Name: 시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 세균 육식 동물 Bdellovibrio 박테리오보루스의 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 Bdellovibrio bacteriovorus의 복잡한 육식 생활 주기를 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 프로토콜은 다양한 세균 균주에 적용 가능합니다.

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이 연구는 국립 과학 센터 보조금 Opus에 의해 지원 되었다 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.

1. 현미경 분석을 위한 B. 박테리오보루스 용액의 준비
<ol><li>250mL 플라스크에서 신선한 24h B. 박테리오보루스 배양의 1mL를 결합하여 공동 문화를 설정합니다(예: HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) 및 야간 먹이 배양(예: 대장균 S17-1 pZMR100)의 3mL, 50mL의 Ca-HEPES 버퍼(25mM HEPES, 2mM CaCl2 [pH = 7.6]) 항생제로 보충하였다(50).</li>
	<li>200 rpm에서 흔들어 30 °C에서 24 시간 동안 공동 문화를 배양합니다.</li>
	<li>먹이 세포가 액체 장착 위상 대비 현미경 검사법에 의해 완전히 제거되어 있는지 확인하십시오. 이 시점에서, 수많은 운동성 공격 단계 B. 박테리오보루스 세포가 존재해야 하며, 대장균 세포 나 bdelloplast가 보이지 않아야합니다.</li>
	<li>0.45 μm 모공 크기 필터를 통해 B. 박테리오보루스 배양을 필터링하여 나머지 숙주 세포를 제거합니다. 약탈 세포(0.3-0.5 μm x 0.5-1.4 μm)는 0.45 μm 모공을 자유롭게 관통하는 반면, 숙주 세포는 필터 표면에 유지됩니다.</li>
	<li>약탈 세포를 수집하기 위해 50mL 원판 튜브에서 2469 x g 및 30 °C에서 20 분 동안 여과물을 회전시하십시오. B. bacteriovorus 펠릿을 Ca-HEPES 버퍼 3mL(약 0.2의 최종 OD600)에서 재중단하고 30°C 및 200 rpm에서 30분 동안 배양한다.</li>
</ol>2. B. 박테리오보루스 침공을 위한 숙주 세포 준비
<ol><li>숙주 균주의 단일 콜로니를 사용하소서(대장균 S17-1 pZMR100은 YT 배지의 10mL를 접종하기 위해 다양한 세포 크기로 인해 권장됩니다).0.8% Bacto 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl [pH = 7.5]) 항생제로 보충된, 필요한 경우 (여기, 50 μg/mL 카나마이신).E. coli 배양 세포는 37°C 및 180 rpm에서 하룻밤 사이에.</li>
	<li>1박 2mL의 대장균 배양(OD600 ~3.0)을 실온(RT)에서 2mL 시험관및 원심분리기(2469 x g)로 5분 간 전송한다. 200 μL의 Ca-HEPES 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
</ol>3. 현미경의 설정 (재료의 표 참조)
<ol><li>사용하기 전에 100x 오일 침지 목표치를 30°C로 미리 데우며 1시간 이상. 이 단계는 실험 중에 포커스를 유지하는 오류를 방지하는 데 필요합니다.</li>
	<li>현미경 및 현미경 자동화를 모두 켭니다. 제어 소프트웨어를 초기화하고 필요에 따라 브라이트필드/DIC/위상 대비 및 형광 이미지를 획득하기 위한 적절한 필터를 선택합니다(여기: BF 이미지, GFP/mCherry 폴리크로믹 필터, mCherry 및 GFP용 방출/발출).</li>
</ol>4. 시간 경과 형광 현미경 검사법을 위한 레이아웃 의 조립
<ol><li>200 mg의 낮은 형광 분자 등급아가로즈를 20mL의 Ca-HEPES 버퍼(1% 최종 아가로즈 농도)와 혼합하고 아가로즈를 전자레인지에 녹입니다. 배치가 고화된 후 여러 번 다시 사용할 수 있으므로 가열 단계를 반복하기만 하면 됩니다.</li>
	<li>35mm 유리 바닥 접시 (재료의 표)에 녹은 아가로즈3 mL을 붓습니다. 아가로즈가 굳어지도록 합니다.</li>
	<li>실험실 마이크로 주걱을 사용하여 아가로즈 패드의 중앙 기둥을 방해하지 않고 35mm 접시에서 아가로즈 패드를 조심스럽게 제거하십시오. 패드 하단쪽을 위로 뒤집어 페트리 접시커버(그림 2)에놓습니다.</li>
	<li>농축 된 대장균 현탁액 5 μL을 뒤집힌 패드 위에 놓고 접종 루프를 사용하여 중앙 극에 세포를 확산시하십시오. 농축 된 B. 박테리오보루스 서스펜션 (OD600 ~0.2)을 대장균-코팅 표면에 5 μL을 추가합니다. 셀을 퍼뜨리지 마십시오.</li>
	<li>아가로즈 젤을 35mm 유리 바닥 접시(아래쪽을 향하고 있음)에 빠르게 반납한 다음 뚜껑으로 덮습니다. 필요한 경우 접시에 대한 천을 부드럽게 눌러 기포를 제거하십시오.</li>
</ol><img alt="박테리아 실험 설정 다이어그램; 페트리 접시, 대장균, B. 박테리오보루스, 도립 현미경." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 실험 워크플로우의 회로도 묘사. 아가로즈 패드는 35mm 접시에서 제거되고 뒤집혀 아래쪽이 위쪽을 향합니다. 약탈 세포의 신선한 현탁액과 먹이 세포의 하룻밤 문화는 "바닥"측면을 코팅하는 뒤집힌 패드에 배치됩니다. 그런 다음 아가로즈 패드를 원래 방향으로 뒤집어 현미경 챔버의 반전 된 현미경 단계에 장착되는 35mm 접시에 다시 배치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 시간 경과 형광 현미경 검사법의 전도
<ol><li>실험 과정에서 움직이지 않도록 페트리 접시 홀더에 35mm 접시를 놓습니다. 35mm 접시의 바닥뿐만 아니라 목표에 침지 오일 (1.518 굴절률)의 한 방울을 놓습니다.</li>
	<li>현미경 챔버에서 반전 된 현미경의 단계에 홀더를 마운트.</li>
	<li>현미경 제어 소프트웨어에서 옵션을 설정하여 시간이 지남에 따라 여러 단계 위치에서 여러 이미지를 수집합니다.<ol>
<li>배율(100x) 및 다색색 렌즈(GFP/mCherry)를 설정합니다. 눈조각과 브라이트필드(BF)를 사용하여 초점 평면을 찾아 포인트 목록 관리자를 엽니다.</li>
		<li>마크를 클릭하여 스테이지를 이동하고 현미경 소프트웨어의 각 위치에 대한 좌표를 저장하여 최소 10개의 관심 위치를 선택합니다. 포토표백및 광독성을 방지하기 위해 서로 가까이 있는 위치를 피하십시오. 접점에서 카메라 밸브를 모니터로 돌리고 초점 평면을 설정하고 포인트 목록 관리자의 교체 점 버튼을 클릭하여 각 점을 보정합니다.</li>
		<li>실험 디자이너를 열고 각 탭의 모든 실험 매개 변수를 다음과 같이 설정합니다.<ol>
<li>Z 스태킹 상자의 표시를 해제합니다.</li>
			<li>형광 채널을 선택하고 최적의 조명 설정을 설정합니다. 여기에, 다음과 같은 설정이 사용되었다 : mCherry 채널, mCherry 필터 세트 (EX575/25; EM625/45), 50% 강도 및 200ms 노출 시간; GFP 채널의 경우 GFP 필터 세트(EX475/28; EM525/48), 50% 강도, 80 ms; 그리고 BF 이미지, POL 채널, 5 % 강도 및 50 ms.</li>
			<li>이미지 획득과 실험의 총 시간 사이의 간격을 선택합니다. 여기서, 실험의 10시간 동안 5분 간격이 수행되었다.</li>
			<li>선택한 위치에 대한 포커스 유지 관리를 활성화합니다(UltimateFocus 확인란으로 초점 유지 를 표시하여 여기에 사용되는 시스템의 경우).</li>
			<li>이미지 파일을 자동으로 저장해야 하는 데이터 폴더를 선택합니다.</li>
			<li>현미경 소프트웨어 제어의 모든 설정을 다시 확인한 다음 시간 경과 실험을 시작합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험의 첫 번째 시간 후에도 모든 스테이지 위치가 여전히 초점이 맞추어지고 있는지 확인합니다. 필요한 경우 이미지 수집 사이의 시간 간격 동안 초점을 조정합니다.</li>
	<li>시간 경과 실험이 완료되면 페트리 접시를 제거하고 생물 안전 프로토콜에 따라 아가로즈 패드로 35mm 접시를 활용하십시오. 참고: 5.2단계 이후의 모든 하위 단계는 델타비전 엘리트 사용자에게 만성됩니다. 다른 시스템을 사용하는 연구원은 개별 시스템에 따라 설정을 조정해야 합니다.</li>
</ol>6. 피지 소프트웨어를 사용하여 시간 경과 이미지와 영화의 세대의 처리
<ol><li>실험 데이터를 피지 소프트웨어가 탑재된 컴퓨터로 전송합니다. 피지 프로그램을 실행하고 파일을 사용하여 이미지를 엽니 다 | 이미지 파일을 열고 피지로 떨어뜨리기만 하면 됩니다.</li>
	<li>바이오 포맷 가져오기 옵션에서스택 보기 옵션에서 하이퍼스택이 있는 뷰 스택을 선택하고 색상 옵션에서 복합 색상 모드를 클릭하고 자동 배율을 표시합니다.</li>
	<li>이미지 스택을 스크롤하여 실험 과정에서 셀과 bdelloplasts가 포커스를 유지했는지 여부를 평가합니다. DnaN-mNeonGreen의 녹색 형광 반점이 성장 단계 전반에 걸쳐 bdelloplasts 내부의 Bteriovorus 세포 내에 존재하는지 확인하고 약탈 수명 주기의 모든 단계를 시각화 할 수 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>특정 B. 박테리오보루스 셀/bdelloplast를 분석하려면 피지 메뉴(직사각형,Rectangle 타원형, 다각형 또는 프리핸드)의 선택 도구를 사용하여 표시하십시오. 이미지를 사용하여 선택한 영역을 복제 | 복제하거나 Ctrl + 시프트 + D를사용하여.</li>
	<li>각 형광 채널의 밝기와 대비를 다음과 같이 조정합니다.<ol>
<li>단일 채널을 선택하려면 이미지를 클릭하여 채널 도구를 엽니다 | 색상 | 채널 도구 또는 Ctrl + 시프트 + Z, 관심의 채널을 선택(채널 1: mCherry, 채널 2: mNeonGreen, 채널 3: 브라이트 필드).</li>
		<li>이미지에서 B&amp;C 메뉴를 열어 형광 채널에서 이미지의 밝기와 대비를 조정 | 조정 | 밝기 /대비 또는 Ctrl + 시프트 + C를클릭하여 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 을 사용하여 스케일 표시줄 추가 | 도구 | 스케일 바. 이미지를 클릭하여 이미지에 시간 스탬퍼를 추가 | 스택 | 시간 스탬퍼.</li>
	<li>수정된 이미지를 저장하려면 파일로 이동 | AS를 저장하고 이미지 시퀀스로 저장하려면 TIFF를 선택, 영화를 생성할 AVI 또는 PNG를 선택하여 현재 프레임의 단일 이미지를 저장합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li>
<li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predatory+Patchwork%3A+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbial+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li>
<li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadowing+the+actions+of+a+predator%3A+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li>
<li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li>
</ol>

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살아있는 항생제로 B. bacteriovorus를 사용에 증가 하는 관심으로 인해, 약탈 수명 주기를 관찰 하기 위한 새로운 도구, 특히 육식-병원 체 상호 작용, 필요. 제시된 프로토콜은 전체 B. bacteriovorus 수명 주기를 추적하는 데 사용되며, 특히 호스트 내부의 성장 중에 실시간으로 사용됩니다. 더욱이, DNA 폴리머라제 III 홀로자임의 형광 태그 베타 클램프를 생성하는 균주의 적용은 B. bacteriovorus의생식 단계 전반에 걸쳐 염색체 복제 진행의 모니터링을 가능하게 하였다.
이 방법의 중요한 단계는 35mm 접시에 레이아웃을 적절하게 준비하는 것입니다. 현미경의 밑에 B. bacteriovorus의 수명 주기를 관찰에 있는 도전은 약탈성장 (호스트 세포로 그밖 그람 음성 세균성 세포를 관련시키는) 및 약탈세포 운동성을 제공하는 조건을 설치하는 것입니다. 효과적인 현미경 관측의 중요한 양...

Bdellovibrio bacteriovorus는 작은 (0.3-0.5 μm x 0.5-1.4 μm) 그람 음성 박테리아는 클렙시엘라 폐렴, 슈도모나스 아에루기노사, , 시글라 플렉너리1,2,3등 유해한 병원균을 포함한 다른 그램 음성 박테리아에 먹이를 주는 작은 박테리아입니다.3 B. bacteriovorus병원체를 죽이기 때문에, 세균감염을 방지하기 위하여 적용될 수 있는 잠재적인 살아있는 항생제로 간주됩니다, 특히 다제 저항하는 긴장에 기인한 그들.
B. 박테리오보루스는 2단계로 구성된 특이한 수명 주기를 나타낸다: 자유로운 살아있는 비복제 공격 단계 및 세포내 생식단계(그림 1). 자유 생활 단계에서 최대 160 μm /s의 속도로 움직이는이 매우 운동성 박테리아는 먹이를 검색합니다. 먹이의 외부 멤브레인에 부착 한 후, 그것은4주변4,5로들어간다. 인터페리플라스믹 생식 단계 동안, B. bacteriovorus는 숙주의 거대 분자를 저하시키고 자신의 성장을 위해 재사용하기 위해 다양한 가수 분해 효소를 사용합니다. 곧 주변을 침공 한 후, 호스트 세포는 죽고 약탈 세포가 염색체를 복제 내부 bdelloplast라는 구형 구조로 팽창. 복제 프로세스는 복제 원점에서시작(oriC)6 염색체의 여러 복사본이 완전히 합성 될 때까지진행 7. 흥미롭게도, 각 염색체의 복제는 세포 분열뒤에 선행되지 않습니다. 대신, 육식 동물은 길고 다중 핵및 필라멘트 세포를 형성하기 위해 길게 합니다. 영양 고갈시 필라멘트는 동기 정화를 거치고 자손 세포는 bdelloplast8에서방출됩니다.
B. bacteriovorus 세균성 감염에 대하여 살아있는 항생제로 이용될 수 있기 전에, 그것의 생활 주기의 중요한 단계, 특히 먹이 안쪽에 그것의 증식과 관련되었던 그 이해하는 것이 중요합니다. B. bacteriovorus의 살아있는 세포 화상 진찰은 복잡한 생활 주기 도중 포식자의 각종 형태및 그것의 먹이 때문에 도전되었습니다. 지금까지, B. bacteriovorus와 그것의 호스트 세포 사이 상호 작용은 주로 전자 현미경 검사법과 스냅 샷 분석에 의해 공부되었습니다22,9,,10,둘 다 한계가 있는, 특히 때 그들은 약탈 수명 주기의 연속적인 단계를 감시하는 데 이용되는 경우에. 이러한 방법은 B. bacteriovorus 세포의 고해상도 이미지를 제공하고 공격 또는 성장 단계 동안 작은 육식 동물의 관찰을 가능하게한다. 그러나, 그들은 두 수명 주기 단계에 걸쳐 단일 B. bacteriovorus 세포의 추적을 허용하지 않습니다.
여기에 제시된 것은 시간 경과 형광 현미경 검사법(TLFM)을 사용하여 B. bacteriovorus의전체 수명 주기를 모니터링하기 위한 포괄적인 프로토콜이다. 아가로즈 패드로 구성된 시스템은 세포 이미징 접시와 함께 사용되며, 이 에 고정된 먹이 세포는 보엽성형을 형성할 수 있는 동안 약탈세포가 아가로즈 패드 아래에서 자유롭게 이동할 수있다(도 2). 이러한 설정은 대장균과 B. 박테리오보루스의특정 균주에 따라 제조되지만, 프로토콜은 사용자의 개별 균주에 맞게 쉽게 변경될 수 있습니다(예: 다른 선택 마커, 다른 형광구와 융합된 단백질 등).
이 경우, 공격 단계에서 B. bacteriovorus를 시각화하기 위해, 특정 균주(HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry)는 세포질 단백질, PilZ(요청 시 실험실에서 사용가능)의형광태그 버전을 표현하는 것으로 구성되었다. 이 균주는 추가로 DNAN (β 슬라이딩 클램프), DNA 폴리머라제 III 홀로효소의 하위 단위, 형광 단백질과 융합을 생성합니다. 이것은 그들이 bdelloplasts 내에서 성장으로 약탈 세포 내부를 모니터링하는 지속적인 DNA 복제를 가능하게.
이미지 수집에 사용되는 기술 프로토콜 및 소프트웨어는 특정 제조업체가 제공하는 반전 된 현미경을 참조하지만 (재료의 표참조), 이 기술은 환경 챔버 또는 기타 외부 가열 홀더가 장착 된 모든 반전 현미경에 대해 조정 될 수 있으며 시간 경과 이미징이 가능합니다. 데이터 분석의 경우 사용자는 개별 출력 형식과 호환되는 사용 가능한 소프트웨어를 선택할 수 있습니다.
<img alt="Bdellovibrio 수명 주기 다이어그램; 공격 및 생식 단계; 박테리아 침입 과정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 도 1: 대장균에서 항균의 생물 주기가 숙주 세포로서. 공격 단계 동안, 자유 수영 B. 박테리오보루스 세포는 호스트 대장균 세포에 검색하고 부착합니다. 침공 후, 약탈 세포는 먹이의 주변에 국한되어 숙주 세포의 모양을 변경하고 bdelloplast를 형성합니다. 생식 단계는 bdelloplast 형성으로 시작됩니다. 약탈 세포는 먹이 세포를 소화하고 자신의 구조를 구축하기 위해 간단한 화합물을 재사용합니다. B. 박테리오보루스는 호스트의 주변지 에서 긴 단일 필라멘트로 성장합니다. 먹이 세포의 자원이 소진되면 B. 박테리오보루스 필라멘트는 동기적으로 패혈증을 형성하고 자손 세포를 형성합니다. 자손 세포가 기조세포를 개발한 후, 그들은 bdelloplast를 lyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>원심분리기</td><td>MPW MED. INSTRUMENTS</td><td>MPW-260R</td><td>Rotor ref. 12183</td></tr><tr><td>Certified분자생물학 Agarose</td><td>BIO-RAD</td><td>161-3100</td><td>저형광 아가로스 아가로스 패드용</td></tr><tr><td>아가로</td>스 <td>Fiji ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>오픈 소스 이미지 처리 패키지</td></tr><tr><td>Glass Bottom Dish 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81218-200</td><td>코팅되지 않은 유리</td></tr><tr><td>현미경</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Microtiter Stage, 궁극의 초점 레이저 모듈, DV Elite CoolSnap HQ2 카메라, SSI 어셈블리 FP DV, 키트 obj. Oly 100x 오일 1.4 NA, 프리즘 Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td></tr><tr><td>Minisart 필터 0.45 &마이크로; m</td><td>Sartorius</td><td>16555----------K</td><td>셀룰로오스 아세테이트, 멸균, 루어 잠금 배출구</td></tr><tr><td>시작 SoftWoRx</td><td>GE</td><td></td><td>제조업체 제공 이미징 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 세균 육식 동물 bdellovibrio 박테리오보루스의 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus는 유해한 병원체를 포함하여 그밖 그람 음성 박테리아를 죽이는 작은 그람 음성, 의무 약탈 박테리아입니다. 따라서 살아있는 항생제로 간주됩니다. 살아있는 항생제로 B. bacteriovorus를 적용하려면, 그것의 복잡한 수명 주기의 주요 단계를 이해하는 것이 첫째로, 특히 먹이 안쪽의 증식. 지금까지, 그것은 실시간으로 약탈 생활 주기의 연속 단계를 모니터링 하는 도전 하고있다. 여기에 소개되는 것은 B. bacteriovorus의전체 수명 주기의 실시간 이미징을 위한 포괄적인 프로토콜입니다, 특히 호스트 내부의 성장 도중. 이를 위해 아가로즈 패드로 구성된 시스템은 세포 이미징 접시와 함께 사용되며, 이 요리는 고정된 먹이 세포가 bdelloplasts를 형성할 수 있는 동안 약탈 세포가 아가로즈 패드 아래에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. DNA 폴리머라제 III의 형광 태그 β-서브유닛을 생성하는 균주의 적용은 B. bacteriovorus 수명 주기의 재생 단계에서 염색체 복제를 모니터링할 수 있게 한다.

설명된 TLFM 기반 시스템은B.bacteriovorus의 개별 세포가 제 시간에 추적할 수 있게하고(도 3, Movie 1)복잡한 약탈 수명 주기의 각 단계에 대한 귀중한 정보를 제공한다. PilZ-mCherry 융합은 전체 약탈 세포가 공격 단계뿐만 아니라 성장 단계의 초기 단계에 표시될 수 있게한다(도 3). 공격에서 복제 단계로의 전환은 호스트 bdelloplast 형성뿐만 아니라 DnaN-mNeonGreen 형광 포시(그림3)에의해 표시된 replisome(복제 기계)의 출현에 의해 시각화되었다.
앞서 설명한 바와 같이, 침범세포극(pili-pole)7에서replisome가 조립되었고, 번식상이 진행됨에 따라 성장하는 <em...

여기에 제시된 것은 아가로즈 패드 및 세포 화상 진찰 접시와 함께 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 약탈적인 박테리아 Bdellovibrio bacteriovorus의 완전한 수명 주기의 감시를 기술하는 프로토콜입니다.

시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 세균 육식 동물 Bdellovibrio 박테리오보루스의 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

라이브 셀 Bdellovibrio bacteriovorus 화상 진찰은 이 약탈한 박테리아의 복잡한 생활 주기 때문에 도전적이되었습니다. 우리의 프로토콜은 실시간으로 완전한 수명 주기의 단계를 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 특정 균등균균에 근거하더라도, 병원성 긴장을 포함하여 세균성 긴장의 각종에 쉽게 적응될 수 있습니다.B.bacteriovorus 문화를 설정하려면, 신선한 24 시간 배양 박테리아의 1 밀리리터와 하룻밤 먹이 문화의 세 밀리리터를 결합 250 밀리리터 칼슘 히피 버퍼의 50 필요에 따라 항생제로 보충. 섭씨 30도에서 24시간 배양하고 분당 200개의 회전을 한 후, 먹이 세포가 액체 장착 얼굴 대비 현미경 검사법에 의해 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 수많은 다중 공격 단계B.bacteriovorus 세포가 존재해야 하며 E.coli 세포 또는 bdelloplast를 볼 수 없어야 합니다.B.bacteriovorus 배양을 0.45 마이크로미터 모공 크기 필터를 50 밀리리터 원내 튜브로 변형시키고 원심분리기의 여과를 중단합니다. 그런 다음 B.bacteriovorus 펠릿을 칼슘 히피 버퍼 의 3 밀리리터에서 약 0.2의 600 나노미터에서 최종 광학 밀도로 다시 중단하고 30 분당 30도 및 200 회전에서 박테리아를 배양합니다. 숙주 세포를 준비하려면 숙주 균주에서 단일 콜로니를 선택하고 10 밀리리터의 YT 배지에서 박테리아를 숙인하여 1박 잠식에 필요한 항생제로 보충하고 분당 180개의 회전을 한다.다음 아침 은 2 밀리 리터 테스트 튜브와 원심 분리에 의해 세포를 펠릿하룻밤 문화의 두 밀리리터를 전송. 그런 다음 칼슘 히피 버퍼의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 먹이 세포가 단일 세포 수준에서 분리되어 있는지 확인하기 위해 원심 분리 후 전체 셀 펠릿을 완전히 다시 중단하는 것이 매우 중요합니다.시간 경과 형광 현미경 검사법을 위해 세포를 준비하려면 먼저 200 밀리그램의 낮은 형광 분자 등급아가로즈를 20 밀리리터의 칼슘 히피 버퍼와 혼합하고 파수기로 녹입니다. 녹인 아가로즈 3밀리리터를 35mm 유리 바닥 접시에 붓고 아가로즈가 고화되도록 합니다. 실험실 마이크로 주걱을 사용하여 패드의 중앙 기둥을 방해하지 않고 접시에서 아가로즈 패드를 조심스럽게 제거하고 패드 바닥을 페트리 접시 덮개에 올려 놓습니다.농축 된 숙주 세포 현탁액 5 개를 뒤집힌 패드에 놓고 접종 루프를 사용하여 중앙 극에 세포를 퍼뜨리게합니다. 다음으로 농축된 B.bacteriovorus 현탁액 5개에 퍼지지 않고 주전자 코팅 표면에 마이크로리터를 넣고 젤을 35밀리리터 유리 바닥 접시 상면으로 빠르게 되돌려 줍니다. 그런 다음 뚜껑으로 접시를 덮습니다.공동 배양의 시간 경과 플로레시네이션 현미경 검사용은 접시를 실험 과정에서 움직이지 않도록 페트리 접시 홀더에 놓고 1방울의 침수 오일을 반전 된 현미경 목표에 놓고 접시 바닥에 한 방울을 놓습니다. 반전된 현미경 챔버 내의 현미경 단계에 홀더를 장착하고 현미경 소프트웨어에서 배율을 100X로 설정하고 GFP및 Mcherry에 다크롬 렌즈를 설정합니다. 브라이트필드에서 iPS를 사용하여 초점 평면을 찾아 무의미한 관리자를 엽니다.스테이지를 이동하고 표시점 버튼을 사용하여 관심 있는 위치가 최소 10개 이상의 좌표를 저장합니다. iPS에서 모니터로 카메라 용을 전환합니다. 초점 평면을 설정하고 무의미한 교체 점 버튼을 클릭하여 관리자에게 각 점을 보정합니다.실험 디자이너를 열고 질병 스태킹 상자를 표시 해제합니다. 적절한 형광 채널과 최적의 제거 설정을 선택하고 이미지 수집과 실험의 총 시간 사이의 간격을 설정합니다. 선택한 위치에 대한 포커스 유지 관리를 활성화하고 이미지 파일을 자동으로 저장해야 하는 데이터 폴더를 선택합니다.현미경 소프트웨어 제어의 모든 설정을 다시 확인하고 시간 경과 실험을 시작합니다. 실험의 첫 번째 시간 후에도 모든 스테이지 위치가 여전히 집중되어 있는지 확인합니다. 시간 경과 실험이 완료되면 페트리 접시를 제거하고 적절한 생체 안전 프로토콜에 따라 아가로즈 패드로 35mm 접시를 폐기하십시오.타임랩스 이미지 데이터의 처리를 위해 실험 데이터를 피지 소프트웨어가 탑재된 컴퓨터로 전송하고 피지에서 이미지를 엽니다. 바이오 포맷 가져오기 옵션에서 하이퍼스택이 있는 뷰 스택을 선택합니다. 복합 색상 모드에서는 자동 축척을 선택합니다.이미지 스택을 스크롤하여 세포와 bdelloplasts가 실험 과정에서 포커스를 유지했는지 여부를 평가합니다. DNA와 mNeon 녹색에서 녹색 형광 반점이 성장 단계 전반에 걸쳐 bdelloplasts 안쪽에 B.bacteriovorus 세포 안에 존재하는지 그리고 약탈 수명 주기의 모든 단계가 시각화될 수 있는지 여부. 특정 B.bacteriovorus 세포 bdelloplast를 분석하려면 선택 도구를 사용하여 관심 있는 셀을 표시합니다.그런 다음 선택한 영역을 복제합니다. 중복된 이미지에서 프로세스를 클릭하고 매끄럽고 각 형광 채널에 대해 이미지, 색상, 채널 도구를 클릭하고 관심 있는 채널을 선택합니다. 그런 다음 이미지, 조정 및 밝기 대비를 클릭하여 각 채널에서 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.축척 막대를 추가하려면 분석, 도구 및 배율 막대를 선택합니다. 이미지에 타임스탬프를 추가하려면 이미지, 스택 및 시간 스탬퍼를 클릭합니다. 수정된 이미지를 저장하려면 TIF를 선택합니다.데이터를 이미지 시퀀스로 저장하려면 AVI가 현재 프레임의 단일 이미지를 저장하기 위해 동영상을 생성하거나 PNG를 생성합니다. 이 시간 경과 형광 현미경 기반 시스템은 개별 B.bacteriovorus 세포의 실시간 추적을 허용하고 복잡한 약탈 수명 주기의 각 단계에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 알약 mCherry 융합은 전체 약탈 세포가 성장 단계의 초기 단계에서뿐만 아니라 공격 단계뿐만 아니라 공격 단계에서 표시 될 수 있습니다.공격에서 복제 단계로의 전환은 호스트 bdelloplast 형성뿐만 아니라 replisome의 모양으로 도포할 수 있습니다. 레플리솜은 침입 세포극에서 조립되며, 번식상이 진행됨에 따라 성장하는 B.bacteriovorus 필라멘트 내에서 하나 이상의 replisome를 관찰할 수 있다. 염색체의 여러 복사본이 합성되면 복제가 종료됩니다.마지막으로, 다핵 필라멘트는 정화를 거치고 자손 세포는 bdelloplast에서 방출됩니다. B.bacteriovorus 세포는 적극적으로 그들의 먹이를 검색하기에 충분한 물질이어야하며 전체 세포 밀도는 약탈 세포 부착을 허용 할 만큼 충분히 높아야합니다. 이 플랫폼은 다중 약물 내성 병원균을 포함하는 실험에서 유용할 수 있으며 인간 및 수의학에서 살아있는 항생제로 B.bacteriovorus의 유전 공학의 개선을 용이하게할 수 있습니다.

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연구

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Biology

생물학

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

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이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.

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근원: Heering, J., 외., 세포 분화 유도 및 Vibrio parahaemolyticus 수영 및 떼 세포의 단일 세포 이미징. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 형광 이미징을 위해 Vibrio parahaemolyticus 콜로니에서 군집 세포를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 박테리아는 수영 세포에서는 단극성으로, 길쭉한 군집 세포에서는 양극성으로 국한되는 형광단 태그 단백질을 발현하도록 유전자 조작되어 시각적 분화를 가능하게 합니다. 현미경 슬라이드 위에 아가로스 패드를 준비하고, 그 위에 콜로니 섹션을 배치하고 제거하여 부착 세포를 남긴 다음 이미징을 위해 커버슬립으로 덮습니다.

이미징을 위한 Vibrio parahaemolyticus Swarmer 세포의 준비

출처: Schumacher, D., 그리고 Sogaard-Andersen, L. 느리게 성장하는 사회성 박테리아 Myxococcus xanthus 의 완전한 영양 세포 주기의 형광 생세포 영상. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 박테리아 세포 분열 중 형광 태그된 염색체 기원을 추적하기 위해 생세포 영상을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 타임랩스, 위상 차이 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 염색체 분리 역학을 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 염색체 분리 타임랩스 영상

출처: Makowski, Ł. 외 타임랩스 형광 현미경을 이용한 박테리아 포식자 Bdellovibrio bacteriovorus 의 생세포 영상. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 아가로스 패드 아래 고정된 대장균을 포식하는 Bdellovibrio bacteriovorus의 타임랩스 형광 영상을 시연하여, 박테리아 포식 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 있어 세포 내 복제와 자손 방출을 실시간으로 시각화할 수 있게 합니다.

Bdellovibrio bacteriovorus의 생세포 타임랩스 영상 대장균에 대한 포식

출처: 브조조프스키, R. S. 외 박테리아의 세포 내 세포 내 단백질 위치 및 세포 형태 변화를 조사하기 위한 생세포 형광 현미경. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 박테리아의 형태학적 변화를 실시간으로 시각화하기 위한 생세포 형광현미경을 시연합니다. 이 문서는 실시간으로 고해상도 이미지를 얻기 위한 영상 촬영, 타임랩스 획득, 디컨볼루션 과정을 개괄합니다.

생세포 형광현미경을 이용한 박테리아의 형태학적 변화 영상

스트렙토마이세스는 세포의 생물학적 수단으로 연구하기 실험적으로 어려운 복잡한 생명 주기를 특징으로 합니다. 여기에서는 미세유체 장치에서 스트렙토마이세스 베네수엘라(Streptomyces venezuelae)를 성장시켜 전체 수명 주기의 형광 저속 현미경을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

전체의 형광 시간 경과 영상<em&gt; S. venezuelae</em미세 유체 장치를 사용&gt; 수명주기

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

세균성 세포는 높은 공간 구성 됩니다. 느린 성장 Myxococcus xanthus 셀에이 조직은 시간이 지남에 따라, 여러 세대에 걸쳐 spatiotemporal 고해상도 형광 라이브 셀 이미징에 대 한 설정 개발 되었다. 이 메서드를 사용 하 여 염색체 분리 및 세포 분열에 대 한 중요 한 단백질의 spatiotemporal 역학 결정 수 있습니다.

형광 라이브 셀 이미징의 완전 한 식물 세포의 주기 느린 성장 사회 박테리아 Myxococcus xanthus

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

배우세요 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 Bdellovibrio bacteriovorus의 복잡한 육식 생활 주기를 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 프로토콜은 다양한 세균 균주에 적용 가능합니다.

시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 세균 육식 동물 Bdellovibrio 박테리오보루스의 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징

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