철 레독스 종(Fe(II), Fe(III)의 정량화를 위한 모세관 전기포고증-유도 결합된 혈장 질량 분광법(CE-ICP-MS)의 설정
2020년 5월 4일
이 철 레독스 분석 방법은 모세관 전기 포근-유도 결합 된 플라즈마 질량 분광법을 기초로 한 번의 짧은 분석과 결합된 샘플 스태킹을 사용합니다. 이 방법은 다양한 조직 및 생물유체 샘플에서 철 레독스 종에 대한 낮은 정량화를 신속하게 분석하고 제공합니다.
과도한 철분은 페로토시스로 알려진 지질 과산화에 의한 산화 스트레스 및 세포 사망과 같은 세포 내의 파괴적인 효과를 일으킬 수있는 무료 레독스 활성 철 2 플러스를 초래합니다. 철철과 철철의 정량적 측정은 이러한 해로운 공정에 대한 보다 긴밀한 통찰력을 위한 핵심입니다. 이 CE-ICP-Ms 기술은 철 로독 종 정량화에 모두 필요한 빠른 분석 및 낮은 정량화 한계를 모두 제공합니다.
먼저 자가 흡입량이 적은 분무기를 선택하고 홈메이드 인터페이스를 장착할 적절한 부품을 준비합니다. 하부 3방향 루어 바의 왼쪽 끝을 남성 커넥터에 연결하고 남성 커넥터를 상위 3방향 루어의 중간 연결에 연결하여 두 개의 3방향 여성 루어 커넥터를 남성 콘 루어 커넥터와 연결합니다. 다음으로, 백금 와이어 위에 1센티미터 튜브를 넣고 1센티미터 실리콘 튜브를 사용하여 첫 번째 튜브와 수컷 루어 커넥터의 노즐을 연결합니다.
스크류 회전에 의해 하부 3방향 루어 커넥터의 중간 연결에 어셈블리를 수정합니다. CE 모세관의 출구 위로 1센티미터 튜브를 밀어 넣고 끝에서 8~9cm의 위치에 놓은 다음 실리콘 튜브를 사용하여 남성 루어 커넥터의 노즐에 연결합니다. 상부 3방향 T 커넥터의 막대를 통해 전체 어셈블리를 넣고 나사 회전으로 여성 3방향 루어 커넥터의 수컷 루어 커넥터와 왼쪽 끝을 고정합니다.
그런 다음 남성 루어 커넥터의 노즐에서 25센티미터 실리콘 튜브를 수정하고 하단 3방향 루어 커넥터에서 막대 하단의 전체 어셈블리를 수정합니다. 분무기 의 끝에 5 밀리미터, 1 센티미터 실리콘 튜브를 단단히 밀어. 두 번째 수컷 루어 콘 커넥터가 튜브의 돌출 부위에 연결됩니다.
분무기에서 수컷 콘으로 돌출 된 CE 모세관으로 인터페이스 부분을 이동한 다음 남성 콘과 분무기 모세관의 넓은 부분을 통해 모세관을 조심스럽게 삽입하십시오. 필요한 경우, 좌측 남성 루어를 풀고, 연결된 튜브로 루어를 필요한 위치로 이동하고 다시 설치하여 돌출 모세관의 길이를 조정합니다. 상부 여성 3방향 루어 커넥터는 남성 콘에 단단히 맞아야 합니다.
설정이 완료되면 ICP-Ms로 진행됩니다. 철 3종과 철철 2종의 레독스 종을 위해 보정 곡선이 만들어졌습니다. 검출의 한계는 철 2리터당 3.1 마이크로그램, 철3리터당 3.2 마이크로그램, 선형성은 리터당 최대 150마이크로그램으로 입증되었다.
SH-SY5Y 세포 리세이테의 분석은 다소 높은 전도성 으로 인해 철 레독종에 대한 약간 느린 이동을 보였다. 철 3과 철 2의 측정 된 농도는 리터 당 330 마이크로 그램과 리터 당 84 마이크로 그램, 각각했다. 그 결과 철은 2 대 3 비율로 0.25입니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 장착 된 인터페이스와 분무기 모세관과 관련된 적절한 위치를 통해 돌출 된 CE 모세관의 신중한 삽입입니다. 여기서 제시된 방법은 철 의존분자 공정에 대한 통찰력을 심화하는 유망한 도구가 될 수 있다. 철 2 플러스, 철 3 플러스 정량화가 신경 퇴행성 및 암 질환의 맥락에서 철 매개 치명적인 손상의 위험에 조직을 정확히 파악하는 잠재적 인 바이오 마커 역할을 할 수 있는지 여부를 검증하기 위해 신중하게 설계된 연구가 필요합니다.
개요
본 연구는 모세관 전기영동-유도결합 플라즈마 질량분석법(CE-ICP-MS)을 이용한 새로운 철 산화환원 상태 분석법을 제시합니다. 이 기술을 통해 다양한 조직 및 생체 시료 내 철 산화환원 종에 대한 신속한 분석과 낮은 정량 한계를 달성할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 분석화학
배경
- 과도한 철은 산화 스트레스와 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.
- 이러한 과정을 이해하기 위해서는 2가 철(ferrous iron)과 3가 철(ferric iron)의 정량적 측정이 매우 중요합니다.
- 페로토시스(Ferroptosis)는 철 과부하와 연관된 세포 사멸의 한 형태입니다.
- 기존의 방법들은 철 정량 분석에 필요한 충분한 속도와 민감도를 제공하지 못할 수 있습니다.
연구 목적
- 철 산화-환원 종을 정량화하기 위한 신속하고 민감한 방법을 개발합니다.
- 신경퇴행성 질환 및 암 질환에서 철 정량화의 영향을 조사합니다.
- 조직 손상의 바이오마커로서 철 정량화의 가능성을 검증합니다.
사용된 방법
- 모세관 전기영동-유도결합 플라즈마 질량분석법(CE-ICP-MS).
- 자체 제작 인터페이스 조립을 포함한 시료 준비.
- 2가 철 및 3가 철 산화환원 종에 대한 검정 곡선.
- 철 농도 측정을 위한 SH-SY5Y 세포 용해물 분석.
주요 결과
- 검출 한계는 2가 철의 경우 3.1 µg/L, 3가 철의 경우 3.2 µg/L였습니다.
- 최대 150 µg/L까지 선형 응답이 관찰되었습니다.
- 측정된 농도는 3가 철이 330 µg/L, 2가 철이 84 µg/L였습니다.
- 2가 철 대비 3가 철의 비율은 0.25로 나타났습니다.
결론
- 개발된 방법은 철 의존적 분자 과정을 연구하는 데 유망합니다.
- 정확한 측정을 위해서는 세심한 설정이 매우 중요합니다.
- 질환 상황에서 철 정량화의 역할을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
철 산화환원 종(Fe(II)/Fe(III))의 정확한 정량 분석은 신경퇴행성 및 종양학적 상황에서 철로 매개되는 세포 손상을 이해하는 데 매우 중요합니다. CE-ICP-MS 방법은 복잡한 생물학적 매질에서 이러한 종을 신속하고 민감하게 검출할 수 있게 하여, 산화 스트레스 및 페로토시스 경로와 관련된 치료 가설의 초기 기전적 리스크 제거를 지원합니다. 이러한 역량은 발견 단계 프로그램의 포트폴리오 분류를 위한 정량적이고 산화환원 특이적인 바이오마커를 제공함으로써 타겟 검증을 강화합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 질환 모델에서 치료 가설로서 철 산화환원 항상성의 조사를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 철로 유도된 세포 사멸의 기전적 경로를 명확히 하기 위한 산화환원 특이적 정량 읽기 값을 제공합니다.
- 예측적 가치: Fe(II)/Fe(III) 비율을 산화 스트레스 및 페로토시스 결과와 상관시켜 바이오마커 기반의 타겟 신뢰도를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 낮은 검출 한계(3.1–3.2 µg/L)와 최대 150 µg/L까지의 선형 응답을 제공하여, 희석된 용해물 및 생체 유체 내에서 신뢰할 수 있는 정량을 가능하게 합니다.
- 재현성: 3% 미만의 이동 시간 정밀도와 2.2–3.5%의 측정 정밀도를 보여주어, 일관된 화합물 스크리닝 결과를 보장합니다.
- 확장성: 전도도-pH-스태킹을 통해 분리 효율을 저하시키지 않으면서 더 높은 주입 부피를 허용함으로써, 분석 검증을 위한 처리량을 향상시킵니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: SH-SY5Y 용해물 및 뇌척수액(CSF) 내 철 산화환원 종의 측정을 가능하게 하여, 발견 단계와 질환 관련 시스템을 연결합니다.
- 리스크 조정 결정: 회수 정확도(97–105%)와 표준 첨가법 확인을 통해 go/no-go 기준에 필요한 신뢰할 수 있는 바이오마커 정량을 지원합니다.
- 기전적 리스크 감소: 전임상 모델에서 Fe(II) 및 Fe(III) 종의 직접적인 판독값을 제공함으로써 철 조절 전략의 평가를 용이하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
CE-ICP-MS 방법은 표적 검증 및 리드 물질 발굴 단계, 특히 철 의존성 산화 스트레스와 관련된 경로에 유용한 산화환원 특이적 정량 데이터를 제공함으로써 초기 발굴 워크플로우에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 종 분해 정량 분석을 통해 신경퇴행성 및 암 모델에서의 철 조절 장애에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 낮은 정량한계(LOQ)와 높은 정밀도로 분석 표준화를 가능하게 하여, 철 산화환원 상태에 미치는 화합물 효과의 신뢰성 있는 평가를 용이하게 합니다.
- 분석: 피크 면적 기반의 정량적 결과와 이동 시간 지표를 생성하여 조건 간 비교 및 경향성 분석을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 세포 용해물 및 생체 시료 내의 측정 가능한 철 종을 통해 전임상 검증과 연결함으로써 바이오마커 일치화를 지원합니다.
- 기업적 재활용: ICP-MS를 통한 플랫폼 독립적 검출은 철 이외의 여러 원소 표적으로의 재사용을 가능하게 하여 장기적인 유용성을 높입니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 산화 스트레스 및 페로토시스(ferroptosis)에 대한 Fe(II)와 Fe(III)의 기여도를 구분함으로써 메커니즘적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 적층 강화 분리 및 DRC 모드 간섭 감소를 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 병리적 철 상태와 연관된 정량적 산화환원 바이오마커를 제공함으로써 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 질병 관련 모델 내 철 종 분화에 미치는 영향을 기반으로 화합물의 위험 조정 우선순위 선정이 가능해집니다.
구현 시 고려 사항
- 모세관 전기영동 설정 및 ICP-MS 최적화, 특히 NH3 반응 가스를 이용한 DRC 모드에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 신호 무결성을 유지하고 산화환원 전위 변화를 방지하기 위해 CE 모세관과 네뷸라이저 사이의 안정적인 인터페이스 조립이 중요합니다.
- 재현성을 확보하기 위해 배경 전해질(20 mM HCl) 및 전압(+25 kV) 파라미터에 대해 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 전도도가 가변적인 시료(예: CSF)의 경우, 피크 식별 확인을 위해 표준물질 첨가법을 사용한 적응 과정이 필요합니다.
- 실질적 제한 사항: 시료 매질 효과에 대한 분석법의 민감도로 인해, 복잡한 생체 유체 내에서 정확한 정량을 위해서는 희석 또는 표준화가 필요합니다.
