Name: 다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 학습하세요 쥐와 쥐 모델에서 어려운 뇌 영역을 정밀하게 표적화하는 각진 입체 적 수술 기법을 통해 신경 과학 연구를 향상시키는 방법을. 이 프로토콜은 캐뉼라 이식 및 바이러스 미세주입에 적용 가능합니다.

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이 작품은 국립 당뇨병 및 소화 및 신장 질환 연구소 (NIDDK)가 F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G)에 의해 지원되었습니다..M 미국 당뇨병 협회 혁신적인 기초 과학 상(#1-19-IBS-192 ~ G.J.M)과 NIDDK 가 자금을 지원하는 영양 비만 연구 센터(DK-035816), 당뇨병 연구 센터(DK-017047) 및 당뇨병, 비만 및 신진 대사 훈련 그랜트 T32 DK0007247 (T.H.M) 워싱턴 대학에서.

모든 절차는 국립 보건원, 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 승인되었으며 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 환경 보건 및 안전 모두에 의해 승인되었습니다.
1. 각진 좌표 계산
<ol><li>관상 동맥을 사용하여, hypotenuse가 관심의 대상 영역을 통과 할 수 있도록 오른쪽 삼각형을 표시합니다. 대표적인 예에서(도 1),시상하심 심근핵(VMN)은 관상 동맥 중음부로부터 15° 각도를 표적으로 한다. 참고: 도 1(따라서 측면 C의 길이)에 묘사된 회전 축의 배치는 임의적이며 임의의 뇌 영역을 대상으로 수정할 수 있습니다. 직관적이지 않은 것처럼 보일 수 있지만 프로토콜의 이후 단계는 이 점이 회전의 입체 중심과 정렬될 수 있도록 z축에서 헤드의 위치를 조정합니다(섹션 6 참조). 그러나 헤드 홀더 장치의 물리적 제약으로 인해 15°의 관상 회전 각도를 초과하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>원하는 각도(a) 및 측면 B의 추정 길이를 설정하고 삼각방법을 사용하여 측면 A 및 C의 길이를 계산합니다. 이 단계는 회전 중에 헤드를 올바르게 배치하는 데 중요합니다. 참고: 도 1의예에서 아틀라스 그리드라인은 B 측의 길이근을 근사화하여 길이7.576mm를 산출하는 데 사용됩니다. 이 정보는 측면 A의 길이를 계산하는 데 사용됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> 이 예에서, 2.03 mm는 머리가 15°로 회전할 때 광섬유 캐뉼라가 뇌로 들어가는 중간선으로부터의 R/L 거리를 나타낸다.<ol>
<li>선택적으로, D/V 좌표를 근사화하기 위해 측면 C의 길이를 계산합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> 참고: 1) 저혈압(C)의 길이는 주사의 깊이를 나타내지 않지만 D/V 좌표를 결정하는 데 도움이 되며, 이는 직선 주사의 경우 증가된 길이 대 측면 B를 수용하기 위해 조정될 필요가 있을 수 있다. 따라서 D/V 좌표를 최적화하기 위해 테스트 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 2) VMN을 대상으로 하는 이 예에서, 좌표의 두 세트가 얻어진다: 비각진(A/P = -1.4, R/L = 0°에서 0.4, D/V = -5.7) 및 각진 광섬유 이식용(A/P = -1.4, R/L=0.0)=15/D에서 0.0°되는 미세 주입을 위한 좌표가 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 각진 절차에 대한 스테레오세스 준비
<ol><li>입체 프레임과 미세 조작기가 보정되었는지 확인합니다(전체 프로토콜의 경우 Kopf 설명서 참조).</li>
	<li>헤드 홀더 베이스 플레이트의 소켓에 중앙 높이 게이지를 놓습니다.</li>
	<li>공구 홀더의 중심 범위를 확보한 다음 범위를 파악합니다. 십자선이 정렬되고 게이지 십자선에 초점을 맞출 때까지 미세 조작기의 위치를 조정합니다. 참고: 이 단계에서 범위는 헤드 홀더의 회전 중심의 초점 평면에 위치되고 있습니다. 일단 확립되면, 마이크로 조작기는 나머지 단계 동안 이동해서는 안됩니다.</li>
	<li>이어바를 홀더에 넣고 양쪽의 표시선이0(그림 3A)에있도록 중앙에 놓습니다.</li>
	<li>헤드홀더(그림 2)에내측 측면 및 전방 후방 손잡이를 사용하여 중심 높이 게이지(그림3A)의십자선 위에 x-및 y-평면의 귀 바를 중앙정렬한다.</li>
	<li>z축의 이어 바 위치를 정렬하려면 홀더에서 이어 바를 제거하고 중앙 높이 게이지를 제거합니다. 이어 바를 교체하고 0에서 다시 중앙에 표시합니다.</li>
	<li>범위를 내려다 볼 수 있습니다. 수직 시프트 노브(도3B)와관상 기울기 노브를 사용하여, 교차체가 관상 회전 전반에 걸쳐 이어 바 사이에 중앙으로 유지될 때까지 이어바를 낮추고 회전한다.</li>
	<li>이제 스테레오탁이 보정되고 준비되었습니다. 헤드 홀더의 위치를 더 이상 조정하지 마십시오.</li>
</ol>3. 사출/이식용 재료 준비
<ol><li>모든 기기, 수술 도구 및 재료가 멸균되어 스테레오탁스 옆에 멸균 수술장에 배치되도록 하십시오.</li>
	<li>생물 안전 수준 및 관련 기관 생물 안전 규제 요구 사항에 따라 바이러스 성 구조를 처리하고 저장합니다.</li>
	<li>적절한 취급 관행과 개인 보호 장비를 사용하는 데 주의를 기울여 주사기에 바이러스를 그립니다.</li>
</ol>4. 마취
<ol><li>수술 전에 마우스의 체중을 기록합니다.</li>
	<li>이소플루란을 사용하여 마우스를 심히 마취합니다.</li>
	<li>플린칭 응답이 없을 때까지 발가락 핀치 테스트를 수행하여 마우스가 심히 마취되었는지 확인합니다. 동물이 강한 반사 신경을 계속 표시하는 경우, 마취의 농도 및 / 또는 기간을 증가.</li>
	<li>각 눈에 눈 연고를 바르면 수술 중에 촉촉하게 유지하십시오.</li>
	<li>두피를 귀 뒤에서 머리 깎아 눈 바로 뒤로 면도합니다.</li>
	<li>IACUC 승인 진통제와 마우스를 제공합니다.</li>
	<li>수술 시술 전반에 걸쳐 동물을 지속적으로 모니터링하고 열 지원을 제공합니다.</li>
</ol>5. 외과 적 절차
<ol><li>상단 절개를 물린 막대의 틈새에 놓고 혀가 물린 바 아래에 있는지 확인하여 머리 홀더에 넣습니다.</li>
	<li>이어바를 외부 청각 육류에 부드럽게 삽입하여 이어바를 고정하여 이어바가 대칭적으로 배치되도록 합니다(일반적으로 성인 마우스의 경우 3~4개). 이 단계는 헤드가 안정적이고 회전중심이 되도록 하는 데 매우 중요합니다.</li>
	<li>부시적으로 베타딘과 알코올 면봉의 세 번갈아 스크럽으로 면도 절개 영역을 준비하거나, 또는 다른 제도적으로 승인 된 수술 부위 준비.</li>
	<li>멸균 수술장을 유지하고 수술 후 감염의 위험을 줄이기 위해 동물 위에 외과 커튼을 놓습니다.</li>
	<li>두피의 처상 중간선을 따라 절개를 함으로써 두개골을 노출시합니다. 두개골 표면을 부드럽게 긁어 내어 근막을 제거하고 봉합사를 노출시합니다. 참고: 봉합선이 시각화하기 어려운 경우, 과산화수소는 봉합물 시각화를 개선하기 위해 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골에 적용될 수 있습니다.</li>
	<li>중앙 범위를 홀더에 배치하고 bregma(그림 4,왼쪽 패널)에 십자선을 중심으로합니다. 마이크로 조작기제로.</li>
	<li>십자선을 람다로 옮기고, 브레그마 람다(B-L) 거리를 주목한다. 참고: 봉합사 선이 미드라인을 따라 직선을 따라가지 않는 경우, 브레그마와 람다를 통해 "가장 적합한 라인"을 사용하여 미드라인을 설정하는 것이 좋습니다. 그러나 위의 단계를 따르는 경우, 범위 망상의 초기 배치는 이어 바 사이의 중간이어야하며 B-L 중간 선 봉합사에 밀접하게 근사해야합니다.</li>
	<li>B-L 거리가 4.21mm보다 훨씬 적거나 큰 경우 할당된 브레그마를 점진적으로 조정하여 0.2mm의 B-L 거리를 ±.</li>
	<li>중심 범위를 정렬 표시기로 바꿉다. 람다와 브레그마에 프로브를 놓고 머리 홀더의 등지 기울기 손잡이를 위 또는 아래로 향하는 코의 수준으로 조정한 다음 중심 범위를 사용하여 bregma를 다시 할당합니다.</li>
	<li>관상 기울기 손잡이를 사용하여 관상 평면의 레벨에 정렬 표시기를 사용합니다. 두개골의 표면 변형을 고려하여 장막/소달 축 전체의 여러 지점에서 측정합니다.</li>
	<li>관상 기울기 손잡이의 다이얼의 위치를 참고하십시오.</li>
</ol>6. 각진 좌표에 대한 회전의 중앙 축 정렬
<ol><li>공구 홀더의 중심 범위를 보호하고 마이크로 조작기를 섹션 1에서 계산된 좌표에 배치합니다. 각진 이식에 대한 R/L 좌표는 측면 A의 길이에 해당합니다.<ol>
<li>도 1의예에서, VMN을 대상으로 하는 광섬유 배치에 대한 각진 좌표는 (0° 코로날 회전에서 A/P = -1.4, R/L = [2.03], [0.00] 15° 관상 회전, D/V = -5.4)이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>범위를 아래로 보고이 좌표를 표시 (VMN 예당 중간라인에서 R / L 2.03 mm; 그림 4,중간 패널). 이 표시는 머리가 회전하면 캐뉼라가 뇌에 들어가는 지점을 나타냅니다.</li>
	<li>중간선(R/L = 0.00)을 통해 미세 조작기 재배치. 관상 기울기 손잡이를 사용하여 1절에서 계산된 각도로 머리를 회전시합니다.<ol>
<li>스코프 십자선이 이미 마크와 정렬된 경우 섹션 7로 진행합니다.</li>
		<li>스코프 십자선이 기준마크와 일치하지 않는 경우, 십자선이 마크에 가능한 한 가까이 줄 때까지 수직 시프트 노브(도2)를사용하여 z축의 헤드 위치를 조정한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>머리를 0° 관상 위치로 다시 회전합니다. 수직 시프트가 6.3 단계에서 조정된 경우 중심 범위를 사용하여 bregma를 다시 할당합니다.</li>
	<li>십자선이 머리회전 시 기준마크에 일관되게 부딪힐 때까지 6.3 및 6.4단계를 반복한다(도4C).</li>
	<li>이 시점에서 섹션 1에 설정된 임의회전 지점이 이제 회전의 고정체 중심과 정렬되어야 합니다.</li>
</ol>7. 미세 주입
<ol><li>고정 관념 드릴을 홀더에 놓고 마이크로 조작기를 첫 번째 사출 좌표로 기동합니다.<ol>
<li>VMN을 대상으로 하는 예에 따라, 헤드가 레벨인 동안 A/P = -1.4 및 R/L = 0.4에서 드릴한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>비트가 두개골 바로 위에 될 때까지 드릴을 낮춥다. 드릴을 켜고, 비트가 두개골을 뚫을 때까지 부드럽게 낮춥니다(두라가 아님).</li>
	<li>금단사 주입 부위에 대해 반복하십시오.</li>
	<li>멸균 바늘 드라이버를 사용하여 27-30G 바늘 (예 : 멸균 0.5 mL 인슐린 주사기)에 90 ° 굽힘을 도입하고 구부러진 바늘을 사용하여 듀라 마터를 부드럽게 찌릅니다.</li>
	<li>참고: 출혈이 발생하면 멸균 면 팁 어플리케이터로 압력을 가하고 출혈이 멈출 때까지 멸균물로 청소하십시오.</li>
	<li>주입 할 준비가되면, 신중하게 스테레오 테틱 홀더에 채워진 해밀턴 주사기를 배치합니다. 참고: 새 도구로 전환한 후 마이크로 조작기의 좌표가 더 이상 적용되지 않습니다. 버 구멍의 중심을 주입을 위한 새 대상으로 사용하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 버 구멍 위에 바늘을 배치합니다.</li>
	<li>바늘이 버 구멍의 중앙 에 있는 두라에 약간 닿을 때까지 낮춥습니다. 중요: 고정관 중심 범위 및 드릴에 대한 미세 조작기의 좌표가 유지되는 등 z축에서만 미세 조작기제로 고정됩니다.</li>
	<li>바늘을 천천히 뇌로 낮추고 바늘이 버 구멍 가장자리에서 빗가지 않도록 면밀히 관찰합니다. D/V 사출 좌표에 0.05mm 복부까지 계속 낮추고 1분 기다립니다. 이 추가 단계는 바늘 제거에 바이러스 성 역류를 최소화하기 위해 작은 "포켓"을 만듭니다.</li>
	<li>천천히 바늘을 D/V 좌표로 올리고 주사를 시작합니다. 참고: 유량과 부피는 대상 영역 및 실험 설계에 따라 달라집니다. VMN 뉴런의 광유전학 침묵의 경우 충분한 커버리지가 필요하므로 200 nL의 바이러스가 1 nL/s의 속도로 주입됩니다.</li>
	<li>마이크로 주입 다음, 철수 하는 동안 바이러스의 efflux를 최소화 하는 주사 사이트에서 10 분 기다립니다.</li>
	<li>천천히 1mm / 분의 대략적인 속도로 뇌에서 마이크로 파이펫을 철회.</li>
	<li>바늘이 두개골이 맑으면 바늘이 혈액이나 조직으로 막히지 않도록 소량의 바이러스를 배출하십시오. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 바이러스를 제거하기 전에 계속하십시오.</li>
	<li>반복 단계 7.6-7.12 에 대한 모순 측.</li>
	<li>치유를 개선하기 위해 뼈 왁스로 미세 주입 버 구멍을 밀봉(그림 5B).</li>
</ol>8. 광섬유 이식
참고: 바이러스 주사 후, 양측 광섬유 카누아섹션 1당 계산된 각도로 이식됩니다. 이러한 좌표는 이미 섹션 6의 두개골에 표시되어야 합니다.
<ol><li>각진 좌표에 대해 7.1 ~7.4 단계를 반복합니다.</li>
	<li>머리를 레벨 0° 위치로 되돌려 놓습니다.</li>
	<li>다음으로, 손 드릴을 사용하여 뼈 나사에 대한 4개의 추가 구멍을 생성합니다: 2개는 전방으로 배치되어야 하고 2개의후방(그림 5A). 이들은 두개골에 광섬유를 부착하는 앵커 역할을합니다(그림 5D). 참고: 두개골 위에 있는 광섬유의 발효 부분을 수용할 수 있도록 각진 좌표 버 구멍에서 멀리 떨어진 구멍을 공간화해야 합니다.</li>
	<li>가능한 한 부드럽게 작은 플랫 헤드 드라이버를 사용하여 두개골에 단단히 앉아 있지만 뇌를 관통하지 않도록 뼈 나사를 설정합니다.</li>
	<li>광섬유 캐뉼라를 캐뉼라 홀더에 고정하여 스테레오테틱 홀더에 넣습니다.</li>
	<li>계산된 각도로 머리를 회전하여 마이크로 조작기의 좌표가 새 도구에 적용되지 않는다는 점을 다시 지적합니다. 각진 버 구멍의 중심을 이식 대상으로 사용한다.</li>
	<li>버홀(그림 5C)의중앙 내의 두라에 닿을 때까지 광섬유를 낮춥니다. z축에서 마이크로조작기를 0으로 만든 다음 광섬유를 D/V 각진 좌표로 천천히 느리게 합니다(VMN 예제당-5.4).</li>
	<li>시아노아크레이트 젤을 사용하여 광섬유 퍼룰을 ipsilateral 앵커 나사에 연결한 다음 마이크로 피펫팁(그림 5D)으로가속을 적용합니다.</li>
	<li>시아노아크라일트 젤이 완전히 강화되면 캐뉼라 홀더를 부드럽게 풀고 광섬유 발효가 제거될 때까지 올립니다.</li>
	<li>반대로 각진 좌표에 대해 8.5-8.9 단계를 반복한 다음 머리를 평평하게 합니다. 추가 보안을 위해, 시아노아크레이트 젤과 가속제(도5D)와두 각진 광섬유 캐뉼라 를 추가로 연결한다.</li>
	<li>작고 상대적으로 얇은 양의 치과 시멘트를 준비하십시오. 두개골 표면에 바르면 광섬유 캐뉼라의 앵커 나사와 베이스를 철저히 덮으십시오. 광섬유 패치 케이블과의 후속 결합을 위해 퍼룰을 충분히 깨끗하게 유지합니다.</li>
	<li>시멘트가 건조 완료되면, 스테레오 전술 장치에서 마우스를 제거합니다.</li>
	<li>열 지지가 있는 복구 케이지에 마우스를 배치합니다. 복구하고 경고, 모바일, 손질되면 홈 케이지로 전송 할 수 있습니다.</li>
</ol>9. 수술 후 치료
<ol><li>행동, 자세, 활동 및 그루밍을 위해 수술 후 3 일 동안 매일 동물을 모니터링하고 음식 섭취량과 체중기록을 보관하십시오.</li>
	<li>동물이 통증이나 건강이 좋지 않은 일반적인 지표를 나타내는 경우 수의사 서비스와 상의하십시오.</li>
	<li>마우스를 적어도 허용 2 복구 및 행동 연구를 시작 하기 전에 바이러스 성 발현에 대 한 주.</li>
</ol>10. 광유전학
<ol><li>광유전학 연구의 성능을 위해, Sidor 외.8을참조하십시오.</li>
	<li>연구 완료 시 바이러스 성 발현 및 섬유 배치를 검증합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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신경 과학의 최근 발전은 뇌 신경 회로의 활동과 기능에 대한 고급 통찰력과 이해를 지원했습니다. 이것은 생체 내의 이산 신경 인구 및 그들의 투영 사이트를 활성화하거나 침묵하기 위하여 optogenetic 및 화학 유전학 기술의 응용을 포함합니다. 최근에는 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(예를 들어, GCaMP, RCaMP) 및 기타 불소 측정 생체 센서(예: 도파민, 노르에피네프린)의 개발을 포함하고 있으며, 자유롭게 움직이는 동물의 정의된 세포 유형에서 신경 활성을 생체 내에서 기록하는 데 포함되어 있다. 그러나 이러한 기술의 효과적인 고용은 관심 영역을 대상으로 성공적인 입체 수술에 의존합니다. 많은 두뇌 지구를 표적으로 하는 데 적합한 이러한 방법을 설명하는 몇몇 확립된 프로토콜이 있는 동안, 중간선을 따라 깊은 두뇌 지구를 표적으로 하는 것은 중요한 추가 도전을 나타냅니다. 여기에 입증 각도 입체 접근 방식을 통해 이산 뇌 영역을 대상으로 상세한 수술 기술입니다. 중요한 것은, 이 기술은 적응하고 신경 과학 기술의 다양한...

행동, 먹이 주기 및 신진 대사의 신경 제어는 매우 복잡 한의 조정을 포함, 통합, 그리고 중복 신경 회로. 신경 과학 분야의 운전 목표는 신경 회로 구조와 기능 사이의 관계를 해부하는 것입니다. 고전적인 신경 과학 도구 (즉, 병변, 국소 약리학적 주사 및 전기 자극)는 행동과 신진 대사를 제어하는 특정 뇌 영역의 역할에 관한 중요한 지식을 발견했지만, 이러한 도구는 특이성과 가역성의 부족에 의해 제한됩니다1.
신경 과학 분야의 최근 발전은 높은 현시성 해상도를 가진 세포 형 특정 방식으로 회로 기능을 심문하고 조작하는 능력을 크게 향상했습니다. 변성2 및 화학 유전학3 접근은, 예를 들면, 자유롭게 움직이는 동물의 유전으로 정의된 세포 모형에 있는 활동의 급속하고 가역적인 조작을 허용합니다. 광유전학은 신경 활동을 통제하기 위하여, 관상자극증이라고 칭한 광과민이온 채널의 사용을 관련시킵니다. 이 기술의 핵심은 채널로독신의 유전자 전달과 opsin을 활성화하는 빛의 원천입니다. 유전자 전달을 위한 일반적인 전략은 1) 유전자 조작 마우스의 조합을 통해 이산 뉴런에서 Cre-recombinase를 발현하고, 2) 채널로독신을 코딩하는 Cre-의존하는 바이러스 벡터.
광유전학은 신경 활동을 제어하는 우아하고 매우 정밀한 수단을 제공하지만, 이 방법은 정의된 뇌 부위로 바이러스 벡터 및 광섬유 배치의 성공적인 입체 미세 주입에 달려 있습니다. 입체적 절차는 현대 신경과학 실험실 내에서 흔히 볼 수 있지만 (그리고 이 절차를 설명하는 몇몇 우수한 프로토콜이 있다)4,5,6,미드라인을 따라 이산 뇌 영역을 일관되고 재현적으로 표적으로 할 수 있는 (즉, 내분비 시상 하부, 홈 모성 기능의 조절에 중요한 뇌 영역7)추가 과제를 제시한다. 이 도전은 우수한 처상 부비동, 제 3 심실 및 인접한 시상하믹 핵의 피하는 것을 포함합니다. 또한, 억제 연구에 필요한 하드웨어의 양자 이식에 상당한 공간 적 한계가 있다. 이러한 과제를 염두에 두고, 본 원에서 이 프로토콜은 각진 입체적 접근법을 통해 이산 뇌 영역을 대상으로 하는 수정 가능한 절차를 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>광섬유 캐뉼라</td><td>Doric 렌즈</td><td>MFC_200/230-0.57_#_MF1.25_FLT</td><td>사용자 정의</td></tr><tr><td>가능한 Kopf 모델 1900 입체 정렬 시스템</td><td>Kopf</td><td>모델 1900</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 모델 1900-51 중심 높이 게이지</td><td>Kopf</td><td>모델 1900-51</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 모델 1905 정렬 표시기</td><td>Kopf</td><td>모델 1905</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 모델 1911 입체 드릴</td><td>Kopf</td><td>모델 1911</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 모델 1915 센터링 스코프</td><td>Kopf</td><td>모델 1915</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 모델 1922 60도 비파열 이어바</td><td>Kopf</td><td>모델 1922</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 모델 1923-B 마우스 가스 마취 헤드 홀더</td><td>Kopf</td><td>모델 1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 모델 1940 마이크로 매니퓰레이터</td><td>Kopf</td><td>모델 1940</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microinjection System</td><td>World Precision Instruments</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>마우스 뼈 나사</td><td>플라스틱 1개</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>입체식 캐뉼라 홀더, 1.25mm 페룰</td><td>Thor Labs</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td>수술용 드릴</td><td>셀 포인트 과학적</td><td>이상적인 마이크로 드릴</td><td></td></tr></tbody></table>

다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

입체 수술은 현대 신경 과학 실험실에서 필수적인 도구입니다. 그러나 도달하기 어려운 뇌 영역을 정확하고 정확하게 표적으로 삼는 능력은 여전히 어려움을 겪고 있으며, 특히 미드라인을 따라 뇌 구조를 대상으로 할 때 더욱 그렇다. 이 도전은 우수한 처상 부비동과 세 번째 심실의 피하고 일관되게 선택적이고 이산적인 두뇌 핵을 표적으로 하는 기능을 포함합니다. 또한, 보다 진보된 신경과학 기술(예를 들어, 광유전학, 광섬유 광측정, 2광화상)은 뇌에 중요한 하드웨어의 표적 이식에 의존하고 있으며, 공간적 한계는 일반적인 장애물이다. 여기에 제시된 각진 관상 접근 방식을 사용하여 설치류 뇌 구조물의 입체 적 표적을 위한 수정 가능한 프로토콜이 있습니다. 그것은 1) 마우스 또는 쥐 모델, 2) 다양한 신경 과학 기술, 및 3) 여러 뇌 영역에 적응 할 수있다. 대표적인 예로, 광유전학억제실험을 위한 마우스 시상하부 환원핵(VMN)의 표적화를 위한 스테레오전술 좌표의 계산을 포함한다. 이 절차는 광에 민감한 염화물 채널(SwiChR+++)을 크레의존 마우스 모델에 인코딩한 아데노 관련 바이러스(AAV)의 양자 간 미세 주입으로 시작하여 광섬유 캐뉼라의 각진 양자 이식이 뒤따릅니다. 이 접근법을 사용하여, 사실 인정은 인슐린 유도한 저혈당에 대한 포도당 반규제 반응을 위해 VMN 뉴런의 서브세트의 활성화가 필요하다는 것을 보여줍니다.

이 프로토콜은 혈당 조절9에서시상 하 부 VMN 뉴런의 역할을 심문하기 위한 광유전학 연구를 수행하기위한 외과 적 절차를 설명합니다. 먼저 활용된 것은 VMN에 대한 억제 채널로도신 바이러스의 양자 미세 주입을 위한 표준(비각각) 입체적 접근법이었다. 각진 접근법도 적합하지만, 관심 있는 뇌 영역을 대상으로 하기에 충분하고 쉽고 신뢰할 수 있고 일관된 접근 방식이기 때문에 표준(비각각) 접근법이 선택되었습니다. 그러나, VMN이 중공선에 근접한 점을 감안할 때, 공간 제약은 양측 광섬유의 비각각 이식을 허용하지 않았고, 광섬유를 각도로 정확하게 이식하기 위한 외과 전략의 개발이 필요하였다(그림6).
이 외과 전략을 사용하여, 우리는 "SwiChR ++" 바이러스10이라고칭한 변형된 채널로 도프신 애니온 전도 채널을 표현하는 Cre 의존AAV를...

여기에 설명된 것은 각진 관상 접근 법을 사용하여 도전적이고 도달하기 어려운 뇌 영역(공간 제한으로 인해)을 표적으로 할 수 있는 입체적 절차입니다. 이 프로토콜은 마우스와 쥐 모델에 모두 적응할 수 있으며, 바이러스 구조의 캐뉼라 이식 및 미세 주입을 포함하여 다양한 신경 과학 응용 분야에 적용 될 수있다.

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

이 프로토콜은 생쥐와 쥐 모두에 사용할 수 있는 적응 가능한 정위 절차이며 많은 새로운 신경 과학 기술에 적용할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 적응형 정위 절차의 주요 장점은 까다롭고 접근하기 어려운 뇌 영역을 표적으로 삼는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 젊고 재능 있는 박사 후 연구원인 Chelsea Faber입니다.프레임과 미세 조작기가 보정되었는지 확인한 후 중심 높이 게이지를 헤드 홀더 베이스 플레이트의 소켓에 놓습니다. 도구 홀더에 센터링 스코프를 고정하고 스코프를 내려다봅니다. 십자선이 정렬되고 게이지 십자선에 초점이 맞춰질 때까지 마이크로 매니퓰레이터의 위치를 조정하고 양쪽의 표시선이 0이 되도록 이어바를 홀더에 배치합니다.헤드 홀더의 내측 및 전방-후방 손잡이를 사용하여 중앙 높이 게이지의 십자선 위에 있는 X 및 Y 평면의 이어바 중심선을 그립니다. Z축에서 이어바 위치를 정렬하려면 홀더에서 이어바를 제거하고 중앙 높이 게이지를 제거합니다. 그런 다음 이어바를 교체하고 바를 0으로 다시 중앙에 놓습니다.그런 다음 다시 스코프를 내려다보고 수직 이동 및 코로나 기울기 손잡이를 각각 사용하여 코로나 회전 동안 스코프 십자선이 이어바 사이의 중앙에 유지될 때까지 이어바를 내리고 회전합니다. 각진 좌표에 대해 중심 회전축을 정렬하려면 도구 홀더에 센터링 스코프를 고정하고 마이크로 매니퓰레이터를 계산된 좌표에 배치합니다. 각진 이식의 오른쪽/왼쪽 좌표는 측면 A의 길이에 해당합니다.내시경을 내려다보고 이 좌표를 표시하여 머리가 회전하면 캐뉼라가 뇌로 들어가는 지점을 나타냅니다.마이크로 매니퓰레이터를 정중선 위로 재배치하고 코로나 틸트 노브를 사용하여 헤드를 계산된 각도로 회전합니다. 스코프 십자선이 참조 표시와 정렬되지 않으면 수직 이동 노브를 사용하여 십자선이 표시에 최대한 가깝게 정렬될 때까지 Z축의 헤드 위치를 조정합니다. 이 시점에서 임의의 회전 지점은 스테레오택스의 회전 중심과 정렬되어야 합니다.후속 드릴링 및 미세주입 단계를 진행하기 전에 헤드를 다시 0도 코로나 위치로 회전합니다. 미세 주입을 수행한 후 머리를 0도 수준 위치로 되돌리고 핸드 드릴을 사용하여 두개골 위에 있는 광섬유의 페룰 부분을 수용할 수 있도록 각진 좌표 버 구멍에서 충분히 멀리 앞쪽으로 두 개의 구멍을 배치하고 뒤쪽으로 두 개의 구멍을 배치합니다. 모든 구멍이 뚫렸으면 작은 일자 드라이버를 사용하여 뼈 나사가 뇌를 관통하지 않고 두개골에 단단히 고정되도록 가능한 한 부드럽게 삽입합니다.Clamp 광섬유 캐뉼러를 캐뉼라 홀더에 넣고 캐뉼라 홀더를 도구 홀더에 놓습니다. 계산된 각도로 헤드를 회전하되 미세 조작기의 좌표가 새 도구에 적용되지 않는지 확인합니다. 각진 버 구멍의 중심을 이식 대상으로 사용합니다.버 구멍의 중심 안에 있는 경파에 닿을 때까지 광섬유를 낮추고 Z축의 마이크로 매니퓰레이터를 영점으로 만듭니다. 광섬유를 등쪽 복부 각도 좌표로 천천히 내린 다음 시아노아크릴레이트 젤을 사용하여 광섬유 페룰을 동측 앵커 나사에 연결합니다. 마이크로피펫 팁을 사용하여 촉진제를 도포합니다.젤이 완전히 굳으면 페룰이 제거될 때까지 캐뉼라 홀더를 부드럽게 풀고 올립니다. 두 번째 광섬유를 반대쪽 각도 좌표에 이식한 다음 머리를 수평으로 합니다. 추가 보안을 위해 시아노아크릴레이트 젤과 촉진제를 사용하여 두 개의 각진 광섬유 캐뉼러 사이에 추가 연결을 만들고 앵커 나사와 광섬유 캐뉼라의 바닥을 철저히 덮도록 주의하면서 두개골 표면에 소량의 비교적 얇은 치과 시멘트를 적용합니다.혈당 조절에서 시상하부 복내측 핵 뉴런의 역할을 조사하기 위해 이 대표적인 분석에서는 억제 채널 로돕신 바이러스를 복내측핵에 양측 미세주입하기 위해 표준적이고 각이 없는 정위 접근법을 사용했습니다. 복내측핵(ventromedial nucleus)이 정중선(midline)에 근접해 있다는 점을 감안할 때, 공간 제약으로 인해 양측 광섬유의 비각형 이식이 불가능했기 때문에 광섬유를 비스듬히 정밀하게 이식하기 위한 수술 전략을 개발해야 했습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 좌표 할당을 일관되고 정확하게 수행하는 것이 성공에 매우 중요하므로 인내심을 갖고 시간을 들이는 것입니다.이 절차는 화학유전학, 광유전학 및 섬유 측광 접근법을 포함하여 설치류 뇌에 미세 주입 또는 이식이 필요한 모든 신경과학적 방법에 적용되고 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

(드릴 제외) 약 $ 1,000 정위 악기, (CNC 제어 컴퓨터의 숫자)이 프로토콜은 디자인과 로봇으로 기존의 정위 장비를 업그레이드하는 데 필요한 소프트웨어가 포함되어 있습니다.

오픈 소스 로봇 정위 장비 구축

이 방법은 탐색 및 동물의 머리의 확고한 고정을 필요로 미세한 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹음하는 동안 탐험하는 마우스 유형, 친숙한 환경을 만듭니다.

평면 바닥의 공기 해제 플랫폼 : 새로운 방법이 깨어에 현미경 또는 전기 생리학과 행동을 결합하여 자유롭게 설치류 이동

정위 뇌파 (SEEG)은 발작 초점을 현지화하기 위해 간질 수술에 사용되는 수술 방법이다. 또한 뇌 기능을 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공한다. 여기에서 우리는 SEEG 인간을 대상으로인지 과정을 조사하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

정위 뇌파를 사용하여 깊은 피질의 기능 및 피질 하 구조 조사 : 전방에 cingulate 피질 수업

무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

SEEG 방법론은 정위 로봇으로 단순화되고 더 빨라집니다. 수술실에서 로봇을 사용하기 전에 수술 전 체적 MRI를 환자에게 등록하는 데 세심한 주의를 기울여야 합니다. 로봇은 절차를 간소화하여 수술 시간을 줄이고 정확한 이식을 가능하게 합니다.

로봇 정위 유도 시스템을 활용한 입체뇌파(SEEG) 방법론에 대한 수술 기술 및 뉘앙스

혈액-뇌 장벽 (BBB) 일시적으로 마이크로 버블 매개 집중 초음파로 중단 될 수 있습니다 (FUS). 여기서는 비초음파 전문가가 액세스할 수 있는 모듈식 FUS 시스템을 사용하여 생체 내 고처리량 BBB 개방을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

설치류의 혈액 뇌 장벽 개방을 위한 고처리량 이미지 유도 입체 신경 탐색 및 집중 초음파 시스템

이 프로토콜은 집속 초음파 혈액 뇌 장벽(BBB) 개방, 결과 유전자 발현 평가 및 조직학적 검사를 통한 화학 유전 수용체의 신경 조절 활성 측정을 통해 유전자 전달에 필요한 단계를 설명합니다.

뇌 구조를 표적으로 삼고 화학 유전 학적 신경 조절을 평가하기위한 집중 초음파 유도 혈액 뇌 장벽 개방

여기에 제시된 프로토콜은 실시간 자기 공명 영상 (MRI) 시각화 안내 및 실시간 주입 분포 시각화와 함께 대류 강화 주입을 사용하여 돼지 뇌에 대한 입체 택시를 보여줍니다.

돼지 뇌에 주입하기위한 자기 공명 유도 스테레오 택시

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

이 프로토콜은 기능적 자기 공명 영상(fMRI) 중에 투여되는 국소 경두개 직류 자극(tDCS)을 위한 신경 탐색 전극 배치 방법을 설명합니다.

Neuronavigated Focalized Transcranial Direct Current Stimulation Administered During Functional Magnetic Resonance Imaging

학습하세요 쥐와 쥐 모델에서 어려운 뇌 영역을 정밀하게 표적화하는 각진 입체 적 수술 기법을 통해 신경 과학 연구를 향상시키는 방법을. 이 프로토콜은 캐뉼라 이식 및 바이러스 미세주입에 적용 가능합니다.

다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법

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