Name: 뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 채택 전송 방법으로 골수 이동과 IgM 생산을 분석하는 면역학 연구 기법입니다. 이 프로토콜은 유전자 치료 잠재력을 평가하는 데 활용됩니다.

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이 작업은 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL055798의 프로젝트 3, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) 및 R01GM100776 (T.P. 벤더)에 의해 지원되었습니다. A. 우파디는 미국 심장 협회 전 박사 펠로우십 16PRE30300002 및 5T32AI007496-20의 지원을 받았습니다. 우리는 그들의 우수한 기술 지원을 위한 버지니아 흐름 세포 분석 코어의 대학에서 조앤 라니건, 마이크 솔가, 클로드 츄에게 감사드립니다.

모든 동물 프로토콜은 버지니아 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 자성 분리 및 각막 B-1 세포의 농축
<ol><li>CO2를사용하여 12-14 주 된, 남성, CD45.1+ApoE-/- 마우스를 안락사 .</li>
	<li>직선 수술 가위를 사용하여 복부에 피상적 인 컷을 확인하고 복막 벽을 노출 곡선 가위를 사용하여 다시 피부를 껍질. 10 mL 주사기 및 25 G 바늘을 사용하여 37 °C RPMI-1640 배지의 10 mL로 복강을 플러시합니다. 꼬리를 잡고 15-20s에 대한 철저하게 옆으로 마우스를 이동하여 세포를 분리하기 위해 마우스를 흔들어. 참고: 용암된 맥티노름을 마사지하면 세포 회복을 극대화할 수 있습니다.</li>
	<li>10 mL 주사기와 25 G 바늘을 사용하여 후막 유체를 수집하여 내장 근처의 엉덩이 수준 바로 위의 후막 의 오른쪽 하단에 유체를 끌어 서. 상피 지방 창고와 기본 장기를 방해하지 마십시오. 오멘탈 지방이 주사기에 쉽게 유입될 수 있기 때문에 마우스의 왼쪽에서 액체를 그리지 마십시오.</li>
	<li>6~7mL의 유체가 수집되면 얼음 위에 놓인 50 mL 원엽 튜브로 분배합니다. 다음으로, 포인을 사용하여 격막 위의 복막 벽을 잡고 마우스를 수직으로 들어 올리면 남은 유체가 복강의 바닥에 남아 있게 됩니다. 간 위의 수술 가위를 사용하여 각막 벽에 작은 컷을 만들고 (간을 절단하지 않도록하십시오) 유리 파이프와 전구를 사용하여 남아있는 각액을 수집하십시오.</li>
	<li>모든 CD45.1+ApoE-/- 마우스(n = 15−20)에서 50 mL 원뿔형 튜브로 풀 퍼미토네워시 아웃 세포를 넣고 얼음 위에 보관합니다. 참고 : 필요한 마우스의 수를 계산하기 위해 : B-1a 세포는 전체 복막 인구의 5-10 %를5 구성하고 저자의 손에 마우스 당 약 2.5-5 x 10 B-1a 세포를 산출한다. 전율 효율은 아래와 같이 ~ 30-40%입니다.</li>
	<li>트라이판 블루 및 혈세포계와 같은 생존 용염료를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다 (트리판 블루에서 샘플을 1:5로 희석하고 10 μL을 혈세포계 챔버에 로드). 튜브 당 최대 1 x 108 셀에서 풀 셀. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리세포를 흡인한 다음 흡인한다.</li>
	<li>안티 CD16/CD32항체(재료표)의1mL에 최대 1 x 108세포를 재중단하여 1:50을 분석 버퍼(1x 인산완충식염수[PBS], 0.5% 소 혈청 알부민[BSA], 2 mMEDTA)로 희석하여 수용체를 차단하였다. 셀 수에 따라 필요에 따라 배율을 조정합니다. 4 °C에서 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.</li>
	<li>고갈을 위한 분석 완충액에서 생체티니티화된항체(표 1)의2x 마스터 믹스를 준비한다. 2x 마스터 믹스는 안티 CD16/CD32로 인큐베이팅할 때 세포가 이미 있는 액체의 부피를 차지합니다. 예를 들어, 세포가 희석된 항 CD16/CD32의 500 μL에서 인큐베이팅하는 경우, 생물질화된 Ter119, Gr-1, CD23 및 NK1.1 항체의 10 μL을 포함하는 2x 마스터 믹스의 500 μL을 추가하고, Table 125 μL의 생체측F4/80 항체를 최종 농도를 달성한다. 세포에 2x 마스터 믹스를 넣고 4°C에서 20분 동안 얼룩을 제거합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 400 x g에서 5 mL의 분석 완충제 및 원심분리기를 5 mL로 세척하고 흡인상피제를 흡입한다.</li>
	<li>제조업체가 권장하는 농도 및 프로토콜에 따라 분석 버퍼로 희석된 항바이오틴 마이크로비드(Tableof Materials)로세포를 재중단 및 배양한다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 400 x g에서 5 mL의 분석 버퍼와 원심분리기를 세척합니다. 흡위제 및 분석 버퍼의 500 μL에서 최대 1 x 108 세포를 재중단한다.</li>
	<li>분석 버퍼의 3 mL와 주요 자기 선택 열(재료의 표). 프라이밍 된 자기 선택 컬럼에 세포를 전달하고 얼음에 15 mL 원엽 튜브에서 농축 된 B-1 세포를 포함하는 용리액을 수집합니다. 수집된 전체 부피가 10 mL가 될 때까지 추가분석 버퍼로 자기 선택 컬럼을 세척한다. 참고: 사전 정제 및 후 정제 된 세포 분획의 aliquot는 그림 2에도시 된 바와 같이 CD19+ B 세포, F480+ 대식세포 및 CD5+ T 세포에 대한 염색에 의해 정제 효율을 위한 유세포측정에 의해 별도로 분석되어야 한다.</li>
	<li>1.6단계에서와 같이 살아있는 세포를 계수하여 정제 후 세포 분획(농축된 B-1 세포를 함유하는 용리액)을 카운트하고, B 세포 배양 배지에서 1 x 106 세포 / mL에서 다시 중단 (RPMI-1640, 10 % 열 불활성화 태아 소 혈청 [FBS], 10 mM HEPES, 1x 비 필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루바테, 50 μg / mL 젠타미신, 55 μM-β 메르카포에탄.</li>
</ol>2. 복막 B-1 세포 자극
<ol><li>두 개의 트랜스듀싱 된 조건 (Ctl-GFP 및 CXCR4-GFP)에 대한 분할 풀화 된 세포를 따로 설정하고 비 변환 된 제어를 위해 적어도 10 x 106 셀을 도금합니다.</li>
	<li>96 웰 라운드 바닥 플레이트에 잘 당 150 μL (150,000 셀)까지 플레이트.</li>
	<li>세포 증식을 자극하기 위해 모든 우물에 100 nM TLR9 작용제 ODN1668을 추가합니다.</li>
	<li>37 °C에서 16-18 시간 동안 배양, 5 %CO2.</li>
</ol>3. 복막 B 세포의 레트로 바이러스 성 전환
<ol><li>이전에 발표된 프로토콜14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형혈을 이용한 Ctl-GFP(MigR1) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자를 생성한다. 참고 : 이것은 며칠이 걸릴 것이므로이 프로토콜을 시작하기 전에 -80 °C에서 aliquots를 준비하고 역류하여 저장하십시오.</li>
	<li>얼음에 레트로 바이러스 주식을 해동. 즉시 사용하고 동결 해동 주기 동안 바이러스 적재자가 크게 감소함에 따라 다시 동결하지 마십시오. Ctl-GFP 또는 CXCR4-GFP 레트로바이러스 초월제를 세포에 감염(MOI)의 복합성(MOI)으로 추가하여, 55μM 최종 농도에서 8 μg/mL 폴리브레인 및 신선한 β-메르카포에탄올이 존재합니다. 비변환 된 제어를 위해 따로 설정 된 세포에 바이러스 성 주식을 추가하지 마십시오.</li>
	<li>실온에서 90 분 동안 800 x g에서 원심 분리 플레이트로 스프 감염을 수행하십시오.</li>
	<li>37°C에서 레트로바이러스가 있는 플레이트를 배양하고, 5%CO2를 추가로 3시간 동안 배양한다.</li>
	<li>신선한 B 세포 배지에서 세포를 수확하고 재플레이트하고 37°C, 5%CO2에서 밤새 배양한다.</li>
</ol>4. 트랜스듀싱 된 각막 B-1a 세포의 세포 분류
<ol><li>배양된 세포를 수확하고 각 조건에 대해 3개의 분리된 50 mL 원추형 튜브로 풀: 비형화, Ctl-GFP 변환, 및 CXCR4-GFP 변환.</li>
	<li>1.6단계에서와 같이 살아있는 세포를 카운트한 다음, 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기를 하고 흡인상상체를 흡인한다.</li>
	<li>Fc 수용체를 차단하기 위해 1:50 항 CD16/CD32항체(재료표)를함유하는 100,000개의 세포/μL을 정렬 버퍼(PBS + 1% BSA)에서 재중단한다. 4 °C에서 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.</li>
	<li>보상 제어를 위한 Aliquot 세포 (보상 대조군 당 ~ 30,000 셀): 비형질화 된 샘플에서 비 스테인드 및 단일 얼룩 제어 알리쿼트 및 변환 된 샘플에서 GFP 단일 얼룩 제어 aliquot. 참고: 비형질 세포 수가 낮은 경우 상업적으로 이용 가능한 보상 비드는 단일 얼룩 제어에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>플루오로포폴을 함유하는 2x 항체 마스터 믹스를 정렬 완충액으로준비한다(표 1). 비변환, CTL-GFP 변환 및 CXCR4-GFP 변환 샘플에 2x 마스터 믹스를 추가합니다. 단일 얼룩 컨트롤에 개별 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오. 참고 : 2x 마스터 믹스는 1.8 단계에서와 같이 안티 CD16 / CD32로 인큐베이팅 할 때 세포가 이미있는 액체의 양을 차지합니다. 각 조건에서 세포의 aliquot는 CXCR4과발현을 확인하기 위해 CXCR4에 대해 별도로 염색될 수 있다.</li>
	<li>1 mL의 버퍼로 샘플을 세척하고 70 μm 필터를 통해 폴리 프로필렌 튜브로 변형시.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기를 흡인하여 흡인한다. 정렬 버퍼에서 50,000 셀/μL에서 샘플을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>세포 선별 에 앞서 표지형 형광 활성화 세포 선별(FACS) 수집 튜브1 mL을 함유하는 포집 배지(RPMI-1640) 20% 열 불활성화 FBS, 10 mM HEPES, 1x 비필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루브, 50 μg/mL 겐타미신, 55μM β-메르카포에탄올) 각 집단에 대해 분류되어야 한다.</li>
	<li>셀 선별기에서 샘플을 실행하기 전에 죽은 셀 판별에 대해 2x DAPI(정렬 버퍼에서 1:5000 희석으로 제조)를 추가합니다.</li>
	<li>GFP+ B-1a 세포를 DAPI-CD19+ GFP- + B220미드로 CD23-CTL-GFP 및 CXCR4-GFP 샘플로부터의+ 세포- DAPI로서 수집 배지를 포함하는 FACS 튜브로 정렬한다.- + 비형 변환 샘플을 사용하여 GFP+ 게이트를 설정하고 DAPI-CD19+- GFP- B220미드로 CD23-IgM+ + CD5+ 비형 변환 된 B-1a 세포를 정렬합니다.- - + 참고: 대안적으로, 비형 전환 된 세포는 또한 GFP- 분획 내에서 B-1a 세포를 별도로 게이팅하여 CTL-GFP 및 CXCR4-GFP 샘플로부터 분류될 수 있다. 트랜스듀싱 또는 비-트랜스듀싱 된 B-1b 세포는 또한 DAPI-CD19 + GFP+/- B220미드로 CD23- IgM+ CD5- 세포로서 이 정렬 전략을 사용하여 정렬 될 수있다.</li>
</ol>5. 입양 이전
<ol><li>세포 선별 후, 원심분리세포를 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 조심스럽게 흡인한다.</li>
	<li>1,000 세포/μL에서 차가운 멸균 1x PBS에서 세포를 다시 중단하십시오.</li>
	<li>이소플루란을 사용하여 수컷Rag1-/- ApoE-/- 마우스를 마취시키고 초미세 인슐린 주사기를 사용하여 정맥 내 레트로 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스 당 100 μL (100,000 세포)를 주입합니다. 대조군으로 1x PBS를 가진 몇몇 마우스를 주입하십시오.</li>
</ol>6. 공여자 세포 및 혈장 IgM의 정량화
<ol><li>원하는 시간 에서 입양 후 전송, 골수 및 비장 조직수확에 의해 수용자 마우스에서 전송 된 세포를 분석 4 및 유세포 분석. CD45.1, CD45.2 및 CXCR4에 대한 염색을 통해 공여체 세포 국소화 및 CXCR4 과발현을 정량화하고 Flowjo와 같은 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석합니다. 참고: 이 단계에서 사용되는 항체는 표 1을 참조하십시오. GFP가 형질전환 공여자 세포상에 존재할 때 FITC 채널에서 형광이 존재하는 항체 컨쥬게이트를 사용하지 않도록 한다.</li>
	<li>동물 희생 시 심장 천자를 통해 수집된 전혈에 0.5 M EDTA의 10 μL을 첨가하여 혈장을 분리하였다. 7,000 x g에서 전혈을 분리된 1.5 mL 원심분리관으로 분리하여 원심분리기. ELISA4에의한 IgM과 같은 분비 인자의 분석을 수행 할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에 제공된 방법은 안정적이고 비교적 효율적인 1차 B-1a 세포 유전자 전달, 생체 내 입양 전달, 주입된 세포의 식별 및 국소화를 가능하게 한다. 세포는 세포 전이 후 17주 동안 검출될 수 있었고 증가된 CXCR4 발현을 유지하였다. 레트로바이러스 매개 전달은 우리의 손에 있는 세포 생존에 최소한의 충격으로 1 차 적인 murine B-1a 세포의 30-40% transduction 효율성을 산출했습니다(그림 4e). 이것은 retroviral 감염, 아데노 바이러스 감염, 핵 제거, 또는 lipofectamine15를포함하여 1 차적인 뮤린 B 세포로 유전자 전송을 위한 기술을 비교한 Moghimi와 동료에 의하여 이전 연구 결과에서 결과와 일치합니다. 그러나, 우리는 CXCR4 과발현의 범위가 CXCR4-GFP 변환 B-1a 세포를 수신하는 수신자 내에서 상당히 변화한다는 것을 것을을 발견했습니다<strong class="...

최근 연구는 상당한 면역 세포, 특히 B 세포, 특히 세포 국소화에 따라 자형질 및 기능적 이질성을입증했다1,2,,3,,4,5.5 B-1a 세포는 보호 IgM 항체를 생성하는 이기종 용량을 가진 하나의 그러한 집단; 골수 B-1a 세포는 IgM을 분비하고 혈장 IgM 타이터6에크게 기여하며, 복막 B-1a 세포는 항상성에서 낮은 수준의 IgM 분비를 가지며 대신 선천적 톨-유사 수용체(TLR) 또는 사이토카인 매개 신호를 통해7,8,9,활성화될 수 있으며, 70 , 70 , 70 , 70 ,70. B-1a 세포 IgM 항체는 병원균, 세포자멸 세포 및 산화된 LDL에 존재하는 산화 특이적 에피토프(OSE)를 인식하고, OSE에 결합하는 IgM은 죽상동맥경화증 과 같은 질병에서 염증성 하류 신호를 방지할 수 있다11. 따라서, 골수와 같은 부위로의 후막 B-1a 세포 이동을 증가시켜 IgM 생산을 증가시키는 전략이 치료적으로 유용할 수 있다. 그러나, 이러한 전략에 대 한 중요 한 대상 및 세포 유형 특정, 오프 타겟 효과 면역 기능 또는 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
여기서 우리는 1차 뮤린 B-1a 세포에서 CXCR4의 표적화 및 장기 과발현에 대한 방법을 설명하고 세포 이동 및 기능적 IgM 항체 생산을 시각화하기 위한 후속 입양 전달을설명한다(도 1). 1 차적인 B 세포의 유전 조작은 형질전환된 세포주의 형질전환에 비해 낮은 형광 효율성에 의해 제한됩니다. 그러나, 형질전환된 세포주들이1차 세포(12,,13)로부터현저하게 이탈할 수 있기 때문에, 1차 세포의 사용은 정상 생리학에 보다 밀접하게 부합하는 결과를 제공할 가능성이 높다. 몇몇 기술은 레트로바이러스 전달, 아데노바이러스 전달, 지방흡입, 또는 세포 건강에 미치는 영향의 다양한 수준을 가지는 전기천공 기반 형질감염을 포함하는 1차 뮤린 B 세포에서유전자 전달을 위해 기술되었다13,,14,,15. 다음 방법은 레트로바이러스 전달을 활용하여 세포 생존율에 최소한의 영향을 미치면서 >30%의 적절한 유전자 전달 효율을 산출하였다. 앞서 설명한 레트로바이러스 를 사용하여 생성된 CXCR4-뮤린 줄기세포 바이러스-내부 리보솜 진입 부위-녹색 형광 단백질(MSCV-IRES-GFP; MigR1)16,마우스 CXCR4 유전자가 서브클로론된 4. MigR1(대조군(Ctl)-GFP) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자는 이전에 발표된 프로토콜4,,14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형질감염을 사용하여 생성되었다.
성공적으로 변환된 B-1a 세포를 정맥내 림프구 결핍Rag1-/- 마우스로 옮겼다. 기증자 및 수용자 마우스 는 또한 아포리포프로테인 E (ApoE) 유전자의 녹아웃을 포함, 이는 증가 OSE 축적 및 동맥 경화증의 결과, 따라서 생체 내 B-1 세포 활성화 및 IgM 생산을위한 모델을 제공. 더욱이, 기증자 및 수용자 마우스는 CD45 동형에서 달랐다; 공여자 B-1 세포는 CD45.1+ApoE-/- 마우스로부터 왔고Rag1-/- CD45.2+ApoE-/- 수용자로 옮겨졌다. 이는 유세포분석 동안 B 세포 마커에 대한 추가적인 얼룩을 가할 필요 없이 수용자 CD45.2 B 세포로부터 의 기증자 CD45.1의 분화를 허용했다. 여기에 제공된 결과는 B-1a 세포에 대한 표적 CXCR4 과발현이 B-1a 세포의 증가된 능력과 연관되어 골수로 이동하는 것을 보여 주며, 이는 증가된 혈장 항 OSE IgM과 연관되어 있다. 우리는 또한 부정적인 선택을 통해 후막 B-1 세포의 농축을위한 방법을 제공하고 효율적인 전달을위한 B-1 세포 활성화의 요구 사항을 입증합니다. 이 방법은 B-1a 세포 이동, 표현형 또는 기능에 대한 단백질 과발현의 효과를 연구하기 위해 다른 레트로바이러스 구조에 적응될 수 있다. 더욱이, CD45.1 대 CD45.2 동형 구별의 사용은 이론적으로 내인성 B 세포를 포함하는 그밖 면역 충분한 뮤린 모형으로 전송을 허용할 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>70 미크론 필터 캡</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>anti-biotin microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32, 또는 Fc block</td><td>Life Technologies</td><td>MFCR00</td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0452-83</td><td>클론: RA3-6B2</td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APCef780</td><td>eBioscience</td><td>47-0193-82</td><td>클론: eBio1D3</td></tr><tr><td>CD23 비오틴</td><td>eBioscience</td><td>13-0232-81</td><td>클론: B3B4</td></tr><tr><td>CD23 PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0232-82</td><td>클론: B3B4</td></tr><tr><td>CD3e 비오틴</td><td>eBioscience</td><td>13-0033-85</td><td>클론: eBio500A2</td></tr><tr><td>CD45.1 ApoE-/- 마우스</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>사육</td></tr><tr><td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560580</td><td>클론: A20</td></tr><tr><td>CD45.2 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562895</td><td>클론: 104</td></tr><tr><td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- 마우스</td><td>N/A</td> N<td>/</td><td>A 사육</td></tr><tr><td>CD5 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0051-83</td><td>클론: 53-7.3</td></tr><tr><td>Ctl-GFP 레트로바이러스</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Dr. T.P.가 제공하는 GFP 발현 레트로바이러스 플라스미드 MigR1을 사용하여 사내에서 생성됨 벤더</td></tr><tr><td>CXCR4 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td>클론: 2B11</td></tr><tr><td>CXCR4-GFP 레트로바이러스</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>마우스 CXCR4를 MigR1 레트로바이러스 플라스미드</td></tr><tr><td>F4/80 비오틴</td><td>Life Technologies</td><td>MF48015</td><td>클론: BM8</td></tr><tr><td>Flowjo Software v. 9.9.6</td><td>Treestar Inc.</td><td>라이선스 필요</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td>클론: RB6-8C5</td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IgM PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562565</td><td>클론: R6-60.2</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Yellow</td><td>Life Technologies</td><td>L34968</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1 비오틴</td><td>BD Biosciences</td><td>553163</td><td>클론: PK136</td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ODN 1668</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-1668</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 비오틴</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-82</td><td>클론: Ter119</td></tr></tbody></table>

뮤린 b-1a 세포에 cxcr4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 igm 생산에 표적 b-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

세포 기능이 세포 미세 환경의 틈새 특이적 요인에 의해 영향을 받므로 세포 국소화 및 이동을 해부하는 방법은 세포 기능에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. B-1a 세포는 건강과 질병 도중 발생하는 산화 특이적 에피토프에 대하여 보호천연 IgM 항체를 생성하는 마우스에 있는 유일한 B 세포 서브세트입니다. B-1a 세포 IgM 생산은 B-1a 세포 위치에 따라 다르며, 따라서 높은 항체 생산을 지지하는 틈새 시장까지 B-1a 국소화를 표적으로 하는 치료적 관점에서 유용하게 된다. 여기서 우리는 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 4(CXCR4)의 레트로바이러스 매개 과발현에 의해 골수로B-1a 세포 이동을 표적으로 하는 방법을 설명한다. 1 차적인 murine B 세포에 있는 유전자 유도는 도전적일 수 있고 전형적으로 기술에 따라서 10-20%의 낮은 형혈 성 효율성을 산출합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 성 환전이 30-40% 형질전환 효율을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 기증자 B-1a 세포 이동 및 국소화가 가시화될 수 있도록 B 세포 결핍 수용자 마우스로 변환된 B-1a 세포의 입양 세포 전달을 이용합니다. 이 프로토콜은 다른 레트로바이러스 구성을 위해 변형될 수 있으며, 기증자 세포 또는 숙주 세포 표현형 및 기능의 분석, 또는 B-1a 세포 전달 후 분비된 수용성 인자의 분석을 포함하여 다양한 기능성 분석사에서 사용될 수 있다. CD45.1 및 CD45.2 동형및 레트로바이러스 플라스미드 내에 GFP 리포터의 존재에 의해 분화된 뚜렷한 공여자 및 수용인자 마우스의 사용은 또한 내인성 B 세포 집단을 포함하는 다른, 면역 이충분한 마우스 모델에서 공여자 세포의 검출을 가능하게 할 수 있었다.

프로토콜의 개요는 그림 1에있습니다. 그림 2는 다른 각막 세포 유형의 자기 고갈 후 후막 B-1a 세포의 농축을 표시합니다. 고갈 후 분획에서 살아있는 단일 세포는 F4/80+ 대식세포에 비해+ CD19+ B 세포의 더 큰 비율을 가지며, CD5hi CD19-T 세포가 결여되고, CD19+CD5 미드 B-1a 세포의 증가된 주파수를 함유하고 있다.- + 도 3은 성공적인 레트로바이러스 B 세포 전멸을 위한 B 세포 활성화의 요구 사항및 Ctl-GFP 레트로바이러스를 사용하여 바이러스 MOI가 증가함에 따라 성공적으로 트랜스듀싱된 GFP+ B 세포 서브세트의 빈도증가. 표 2는 24웰 또는 6웰 플레이트에 비해 96개의 잘 둥근 바닥 판을 사용...

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

이 프로토콜은 표적 유전자 전달이 B-1a 세포 국소화 및 기능에 어떻게 영향을 미치는지 평가할 수 있고 생체 내의 유전자 치료 잠재력을 검토하기위한 개념 접근법의 유용한 증거가 될 수 있습니다. 이 방법은 1차 B-1a 세포에 안정적이고 비교적 효율적인 유전자 전달을 제공하고 기증자 세포 표현형 및 기능 사후 입양 전달의 식별을 허용한다. 이 방법은 세포 생존, 증식 및 기능을 포함하는 생체 내의 다양한 기증자 및 숙주 세포 프로세스를 검사하는 데 사용될 수 있으며, 다른 입양 전달 시스템에 적용될 수 있다.수막 유체 수확은 까다로울 수 있습니다. 회복을 극대화하고 하원 세포 인구를 오염시킬 수 있는 장에 구멍을 뚫지 않도록 세포를 철저히 분리하십시오. 복막 B-1 세포 수집의 경우 직선 수술 가위를 사용하여 12 주에서 14 주 된 남성, CD45.1 + 아폴리포폴단백질 E 녹아웃 마우스의 복부에 피상적 인 컷을 만들고 곡선 가위를 사용하여 피부를 벗겨 내어 복막 벽을 노출시하십시오.25 게이지 바늘이 장착된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 복막 구멍을 37도 RPMI-1640 배지의 10 밀리리터로 플러시합니다. 그리고 마우스가 15~20초 동안 좌우로 완전히 흔들릴 수 있도록 꼬리의 베이스를 잡습니다. 흔들린 후 주사기를 사용하여 주사기를 사용하여 고관절 의 오른쪽 아래에서 액체를 흡인하고 창자 근처의 장 근처에서 주사기를 사용하여 주사기를 사용하여 주사기지방 창고와 기본 장기를 방해하지 않도록 주의하십시오.6~7밀리리터의 라베이지를 수집한 후 얼음 위에 50밀리리터 원추형 튜브에 액체를 분배합니다. 집게를 사용하여 다이어프램 위의 복막 벽을 파악하여 동물의 수직 고도를 허용하여 나머지 유체가 복막 구멍의 바닥에 남아 있게 합니다. 간 자체를 절단하지 않고 간 위의 회막 벽에 작은 절단을 만들기 위해 외과 가위를 사용합니다.그리고 유리 파이프와 전구를 사용하여 남은 수막 유체를 수집합니다. 모든 유체가 수집되면, 모든 마우스로부터 복막 세척 세포를 알리쿼트와 얼음에 50 밀리리터 튜브에서 튜브 농도당 8번째 세포에 최대 10배까지 첨가한다. 그리고 원심분리에 의한 세포를 퇴적시한다.각 펠릿을 항 CD16/CD32 항체의 1밀리리터로 재보설하여 4°C에서 10분 동안 분석 버퍼에서 1-50 비율로 희석하였다. 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 20분 배양에 생체개화 항체 마스터 믹스의 동일한 볼륨을 추가하고

retroviral-overexpression-cxcr4-on-murine-b-1a-cells-adoptive

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

에서 유전자의 구조와 기능 분석의 효율적인...

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

세포 침전 매니폴드/슬라이드 장치를 사용하여 시험관 내에서 비부착 면역 세포의 방사상 이동성을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 이동은 종양 세포의 단층 또는 세포외 기질 단백질에서 추적됩니다. 광학 및 형광 현미경에 의한 검사를 통해 세포 이동성 및 세포 독성 기능을 관찰할 수 있습니다.

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뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

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