Name: 펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 배우세요 HDX-MS를 활용하여 란티펩타이드 생합성 효소의 구조적 역학을 분석하는 방법을. 이 기술은 단백질 표지 없이 천연 상태에서 효소 기능 영역을 식별할 수 있습니다.

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이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회, 퐁드 드 레체슈 뒤 퀘벡 자연 에 테크놀로지, 혁신을위한 캐나다 재단, 맥길 대학 창업 기금에 의해 지원되었다.

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<li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuteros%3A+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).</li>
<li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li>
<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
</ol>

우리는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜에 제시된 HDX-MS 워크플로우는 단백질의 구조적으로 역동적인 요소의 공간 분포를 매핑하고 이러한 역학이 변투(리간드 결합, 효소 돌연변이 발생 등)에 대한 응답으로 어떻게 변화하는지 조사하기 위한 매우 견고한 플랫폼을 제공합니다. HDX-MS는 일반적으로 형성 역학을 조사하는 데 사용되는 다른 구조 생물학 접근 방식에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 보유하고 있습니다. 특히 소량의 단백질만 필요합니다. 본 명세서에 기재된 워크플로우를 사용하여, 1 μM 단백질의 1mL 샘플은 5개의 교환 시간 점을 포함하는 각각의 삼중 화질 HDX 반응에 충분한 물질을 제공한다. 더욱이, 관심있는 단백질에 대한 크기 제한은 거의 없으며, 단백질 복합체는 HDX-MS 접근법에 동등하게 순종한다. 크기 제한은 펩틱 펩티드가 크로마토그래피로 해결할 수 있는 범위와 m/z 및 이온 이동성 치수에 의해서만 제한됩니다. 따라서 많은 단백질/단백질 복합체의 경우 HDX-MS는 단백질-단백질 상호 작용 인터페이스, 리간 드니스트 사이트, 형태 역학...

단백질은 펨토초 규모의 결합 진동에서부터 여러 초 동안 발생할 수 있는 전체 단백질 도메인의 재배열에 이르기까지 시간 척도에 따라 다른 적합성을 샘플링하는 구조적으로 역동적인분자입니다. 이러한 형태 적 변동은 종종 효소 / 단백질 기능의 중요한 측면입니다. 예를 들어, 리간드 결합에 의해 유도된 형태 변화는 촉매에 필요한 활성 부위 잔류물을 구성하거나, 순차적 운동 메커니즘에서 기판 결합 부위를 정의하거나, 환경에서 반응성 중간체를 차폐하거나, 알로스티아 네트워크를 통해 효소 기능을 조절함으로써 효소 기능을 조절하는 데 매우 중요합니다. 최근 연구에 따르면 형태 역학은 진화 전반에 걸쳐 보존될 수 있으며 분자 운동을 보존하는 혼란은 기판 특이성의 변화와 새로운 효소 기능2,3의출현과 상관관계가 있을 수 있음을 보여주었다.
최근 몇 년 동안 수소-중수소 교환 질량 분광법(HDX-MS)은 단백질 형성 경관이 리간드 결합 또는 돌연변이 발생4,5,6,7과같은 동요에 어떻게 반응하는지 조사하는 강력한 기술로 급속히부상하고 있다. 전형적인 HDX-MS실험(도 1)에서관심 있는 단백질은 D2O로 제조된 완충제에 배치되어, 이는 신테리아를 가진 용매 교환 성수기의 교체를 유발한다. 펩티드 결합의 아미드 모이티의 교환 속도는 pH, 국소 아미노산 서열 및 아미드8의국소 구조 환경에 크게 의존한다. 수소 결합 상호 작용에 종사하는 아미드 (예 : α-헬릭 및 β 시트에 존재하는 것과 같은)은 대량 용매에 노출되는 단백질의 구조화되지 않은 영역에서 아미드보다 더 느리게 교환됩니다. 따라서, 중수소 섭취의 정도는 효소의 구조를 반영한다. 형태역학적 이거나 리간드 결합 시 구조적 전이를 겪는 효소는 측정 가능한 HDX 응답을 얻을 것으로 예상됩니다.
구조화된 아마이드의 느린 환율에 대한 기계론적 기초는 도 25,8,9로도시된다. HDX를 받기 위해서는, 구조화된 영역은 먼저 전개된 형성을 일시적으로 샘플링해야 하며, 이러한 용매 분자는 특정 산/염기 화학 메커니즘을 통해 HDX 교환을 촉매하는, 교환 가능한 아미드에 접근할 수 있다. 궁극적으로,화학환율(kchem)과접이식 및 재접이식 비율(kopen 및 kclose)의상대적 크기는 실험5,8에서측정된 HDX 속도를 결정한다. 이 간단한 운동 모델에서, 중수소 섭취량의 정도는 기본 형태 역학을 반영할 것이 분명하다 (k열기 및 k닫기에의해 정의). 대부분의 HDX-MS 실험은 상향식 워크플로우에서 수행되며, 교환 반응에 따라 관심 있는 단백질이 펩타이드로 소화되고 각 펩티드에 의한 중수소 흡수량은 질량7의증가로 측정된다. 이러한 방식으로, HDX-MS는 효소 형성 역학에 대한 교란을 펩티드의 로컬 공간 척도에 매핑할 수 있게 하여, 연구자가 동요가 관심 있는 효소의 다른 영역에서 역학을 어떻게 변화시키는지 평가할 수 있게 합니다.
단백질 구조 역학을 해명하기 위한 HDX-MS 접근법의 장점은 다양합니다. 먼저, 이 방법은 사분위구조(10)를가진 시스템에서 소량의 토종 단백질 또는 단백질 복합체로 수행될 수 있다. 분석에서 사용되는 효소 제제는11,12,상향식 HDX-MS 워크플로우가 단백질 서열을 커버하는 충분한 수의 자신있게 확인된 펩티드를 제공하는 한, 고도로 정제될 필요가 없다. 더욱이, HDX-MS는 단일 분자 형광연구에서사용되는 바와 같이 현장별 단백질 라벨링필요 없이 근사 조건하에서 형성 역학에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 조사할 수 있는 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 크기 제한은 없다(핵자기 공명[NMR] 분광법 도전과 같은 접근법을 만드는)7,14. 마지막으로, 시간 해결된 HDX-MS 방법은 X선결정학15,16,17,18로공부하기 어려운 본질적으로 무질서한 단백질을 연구하기 위하여 이용될 수 있다. HDX-MS의 주요 제한사항은 데이터가 낮은 구조적 해상도라는 것입니다. HDX-MS 데이터는 형태 역학이 변화하는 곳을 가리키고 결합된 형태 변화를 드러내는 데 유용하지만 관찰된 변화를 유도하는 정확한 분자 메커니즘에 대한 많은 통찰력을 제공하지는 않습니다. 단백질 HDX-MS 데이터와 전자 포획 해리 방법의 조합에 있는 최근 발전은 단 하나 아미노산 잔류물19에교환 사이트를 매핑하는 약속을 보여주었습니다, 그러나 후속 생화확적인 및 구조 적인 연구는 아직도 HDX-MS 데이터에 의해 전달된 구조 모형에 명확성을 제공하기 위하여 수시로 필요합니다.
아래, HDX-MS 분석기의 개발을 위한 자세한 프로토콜이20을제시한다. 아래에 제시된 견본 준비 프로토콜은 수성 완충제에 있는 좋은 용해도를 전시하는 어떤 단백질든지 일반적으로 적용되어야 합니다. 세제 또는 인지질(21,22,23,24)의존재에서 분석될 필요가 없는 것보다 더 전문적인 시료 제조 방법및HDX-MS 워크플로우를 단백질에 사용할 수있다. HDX-MS 데이터 수집을 위한 기악 설정은 액체 크로마토그래피 시스템에 결합된 고해상도 쿼드러폴 비행 시간 질량 분광계에 대해 설명됩니다. 유사한 복잡성 과 해상도의 데이터는 상업적으로 이용 가능한 다수의 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS) 시스템에서 수집될 수 있습니다. 시판되는 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 처리의 주요 측면도 제공됩니다. 또한 광범위한 HDX-MS 커뮤니티12의권장 사항과 일치하는 데이터 수집 및 분석에 대한 지침을 제시합니다. 기재된 프로토콜은 항균 펩티드천연물(20)의다단계 성숙을 촉매하는 란티펩타이드 합성물인 HalM2의 동적 구조적 특성을 연구하는 데 사용된다. 우리는 HDX-MS가 기판 바인딩 사이트와 이전 특성을 벗어난 알로스터 속성을 공개하는 데 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다. 단백질 HDX-MS에 대한 몇몇 그밖 프로토콜은 최근25,26에서간행되었습니다. 현재 작업과 함께 이러한 초기 기여는 독자에게 실험 설계에 약간의 유연성을 제공해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k 원심 여과 장치(Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidine-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>칼륨BioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Hydrochloride</td><td>TRC Canada</td><td>T012500</td><td>펩타이드는 요청에 따라 합성되었습니다</td></tr><tr><td>재료/장비 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments/Description</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>버전 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>버전 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>버전 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>버전 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>버전 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>재료/장비 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Instrument and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 분석 컬럼</td><td>Waters</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column</td><td>Waters</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX 시스템</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로팁 pH 전극</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH 컬럼 또는 Pepsin solumn</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt G2-Si</td><td>워터스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(hdx-ms) 플랫폼

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

수소-황량제 교환 질량 분석법(HDX-MS)은 효소 형태 변화와 효소 기질 상호작용의 생체물리학적 특성화를 위한 강력한 방법입니다. HDX-MS는 소량의 물질만 소비하며, 효소/기질 라벨링 없이 근동 조건하에서 수행할 수 있으며, 큰 효소 및 다단백 복합체에서도 효소 형성 역학에 대한 공간적으로 해결된 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법은D2O에서 제조된 완충제로 관심 있는 효소의 희석에 의해 개시된다. 이것은 중수소 (N-D)를 가진 펩티드 본드 아마이네스 (N-H)에서 프로티움의 교환을 트리거합니다. 원하는 교환 시점에서, 반응 알리쿼트가 담금질되고, 효소는 펩티드로 프로테오리제화되고, 펩타이드는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)에 의해 분리되고, 각 펩타이드의 질량의 변화(중수소용 수소의 교환로 인해)는 MS에 의해 기록된다. 각 펩티드에 의한 중수소 섭취량의 양은 해당 펩티드의 국소 수소 결합 환경에 크게 의존한다. 펩타이드는 효소 교환 중음류의 매우 역동적인 부위에 매우 빠르게 존재하는 반면, 잘 정렬된 지역에서 유래된 펩타이드는 훨씬 더 느리게 교환을 받는다. 이러한 방식으로, HDX 속도 로컬 효소 형성 역학에 대 한 보고서. 다른 리간드가 있는 중수소 섭취량 수준에 대한 혼란은 리간드 결합 부위를 매핑하고, 알로스터 네트워크를 식별하고, 효소 기능에서 형성 역학의 역할을 이해하는 데 사용될 수 있다. 여기에서, 우리는 우리가 더 나은 lanthipeptides에게 불린 펩티드 천연 제품의 모형의 생합성을 이해하기 위하여 HDX-MS를 이용한 방법을 보여줍니다. Lanthipeptides는 전통적인 구조 생물학 접근으로 공부하기 어려운 크고 다기능, 형태역학적 효소에 의해 번역 후 변형되는 유전자 로코딩된 펩티드입니다. HDX-MS는 이러한 유형의 효소의 기계적인 특성을 조사하기 위한 이상적이고 적응력이 뛰어난 플랫폼을 제공합니다.

각 샘플 주사 세트에 대한 보철 소화의 품질과 워크플로우의 재현성을 평가할 필요가 있습니다. 따라서, HDX-MS 애사를 수행하기 전에, 관심 있는 단백질의 프로테오리시스에 대한 효과적인 조건을 확립하고, 역상 액체 크로마토그래피 및 가스상 이온 이동성을 이용한 펩티드의 분리를 위해, MS를 이용한 펩타이드검출을 위한 것이 필수적이다. 이를 위해 관심 있는 단백질에 대한 기준 샘플(중수소부재시 채취)을 먼저 조사해야 한다(섹션 3). 도 3A−C의 크로마토그래피 데이터는 HalM2 lanthipeptide synthetase의 3개의 기준 샘플에 대한 총 이온 크로마토그램(TiCs)을 보여줍니다. TIC는 질량 스펙트럼 검사에 포함된 모든 m/z 값에서 모든 이온 카운트의 합계에 따라 시간 종속변경입니다. 3분에서8분 사이의 TiC의 더 자세히 보기는 그림 3D−F에</stron...

Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

이 프로토콜은 단백질 구조적 역학에 대해 특별히 해결된 정보를 제공할 수 있습니다. 이는 관심 단백질에서 기능적으로 중요한 영역을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 거의 네이티브 조건에서 단백질 구조적 역학을 조사합니다.각 반응에 대해 나노몰 양의 물질을 사용하여 단백질 라벨링이 필요하지 않습니다. 500 마이크로리터 튜브에서 관심 단백질에 대한 비중수소화 참조 시료를 3회 준비하는 것으로 시작합니다. 튜브당 적절한 양의 담금질 버퍼로 샘플을 담금질하여 pH 측정기 판독값 2.5를 달성합니다.분석될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하기 위해 샘플을 액체 질소에 급속 동결합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 상향식 액체 크로마토그래피 질량 분석 워크플로우를 사용하여 프로티화된 효소 참조 샘플을 분석합니다. 적절한 단백질체학 소프트웨어 프로그램에서 원시 질량 분석 데이터를 분석합니다.라이브러리(Libraries) 및 단백질 서열 데이터뱅크(Protein Sequence Databanks)로 이동하여 관심 단백질의 아미노산 서열을 가져옵니다. 관심 단백질 염기서열의 이름을 입력하고 단백질 염기서열을 FASTA 형식으로 가져옵니다. Library 메뉴에서 처리 매개변수를 정의하려면 Electrospray MSE를 데이터 수집 유형으로 선택합니다.Lock Mass for Charge 2 필드에서 글루칸 1 섬유 무펩타이드 B의 2 플러스 이온에 대한 마스터 전하 비율로 785.8426을 입력하고 Finish를 클릭합니다. 워크플로우 매개변수를 정의하려면 검색 유형으로 전기분무 MSE를 선택합니다. Workflow and Database search query 제목 아래에서 Databank 필드에 생성된 데이터베이스 단백질을 선택하고 기본 다이제스트 시약을 비특이적으로 변경합니다.고정 변형제 시약 필드를 지우려면 제어 버튼을 누른 상태에서 Carbamidomethyl을 클릭하여 출력 디렉토리를 지정하고, 옵션, 자동화 설정 및 E를 식별 C.To 선택한 다음 apex 3D 및 펩타이드 3D 출력 및 이온 계산 출력 상자를 선택합니다. 그리고 원하는 디렉토리를 지정하십시오. 참조된 샘플 데이터를 처리하려면 마이크로타이터 플레이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 새 플레이트를 만듭니다.하나의 웰을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 다른 세 개의 웰로 드래그하여 참조된 각 샘플에 대해 하나의 웰을 강조 표시합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 원시 데이터 추가를 선택합니다. 창에서 세 개의 참조된 파일이 포함된 디렉터리로 이동하여 세 개의 파일을 동시에 선택합니다.Next를 클릭하고 정의된 처리 매개변수를 선택합니다. 다음을 다시 클릭하고 정의된 워크플로우 매개변수를 선택합니다. 그런 다음 마침을 클릭합니다.원시 데이터, 처리 매개변수 및 워크플로우 매개변수가 플레이트의 각 웰에 할당되면 웰이 파란색으로 바뀝니다. 웰을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 Process Latest Raw Data를 선택합니다. 데이터 처리를 추적하려면 창의 오른쪽 아래 모서리를 클릭합니다.실행할 작업이 나타나지 않으면 처리가 완료되고 마이크로타이터 플레이트의 웰이 녹색으로 바뀝니다. wells를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 View Workflow Results를 선택합니다. 참조된 각 데이터 파일에 대해 별도의 창이 열립니다.데이터를 검사하여 참조된 샘플 데이터에 있는 대부분의 질량 분석 신호가 관심 단백질의 인실리코(in silico) 분해에서 예측된 펩타이드에 성공적으로 매핑되었는지 확인합니다. 일치하는 펩타이드는 출력 스펙트럼에서 파란색으로 나타납니다. okay 필터를 두 번 클릭하고 퍼센트 커버리지가 99%보다 큰지 확인합니다.추가 임계값을 위해 Proteomic Software 출력을 Hydrogen Deuterium Exchange Processing Software로 가져옵니다.그리고 데이터를 클릭하고 PLGS 결과를 가져옵니다. 추가 아이콘을 클릭하고 적절한 디렉토리로 이동하여 처리된 데이터 파일을 선택합니다. 다음을 클릭하고 최소 연속 이온을 2보다 크거나 같게 설정합니다.질량 오차는 5ppm입니다. 파일 임계값을 3으로 설정한 다음 Finish(마침)를 클릭합니다. 수소 중수소 교환 반응을 수행하려면 500 마이크로 리터 튜브에서 완충액을 분취하십시오.그리고 간단히 원심 분리하여 모든 담금질 완충액을 각 튜브의 바닥으로 옮깁니다. 담금질된 용액이 들어 있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 모든 중수소화 반응 성분을 별도의 1.5ml 튜브에 미리 혼합합니다.그런 다음 반응 혼합물을 섭씨 25도의 온도 조절 수조로 옮겨 10분 배양합니다. 교환 반응을 시작하기 위해 중수소화 반응 성분에 효소를 첨가합니다. 위아래로 피펫팅하여 반응 내용물을 철저히 혼합합니다.적절한 실험 교환 시점에서, 각 수소 중수소 교환 반응에서 50마이크로리터 분취량을 제거합니다. 그리고 개별 500 마이크로리터 튜브에 있는 얼음처럼 차가운 담금질 완충액 1개와 반응을 빠르고 균일하게 혼합합니다. 그런 다음 즉시 액체 질소에서 급속 동결을 위해 튜브를 덮습니다.분석할 준비가 될 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 동결된 샘플을 해동한 후, 비중수소화 참조 샘플을 위해 개발된 것과 동일한 상향식 액체 크로마토그래피 질량 분석기 워크플로우를 사용하여 중수소화 효소 참조 샘플을 분석합니다. 중수소화된 샘플에 대한 LCMS 데이터를 수집한 후 데이터 처리를 위해 이전에 생성된 수소 중수소 교환 프로젝트로 데이터를 가져옵니다.을 클릭하고 New State(새 상태) 및 New Exposure(새 노출)를 클릭하여 분석과 관련된 생화학적 상태와 중수소 노출 시간을 각각 정의합니다. New Raw를 클릭하여 분석할 수소 중수소 교환 데이터 파일을 선택합니다. 그리고 가져온 각 원시 데이터 파일에 적절한 교환 시간과 생화학적 상태를 할당합니다.데이터 분석 및 시각화를 위해 펩타이드 목록에서 첫 번째 펩타이드를 선택하고 Views 메뉴에서 누적 스펙트럼 플롯을 엽니다. 마우스를 클릭하여 필요에 따라 스틱을 할당하거나 할당 해제하여 데이터에 적절한 동위원소 분포가 있는지 확인합니다. 그리고 각 동위원소 피크가 할당되었습니다.각 전하 상태에 대한 스틱 할당을 확인하려면 누적 스펙트럼 플롯 창의 맨 위에서 전하 상태를 전환하십시오. Views 메뉴에서 펩타이드 중수소 흡수 값의 표준 편차를 확인하려면 커버리지 맵을 선택합니다. 관심 단백질의 아미노산 서열을 따라 매핑된 펩타이드 목록의 각 펩타이드를 표시합니다.상대 표준 편차에 따라 펩타이드에 색상을 지정하고 상대 표준 편차가 높은 이상치 펩타이드를 맵에서 시각적으로 검색합니다. 커버리지 맵에서 이상치 펩타이드를 클릭하여 누적 스펙트럼 플롯과 데이터 뷰어 창을 타겟 펩타이드로 채웁니다. 커버리지 맵에 관심 차이를 표시하고 맵을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 차이 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다.차이, 상태 데이터, 관심 단백질의 PDB 파일을 Deuteros로 가져옵니다. 그리고 99% 신뢰 구간을 선택하고 합계를 활성화하고 데이터를 처리합니다. 그런 다음 pi mol에서 Export, Uptake 및 Export를 선택하여 PyMOL 스크립트를 생성하고, PyMOL 소프트웨어에서 관심 단백질의 PDB 구조에 상당한 교환 차이 영역을 매핑합니다.Hal-M2 람다 펩타이드 합성효소의 3개 참조 샘플에 대한 이러한 대표적인 총 이온 크로마토그램은 질량 스펙트럼 스캔에 포함된 모든 질량 대 전하 비율 값에서 모든 이온 수의 합에 대한 시간 의존적 변화를 보여줍니다. 총 이온 크로마토그램 프로파일의 모양과 강도는 비슷해야 합니다. Hal-M2의 단백질 분해 분해가 재현 가능함을 나타냅니다.그리고 세 가지 참조 샘플 모두에서 유사한 효율성을 보입니다. 주어진 시간 간격에 대한 질량 스펙트럼도 비슷해야 합니다. 유사한 펩타이드가 각 샘플 내에 존재하고 C18 컬럼에서 유사한 시간에 암시된다는 확신을 제공합니다.중수소 교환 샘플에 있는 대부분의 펩타이드는 동위원소 분포에서 더 높은 질량 대 전하 비율 값으로 명백한 변화를 보여야 합니다. 예를 들어, 이러한 데이터는 중수소 라벨의 상당 부분이 산 담금질, 펩신 분해 및 액체 크로마토그래피 질량 분석 데이터 수집 과정 전반에 걸쳐 유지되고 있음을 나타냅니다. 입증된 바와 같이 효소의 생화학적 특성을 특성화한 후, 이와 같은 대표적인 수소 중수소 교환 질량 분석 결과를 생성할 수 있습니다.Hal-A2 전구체 펩타이드와 Hal-M2 AMP, PMP 복합체의 결합을 설명하기 위해. 수소 중수소 교환 반응은 일관된 방식으로 준비하고 담금질해야 합니다. 그리고 검출된 수많은 펩타이드에 대한 중수소 교환 값을 결정할 때 체계적이어야 합니다.수소 중수소 교환 질량 분석법은 펩타이드 수준의 정보와 동적 단백질 구조 변화를 제공합니다. 모든 수소 중수소 교환의 기능적 관련성은 Meter Genesis에 대해 검증되어야 합니다. 및 직교 활성 분석.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

든 - TOF 질량 분석법을 성공적으로 단백질 키나제 Pak2 활성화에 아미드 수소 / 중수소 교환을 모니터 활용했다.

Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

단백질의 입체 구조와 역학은 단백질 구조 및 기능 사이의 관계를 이해하기위한 열쇠이다. 고해상도 질량 분광법과 결합 수소 교환은 단백질의 형태 적 역학 연구뿐만 아니라 접촉 인터페이스 및 알로 스테 릭 효과를 포함하여 단백질 - 리간드와 단백질 - 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 다양한 방법이다.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

여기에서는 고체 분말 내 단백질에 대한 고체 상태 아미드 수소/중수소 교환 질량 분석법(ssHDX-MS) 및 고체 상태 광분해 라벨링 질량 분석법(ssPL-MS)에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 비정질 고체 상태의 단백질 형태 및 상호 작용에 대한 고분해능 정보를 제공하며, 이는 제형 설계에 유용할 수 있습니다.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

여기에 제시된 것은 하향식 질량 분광법과 결합 된 모세관 전기 영동 기반 수소 / 중수소 교환 (HDX) 접근법을위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동시 차등 HDX 및 전기 영동 분리를 수행함으로써 서로 다른 상태의 단백질과 다른 단백질 형태를 포함하여 서로 다른 단백질 종 간의 고차 구조의 차이를 특성화합니다.

모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

배우세요 HDX-MS를 활용하여 란티펩타이드 생합성 효소의 구조적 역학을 분석하는 방법을. 이 기술은 단백질 표지 없이 천연 상태에서 효소 기능 영역을 식별할 수 있습니다.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

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