사용할 수 없었던 명백한 강도와 분리할 수 있습니다. 기존 미세 유체 세포/물방울 선별 시스템은 완전 자동 정렬에 능숙하며 시료 집중에 능숙하지만 때로는 분석 양면32,,33에서비교적 광범위하거나 긴 꼬리 히스토그램만 출력할 수 있습니다. 당사의 고정정성 및 생체 적합성 FemDA 시스템은 미세 반응기 개발 분야에서 새로운 벤치마크와 높은 분석 표준을 설정합니다.
물방울의 제조에 사용할 수있는 오일과 계면 활성제는 여전히 매우 제한되어있습니다 34. FemDA에 설립된 ASAHIKLIN AE-3000과 SURFLON S-386의 조합은 수성 상과 오일 상13단계사이의 물리화학 적 인터페이스의 성장 무기고의 새로운 멤버이다. FemDA의 새로운 인터페이스는 물리적으로 안정적이고 화학적으로 불활성이며, 많은 종류의 단백질을 위한 복잡한 전사, 번역 및 번역 후 수정 기계와 생물학적으로 호환된다13. 대신 액적 설정에서 합성 할 수없는 단백질을 찾는 것이 오히려 매력적일 것입니다. 게다가, 시약의 비용 절감은 나노 리터 및 피콜리터 원자로 시스템35,,36보다펨톨리터 액적 시스템에서 더 분명하다. 특히, 주로 튜브 또는 외부 공급에 의해 발생 되는 큰 죽은 볼륨이 있을 것 이다, 미세 유체 방울 생성 시스템에 하지만 우리의 FemDA에. 어레이 형식은 빠르게 움직이는 오브젝트에 대한 단일 스냅숏이 아니라 모든 단일반응기(37)에대해 반복적이고 상세한 현미경 특성화(소위 고함량 분석과 유사)에 의해 선호됩니다. 펨토리터 스케일은 손가락 크기의 영역에 100만 개 이상의 원자로를 통합할 수 있었으며, 동일한 수의 나노리터 원자로(존재하는 경우)는 평방 미터 면적에 필요하며, 이는 의심할 여지 없이 이러한 시스템을 제조하거나 사용하는 것이 비실용적일 것입니다.

<table><tbody><tr><td>(3-아미노프로필)트리에톡시실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>간토 케미컬</td><td>EL 등급</td><td>EL: 전자식.</td></tr><tr><td>3D 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Lasertec</td><td>OPTELICS HYBRID</td><td>다른 유사한 현미경(예: Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000)도 적용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>50mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-50LZ</td><td></td></tr><tr><td>6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D6567</td><td>디메틸 설폭사이드에 5mM 원액 준비</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grade</td><td>EL: for electronic use. Purity 99.8%.</td></tr><tr><td>송풍기</td><td>Hozan</td><td>Z-263</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 블록</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-24M-02</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 마이크로 튜브 스탠드</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-136C</td><td></td></tr><tr><td>ASAHIKLIN AE-3000</td><td>AGC</td> <td>(테스트 샘플)</td> <td>무료 테스트 샘플은 AGC에 문의 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>BEMCOT PS-2 와이퍼</td><td>Ozu</td><td>028208</td><td></td></tr><tr><td>플런저가 있는 생검 펀치</td><td>Kai</td><td>BPP-10F</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Matsunami Glass</td><td>No. 1 (24mm &times; 32mm, 0.13~0.17mm 두께)</td><td>크기 맞춤형.</td></tr><tr><td>커버 유리 스테인링 락</td><td>나카야마</td><td>803-131-11</td><td></td></tr><tr><td>CRECIA TechnoWipe 클린 와이퍼</td><td>일본 종이 크레시아 Crecia</td><td>C100-M</td><td></td></tr><tr><td>커팅 매트</td><td>GE 헬스케어</td><td>WB100020</td><td></td></tr><tr><td>CYTOP</td><td>AGC</td><td>CTL-816AP</td><td></td></tr><tr><td>탈기 믹서</td><td>Thinky</td><td>AR-100</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 절단기</td><td>롤랜드</td><td>STIKA SV-8</td><td></td></tr><tr><td>개발사</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 300 MIF</td><td>AZ Electronic Materials는 현재 Merck. 에 인수되었습니다. 다른 알칼리성 개발자도 적용할 수 있지만 개발 조건(시간, 온도 등)의 최적화가 필요합니다.</td></tr><tr><td>양면 코팅 접착제 캡톤 필름 테이프</td><td>테라오카 제작소</td><td>7602 #25</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>간토 케미컬</td><td>EL 등급</td><td>EL: 전자 사용 . 순도 99.5%.</td></tr><tr><td>피지</td><td></td><td></td><td>버전: ImageJ 1.51n</td></tr><tr><td>편평하 케이블 절단기</td><td>Tokyo-IDEAL</td><td>MT-0100</td><td></td></tr><tr><td>Fomblin 기름</td><td>Solvay</td><td>Y25, 또는 Y25/6</td><td>무료 시험 샘플은 Solvay에 조회에 유효할지도 모른다. Fomblin Y25/6은 Y25를 쉽게 구할 수 없는 경우 대안이 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>AS</td><td>ONE TH-900</td><td></td></tr><tr><td>주사 바늘</td><td>Terumo</td><td>NN-2270C</td><td>22G &times; 70mm</td></tr><tr><td>반전 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Epifluorescence 사양, CCD 또는 sCMOS 카메라, 전동 스테이지, 자동 초점 시스템 및 높은 NA 대물 렌즈가 필요합니다.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td><td></td><td>버전: 4.5</td></tr><tr><td>마스크 얼라이너</td><td>SUSS</td><td>MA-6</td><td>진공 접촉 모드를 사용할 수 있는 한 다른 마스크 얼라이너도 적용할</td></tr> 수 있습니다.<tr><td>MICROMAN 피펫</td><td>GILSON</td><td>E M250E</td><td>모세관 피스톤 팁: CP250</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>버전: 16.16.15</td></tr><tr><td>미니 진공 챔버</td><td></td><td>AS ONE MVP-100MV</td><td></td></tr><tr><td>핵분해효소가 없는 물</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90101</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-021D/SP</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>AS ONE</td><td>GD90-15</td><td>직경 90mm, 높이 15mm.</td></tr><tr><td>포토레지스트</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ P4903</td><td>AZ Electronic Materials는 이제 Merck에 인수되었습니다. AZ P4620이 대안입니다.</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>POWERSCAN HT</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 장갑</td><td>AS ONE</td><td>6-896-02</td><td>상품명: Saniment.</td></tr><tr><td>PURExpress 체외 단백질 합성 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S 또는 E6800L</td><td>무세포 단백질 합성 반응용.</td></tr><tr><td>반응성 이온 에칭 시스템</td><td>Samco</td><td>RIE-10NR</td><td>다른 RIE 시스템도 적용할 수 있지만 RIE 조건(가스 유량, 챔버 압력, RF 전력, 에칭 시간 등)의 최적화가 필요합니다.</td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>스카치 테이프</td><td>3M</td><td>810-1-18D</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>194-09575</td><td>8M 농도; 위험.</td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>오시가네</td><td>SC-308</td><td></td></tr><tr><td>SURFLON S-386 계면활성제</td><td>AGC</td><td>(테스트 샘플)</td><td>무료 테스트 샘플은 AGC에 문의하면 제공될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머</td><td>Dow</td><td>Sylgard184</td><td>화학 성분 : 폴리 디메틸 실록산. 기본 혼합 비율은 base : curing agent = 10 : 1 (m/m)입니다.</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Ideal-tek</td><td>2WF. SA.1 2A</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>AS ONE</td><td>ASU-2M</td><td></td></tr><tr><td>진공 척</td><td>Oshigane</td><td>(맞춤형)</td><td>재료: delrin; 여러 개의 구멍이 있는 직사각형 샘플 스테이지 (48개의 구멍, 각각 1mm 직경); 크기는 커버 유리의 크기(24mm &times; 32mm)에 맞게 맞춤형입니다.</td></tr></tbody></table>

단일 dna 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

과학 계측의 공간 해상도 및 검출 감도의 발전으로 생물학적 및 화학 연구에 작은 원자로를 적용할 수 있습니다. 고성능 마이크로반응기의 수요를 충족하기 위해 펨토리터 액적 어레이(FemDA) 장치를 개발하고 대규모 병렬 세포 없는 단백질 합성(CFPS) 반응에서 적용을 예시했습니다. 2단계 오일 밀봉 프로토콜을 사용하여 손가락 크기의 영역 내에서 100만 개 이상의 균일한 물방울이 쉽게 생성되었습니다. 모든 액적은 친수성 바닥과 소수성 측벽으로 구성된 펨토리터 마이크로 챔버에 고정되었습니다. 하이브리드 소수성 소수성 구조와 전용 밀봉 오일 및 계면 활성제는 증발 손실없이 펨토리터 공간에서 펨토리터 수성 용액을 안정적으로 유지하는 데 매우 중요합니다. 펨토리터 구성과 FemDA 장치의 간단한 구조는 최소한의 시약 소비를 허용했습니다. 액적 반응기의 균일한 치수는 대규모 정량적 및 시간 과정 측정을 설득력 있고 신뢰할 수 있게 만들었습니다. FemDA 기술은 각 물방울에 있는 DNA 분자의 수와 CFPS 반응의 단백질 수율을 상관시합니다. 우리는 장치의 미세 제조, 펨토리터 방울의 형성, 현미경 이미지 데이터의 수집 및 분석에 대한 절차를 간소화했습니다. 최적화된 낮은 운영 비용을 갖춘 상세한 프로토콜은 표준 클린룸 시설과 기존의 형광 현미경을 갖춘 모든 사람이 FemDA 기술을 이용할 수 있게 합니다.

미세 제조 공정은 기판 세척, 표면 기능화, CYTOP 코팅, 포토리소그래피, 드라이 에칭, 포토레지스트 스트리핑 및 최종 세척으로 구성됩니다. 중요한 것은, 제시된 프로토콜은 마이크로챔버 내부의소수성 CYTOP 폴리머를 완전히 제거할 수 있도록 허용하고, 표준 커버 유리 기판상에서 매우 병렬 성소수성 구조를 생성한다. 오일 밀봉 프로토콜의 도움으로, 생성된 액물의 균일한 치수는 마이크로챔버(도3B)에서형광용액을 캡슐화하여 검증하였다. 개발된 소프트웨어를 사용하여 추출된 형광 강도는 액적 크기의 좋은 지표입니다. 형광 강도의 CV, 3%, 전체 어레이(도3C)에걸쳐 액적 크기의 좁은 분포를 반영하였다. 공초점 현미경검사에서 재구성된 3D 영상도 시간이 지남에 따라 일관된 액적 부피를보였다(그림 3D,보충...

프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.

단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

물방울에서 100만 개 이상의 유니폼이 손가락 크기의 기판에서 생산됩니다. 그리고 단일 DNA 분자는 무작위로 각 물방울로 분포됩니다. 단백질 수율은 물방울에 있는 분자의 수에 비례합니다.우리의 기술은 복잡한 단백질 발현 및 정제없이 효소 활성의 신속하고 정량적 측정을 위해 사용될 수 있습니다. 먼저 염색 선반에 커버 글래스를 놓고 랙을 8개의 어금니 나트륨 수산화나트륨에 놓습니다. 실온에서 커버 글래스와 스테인딩 랙을 15분 동안 초음파 처리합니다.수산화 나트륨에서 염색 랙을 제거하고 물10 번 커버 유리를 헹구습니다. 에어 건으로 커버 글래스를 건조시십시오. 그런 다음 5 분간 섭씨 200도에서 핫 플레이트에 커버 글래스를 구워 서 건조시다.0.05%의 아미노시란 용액을 준비하십시오. 이 용액에 커버 글래스를 담그고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 커버 글래스를 순수한 물에 5번 헹구습니다.그런 다음 공기 총을 사용하여 커버 유리를 건조시십시오. 5분간 80도의 따뜻한 접시에 구워줍니다. 스핀 코터용 맞춤형 진공 척에 커버 글래스 기판을 놓습니다.유리 기판의 중심에 타입-A CYTOP 폴리머의 70 에서 90 마이크로 리터를 분배합니다. 그런 다음 즉시 폴리머를 스핀 코팅합니다. 초기 폴리머 코팅은 최종 마이크로 챔버 어레이의 품질을 손상시다.기포를 도입하지 않고 폴리머를 커버 글래스 의 중앙에 분배합니다. 코팅 된 유리를 모서리에 올려 놓고 알루미늄 호일에 놓습니다. 섭씨 80도에서 30분간 구운 다음 섭씨 200도에서 1시간 더 구워줍니다.기판의 중앙에 있는 포토레지스트의 0.2 에서 0.3 밀리리터를 분배합니다. 600rpm에서 60초 동안 포토레지스트를 즉시 스핀 코팅합니다. 에탄올에 젖은 닦기를 사용하여 기판 가장자리에서 과도한 포토레지스트를 제거합니다.기판을 섭씨 110도에서 5분간 굽습니다. 포토레지스트를 재수화하려면, 기판이 42~60%의 상대 습도에서 30분 동안 서게 하여 기판을 마스크 정렬기로 로드하고 진공 접촉 모드에서 25초 동안 노출시키십시오. 그런 다음 노출 된 포토 레지스트를 용해하기 위해 5 분 동안 개발자에게 기판을 침수하십시오.순수한 물을 사용하여 기판을 10번 헹구는 다. 그런 다음 공기 총을 사용하여 기판을 철저히 건조시십시오. 반응성 이온 에칭 기계의 반응 챔버에 기판을 놓고 산소 플라즈마로 CYTOP를 덮은 포토 레지스트를 식히게 한다.에칭 후, 실온에서 5 분 동안 아세톤에서 기판을 초음파 처리하여 나머지 포토 레지스트를 제거하십시오. 그런 다음 기판을 프로판올로 5분간 초음파 처리합니다. 원고에 설명된 대로 순수한 물을 사용하여 기판을 헹구고, 초음파 처리하고, 헹구십시오.그런 다음 공기 총으로 기판을 건조시십시오. 데스크톱 커터를 사용하여 이중 코팅 된 점착형 Kapton 필름 테이프를 정의된 마이크로 채널 모양으로 잘라냅니다. PDMS의 성형마스터역할을 하기 위해 평평한 페트리 접시 바닥에 테이프를 붙인다.테이프 패턴페트리 접시에 PDMS 혼합물을 붓습니다. 그런 다음 페트리 접시를 미니 진공 챔버에 넣고 PDMS 혼합물을 1~3시간 동안 분해합니다. 그런 다음 페트리 접시를 60도의 오븐에 넣고 PDMS를 치료하기 위해 하룻밤을 둡니다.PDMS가 경화 된 후, 페트리 접시에서 경화 된 탄성탄을 벗기고 평면 케이블 커터를 사용하여 PDMS 마이크로 채널 블록을 잘라냅니다. 그런 다음 각 마이크로 채널의 각 끝에 구멍을 펀치. 이전에 준비된 기판은 마이크로 챔버 어레이에 대한 영역을 갖습니다.PDMS 마이크로채널을 기판의 이 부분에 배치합니다. 그런 다음 PDMS 마이크로 채널의 구멍 중 하나에 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 삽입합니다. 먼저 PCR 튜브에서 CFPS 반응 용액을 준비합니다.그런 다음 200 마이크로리터 비필터 파이펫 팁을 사용하여 용액의 10 마이크로리터를 그립니다. 파이펫 팁을 PDMS 마이크로채널의 입구 구멍에 삽입하고 마이크로채널 콘센트에서 솔루션이 오버플로될 때까지 파이펫 플런저를 아래로 밀어 넣습니다. FemDA 장치를 미리 냉각된 알루미늄 블록으로 전송합니다.마이크로 챔버 어레이 영역이 반투명에서 투명으로 빠르게 변하는지 확인합니다. 미리 냉각된 플러시 오일 300마이크로리터를 끌어당기고 즉시 오일을 마이크로채널 입구 구멍의 파이프 팁으로 옮춥니다. 플러시 오일은 마이크로 채널로 이동하고 마이크로 챔버 외부에있는 과도한 반응 솔루션을 압출한다.동시에 장치에서 삽입 된 두 개의 파이프 팁을 제거합니다. 즉시 알루미늄 블록에서 파라핀 필름으로 장치를 이동합니다. 밀봉 오일을 포함하는 준비된 파이펫 팁을 PDMS 마이크로채널입구에 삽입하고 콘센트에서 흘러들어볼 때까지 오일을 주입합니다.펨토리터 물방울은 오일에 의해 개별 마이크로 챔버에 밀봉됩니다. 비집중 BF 이미지를 엽니다. 모든 프레임에서 매끄러운 연속 배경을 제거하려면 프로세스 메뉴에서 배경을 빼기를 선택합니다.롤링 볼 반지름에 대해 20을 입력합니다. 미리 보기 란을 선택하고 확인을 선택합니다. 모든 이미지를 처리할지 여부를 묻는 질문에 예(예)를 선택합니다.다음으로 노이즈를 줄이려면 프로세스, 필터, 중앙값을 선택합니다. 픽셀의 반지름에 대해 2.0을 입력합니다. 미리 보기 란을 선택하고 확인을 선택합니다.모든 이미지를 처리할지 여부를 묻는 질문에 예(예)를 선택합니다. 다음으로 이미지, 조정, 임계값을 선택하여 미세 챔버의 이미지를 이미지 배경과 분리합니다. 플러그인 메뉴에서, 펨다, 펨DA 분석을 선택합니다.단일 마이크로 챔버의 대략적인 최소 픽셀 및 최대 픽셀 수를 입력합니다. 마이크로 챔버와 시작 및 끝 프레임 번호의 예상 최소 및 최대 순환은 ROI 생성을 선택하여 마이크로 챔버를 감지합니다. 성공적으로 검색된 ROI는 팝업 메뉴 ROITable에 표시됩니다.FemDA 분석 창에서 ROI 마스크 적용을 선택합니다. 이미지를 검사하여 미세 챔버가 제대로 감지되었는지 확인합니다. 형광 이미지를 열고 전면에 가져온다.형광 이미지에 ROI를 추가하려면 ROI 마스크를 다시 적용하십시오. FemDA 분석 창에서 원샷을 선택하여 이미지 엔드포인트 데이터를 분석합니다. 상단 픽셀 수에 대해 N을 입력하여 각 ROI의 최상위 픽셀을 사용하여 해당 액적의 평균 강도를 계산합니다.그런 다음 강도 측정을 클릭하여 감지된 모든 물방울의 평균 강도를 계산합니다. ROITable은 형광 이미지의 새 데이터로 업데이트되고 히스토그램이 새 창에 표시됩니다. 텍스트로 저장 버튼을 클릭하여 데이터를 내보냅니다.형광용액은 FemDA 마이크로챔버에 캡슐화되었고 액적 크기와 상관관계가 있는 형광 강도는 현미경을 사용하여 측정되었다. 물방울은 크기 분포가 좁은 것으로 나타났습니다. 공초점 현미경 검사법에서 재구성 된 3D 이미지는 또한 시간이 지남에 따라 일관된 액적 크기를 보여 주었다.물방울은 적어도 24 시간 동안 물방울 중 증발 손실 또는 교차 오염없이 실온에서 안정되었다. 형광 단백질 mNeonGreen은 FemDA에서 합성되었습니다. 그리고 스택 이미지 데이터는 동시 디포커스 밝은 필드 이미지의 도움으로 분석되었다.각 액적의 형광 강도는 단백질 수율을 측정하기 때문에 히스토그램은 액적 당 DNA 분자의 불평등 한 수를 강력하게 시사합니다. DNA 분자의 다른 수를 포함하는 물방울의 확률은 푸아송 분포에 완벽한 적합이었습니다. 효소 알칼리성 인산염의 합성은 또한 5분마다 캡처된 이미지와 함께 FemDA에서 수행되었다.반응은 이전 시점에서 물방울의 형광 강도의 유사한 신중한 분포를 보여주었고 히스토그램 결과는 물방울에 있는 DNA 분자의 불평등한 숫자가 있다는 것을 확인했습니다. 개별 물방울에 캡슐화된 단일 DNA 분자는 더 회복, 증폭 및 서열화되어 가장 높은 단백질 선별이 가능합니다. 소량과 높은 안정성을 특징으로 하는 액적 기술은 특정 바이오마커를 사용하여 암 질환의 신속하고 정확한 분자 진단을 가능하게 합니다.

a-femtoliter-droplet-array-for-massively-parallel-protein-synthesis

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.

고밀도 바코드 항체 마이크로 어레이의 흐름 패턴 가이드 제작

여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

이 작품에는 미세 물방울 기반 플랫폼의 제조와 스피어 PCR 확대를 위한 polyacrylamide 스피어의 응용 프로그램에 대 한 방법을 제공 한다. 스피어 PCR 방법 단일 가닥 DNA amplicons 이중 가닥 DNA를 분리 하지 않고 얻을 수 있습니다.

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

이 기사에서는 현장에서 제조 된 핵산 마이크로 어레이의 합성 및 응용 분야의 새로운 개발을 제시하고 논의합니다. 특히, 우리는 DNA 합성을 위한 프로토콜이 RNA로 확장될 수 있는 방법과 마이크로어레이가 어떻게 회수 가능한 핵산 라이브러리를 만드는 데 사용될 수 있는지 보여줍니다.

고밀도 DNA 및 RNA 마이크로어레이 - 광소학 합성, 하이브리드화 및 대형 핵산 라이브러리의 제조

우리는 시험관 내 전사 반응을 조절하기 위해 새로운 DNA 테더T7 RNA 폴리머라제의 엔지니어링을 설명합니다. 우리는 단백질 합성 및 특성화를 위한 단계를 논의하고, 개념 증명 전사 적 조절을 검증하며, 분자 컴퓨팅, 진단 및 분자 정보 처리에 대한 응용 분야에 대해 논의합니다.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

연구 결과는 복제하거나 살아있는 세포를 사용하지 않고 합성 유전자 단편에서 단백질 검열 캠페인을 위한 DNA의 큰 (μg-mg) 양을 만들기 위한 프로토콜을 기술합니다. 최소 템플릿은 효소적으로 소화되고 원형화된 다음, 이더스말 롤링 서클 증폭을 사용하여 증폭됩니다. 세포 없는 발현 반응은 불정제 된 제품으로 수행 될 수있다.

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

학습하세요 펨토리터 물방울 배열을 이용한 단일 DNA 분자 기반 대규모 병렬 단백질 합성 방법을. 이 기술은 효소 활성을 신속하고 정량적으로 측정하여 복잡한 단백질 정제 없이 생명공학 연구를 효율화합니다.

단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

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