다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법

이 프로토콜은 생쥐와 쥐 모두에 사용할 수 있는 적응 가능한 정위 절차이며 많은 새로운 신경 과학 기술에 적용할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 적응형 정위 절차의 주요 장점은 까다롭고 접근하기 어려운 뇌 영역을 표적으로 삼는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 젊고 재능 있는 박사 후 연구원인 Chelsea Faber입니다.

프레임과 미세 조작기가 보정되었는지 확인한 후 중심 높이 게이지를 헤드 홀더 베이스 플레이트의 소켓에 놓습니다. 도구 홀더에 센터링 스코프를 고정하고 스코프를 내려다봅니다. 십자선이 정렬되고 게이지 십자선에 초점이 맞춰질 때까지 마이크로 매니퓰레이터의 위치를 조정하고 양쪽의 표시선이 0이 되도록 이어바를 홀더에 배치합니다.

헤드 홀더의 내측 및 전방-후방 손잡이를 사용하여 중앙 높이 게이지의 십자선 위에 있는 X 및 Y 평면의 이어바 중심선을 그립니다. Z축에서 이어바 위치를 정렬하려면 홀더에서 이어바를 제거하고 중앙 높이 게이지를 제거합니다. 그런 다음 이어바를 교체하고 바를 0으로 다시 중앙에 놓습니다.

그런 다음 다시 스코프를 내려다보고 수직 이동 및 코로나 기울기 손잡이를 각각 사용하여 코로나 회전 동안 스코프 십자선이 이어바 사이의 중앙에 유지될 때까지 이어바를 내리고 회전합니다. 각진 좌표에 대해 중심 회전축을 정렬하려면 도구 홀더에 센터링 스코프를 고정하고 마이크로 매니퓰레이터를 계산된 좌표에 배치합니다. 각진 이식의 오른쪽/왼쪽 좌표는 측면 A의 길이에 해당합니다.내시경을 내려다보고 이 좌표를 표시하여 머리가 회전하면 캐뉼라가 뇌로 들어가는 지점을 나타냅니다.

마이크로 매니퓰레이터를 정중선 위로 재배치하고 코로나 틸트 노브를 사용하여 헤드를 계산된 각도로 회전합니다. 스코프 십자선이 참조 표시와 정렬되지 않으면 수직 이동 노브를 사용하여 십자선이 표시에 최대한 가깝게 정렬될 때까지 Z축의 헤드 위치를 조정합니다. 이 시점에서 임의의 회전 지점은 스테레오택스의 회전 중심과 정렬되어야 합니다.

후속 드릴링 및 미세주입 단계를 진행하기 전에 헤드를 다시 0도 코로나 위치로 회전합니다. 미세 주입을 수행한 후 머리를 0도 수준 위치로 되돌리고 핸드 드릴을 사용하여 두개골 위에 있는 광섬유의 페룰 부분을 수용할 수 있도록 각진 좌표 버 구멍에서 충분히 멀리 앞쪽으로 두 개의 구멍을 배치하고 뒤쪽으로 두 개의 구멍을 배치합니다. 모든 구멍이 뚫렸으면 작은 일자 드라이버를 사용하여 뼈 나사가 뇌를 관통하지 않고 두개골에 단단히 고정되도록 가능한 한 부드럽게 삽입합니다.

Clamp 광섬유 캐뉼러를 캐뉼라 홀더에 넣고 캐뉼라 홀더를 도구 홀더에 놓습니다. 계산된 각도로 헤드를 회전하되 미세 조작기의 좌표가 새 도구에 적용되지 않는지 확인합니다. 각진 버 구멍의 중심을 이식 대상으로 사용합니다.

버 구멍의 중심 안에 있는 경파에 닿을 때까지 광섬유를 낮추고 Z축의 마이크로 매니퓰레이터를 영점으로 만듭니다. 광섬유를 등쪽 복부 각도 좌표로 천천히 내린 다음 시아노아크릴레이트 젤을 사용하여 광섬유 페룰을 동측 앵커 나사에 연결합니다. 마이크로피펫 팁을 사용하여 촉진제를 도포합니다.

젤이 완전히 굳으면 페룰이 제거될 때까지 캐뉼라 홀더를 부드럽게 풀고 올립니다. 두 번째 광섬유를 반대쪽 각도 좌표에 이식한 다음 머리를 수평으로 합니다. 추가 보안을 위해 시아노아크릴레이트 젤과 촉진제를 사용하여 두 개의 각진 광섬유 캐뉼러 사이에 추가 연결을 만들고 앵커 나사와 광섬유 캐뉼라의 바닥을 철저히 덮도록 주의하면서 두개골 표면에 소량의 비교적 얇은 치과 시멘트를 적용합니다.

혈당 조절에서 시상하부 복내측 핵 뉴런의 역할을 조사하기 위해 이 대표적인 분석에서는 억제 채널 로돕신 바이러스를 복내측핵에 양측 미세주입하기 위해 표준적이고 각이 없는 정위 접근법을 사용했습니다. 복내측핵(ventromedial nucleus)이 정중선(midline)에 근접해 있다는 점을 감안할 때, 공간 제약으로 인해 양측 광섬유의 비각형 이식이 불가능했기 때문에 광섬유를 비스듬히 정밀하게 이식하기 위한 수술 전략을 개발해야 했습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 좌표 할당을 일관되고 정확하게 수행하는 것이 성공에 매우 중요하므로 인내심을 갖고 시간을 들이는 것입니다.

이 절차는 화학유전학, 광유전학 및 섬유 측광 접근법을 포함하여 설치류 뇌에 미세 주입 또는 이식이 필요한 모든 신경과학적 방법에 적용되고 적용될 수 있습니다.