Name: 분자 역학 시뮬레이션을 통해 EGFR 체형 돌연변이를 활성화하는 구조적 효과 해독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: 학습하세요 EGFR 활성화 돌연변이의 구조적 효과를 분자 역학 시뮬레이션으로 분석하는 방법을. Amber 소프트웨어를 활용하여 암 치료 표적 단백질의 역학을 연구합니다.

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이 연구는 핀란드 아카데미 (308317, 320005), 시그리드 주셀리우스 재단과 토르, 조와 펜티 보그 기념 기금, 핀란드 아카데미 (274728, 316796), 핀란드 암 재단, 터키 중앙 대학에서 M.S.J에 보조금에 의해 지원됩니다. M.Z.T.는 정보 및 구조 생물학의 Åbo Akademi 박사 네트워크에 의해 투자됩니다. 우리는 컴퓨팅 자원에 대한 CSC IT 센터와 바이오 센터 핀란드 생물 정보학 네트워크하에 IT 지원을 위한 Jukka Lehtonen 박사에게 감사드립니다. 및 바이오 센터 핀란드 구조 생물학 인프라 네트워크.

참고: MD 시뮬레이션을 사용하여 EGFR 구조에 대한 ΔELREA 및 A702V 돌연변이의 효과를 검사하기 위해 취한 자세한 단계는 다음과 같이 설명합니다.
1. 구조 준비
참고: ΔELREA 돌연변이, 야생형 및 돌연변이 형태의 아포 활성의 구조적 영향을 연구하기 위해, ATP-바운드 활성 및 아포 비활성 EGFR 단조구조물은 다음과 같이 제조된다.
<ol><li>치메라23 시각화 프로그램(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)을 열어 야생형 아포 활성 EGFR 키나제 구조를 준비한다.<a href="https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/" target="_blank">https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a> 파일 메뉴에서 ID로 가져오기 옵션을 클릭하고 단백질 데이터 뱅크(PDB24)데이터베이스를 선택하고 PDB 코드 2GS225(2.8Å 해상도)를 지정합니다.25 PDB는 X선 결정학, 핵 자기 공명 분광기, 극저온 전자 현미경 및 중성자 회절을 포함한 다양한 실험 기술에 의해 해결된 3D 구조물에 대한 저장소입니다.</li>
	<li>EGFR PDB 구조물 1M1426(2.6Å) 및 3W2S 27(1.9Å)에서27 이러한 세그먼트를 이하여 2GS2의 누락된 구조 요소를 구축한다. 이렇게 하려면 1M14 및 3W2S를 열고 도구 → 구조 비교 메뉴에서 매치메이커 옵션을 사용하여 2GS2에 겹쳐줍니다.<ol>
<li>1M14 및 3W2S에서 추가할 세그먼트를 자르기. 1M14 및 3W2S에서 추가될 2GS2 및 원자의 간격 전에 잔류물의 단말 원자를 선택합니다(추가된 세그먼트에 대한 자세한 내용은 표 1참조). 명령줄 형 본드 셀및 히트 입력에 . 이 구조는 템플릿 구조입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.2단계에서 템플릿 구조를 사용하여 EGFR 키나아제 도메인의 ΔELREA 삭제 돌연변이 형태를 구성한다. 템플릿 구조의 시퀀스를 저장하여 ΔELREA EGFR의 FASTA 형식 시퀀스를 생성(좋아하는 → 시퀀스 → 파일 → 저장)다음 잔류 번호 746-750에서 ELREA 시퀀스를 삭제합니다.<ol>
<li>키메라에서 ΔELREA EGFR 서열을 열고 시퀀스 메뉴를 사용하여 2GS2 템플릿 구조의 시퀀스와 정렬합니다. 정렬 창에서 구조 → 모델러(homology)28 옵션을 선택합니다.</li>
		<li>팝업 창에서 2GS2 복합 구조를 템플릿으로 지정하고 돌연변이 시퀀스를 모델링할 쿼리로 지정합니다. 그런 다음 확인을누릅니다. zDOPE 점수(일반적으로 가장 낮은 점수) 및 육안 검사를 기반으로 결과 모델 중 돌연변이 모델을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATP 바인딩 야생 형 EGFR 키나제 구조를 준비하려면 PDB 구조 2ITX29 (2.98 Å)를 주 구조로 사용합니다. 1.2단계에서의 절차에 따라 구조물 2GS625(2.6Å) 및 3W2S를 사용하여 누락된 세그먼트(표 1참조)를 빌드합니다. 텍스트 편집기에서 PDB 파일을 열고 ANP의 N3B 질소 원자를 산소 원자로 변경하여 결과 구조의 리간드 ANP를 ATP로 변환합니다.</li>
	<li>1.1단계에서 명시된 키메라의 1.4단계에서 구조를 엽니다. Mg2+ 이온에 대해 유사한 포지셔닝을 달성하기 위해 PDB 구조 2ITN29 (2.47 Å)로부터 이 구조에 마그네슘 이온을 추가한다.</li>
	<li>1.5단계에서 발생하는 구조로, 단계 1.3에 이어 ΔELREA 돌연변이 형태를 모델링한다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>아포 액티브 EGFR</td>
			<td>아포 비활성 EGFR</td>
			<td>ATP 바인딩 활성 EGFR</td>
		</tr>
<tr>
<td>주 구조</td>
			<td>2GS2</td>
			<td>2GS7</td>
			<td>2ITX</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">누락된 루프를 구축하는 데 사용되는 구조</td>
			<td>1M14 (723-725)</td>
			<td>3W2S (958-984)</td>
			<td>2GS6 (862-865)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3W2S (967-981)</td>
			<td>4HJO (848-850)</td>
			<td>3W2S (990-1001)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 아포 활성, 아포 비활성 및 ATP 바인딩 활성 구조의 복합 모델을 구축하는 데 사용되는 구조입니다. 주요 구조에서 누락된 영역(괄호의 아미노산 범위)은 나열된 구조로부터 시공되었다.
<ol start="7"><li>야생형 아포 비활성 EGFR 키나제 구조를 준비하기 위해, PDB 구조 2GS7 25(2.6Å)를 1단계에서 와 같이 열고 바운드 리간드 및 결정화 수역을 삭제한다.25 누락된 세그먼트를 2GS7(표 1참조)에 추가하여 1.2단계에서 프로시저를 사용하여 구조물 3W2S 및 4HJO 30(2.75 Å)에서 추가합니다.30 최종 비활성 EGFR 구조를 기반으로 1.3 단계에서 프로시저를 사용하여 돌연변이 모델을 준비합니다. 참고: A702V 돌연변이 연구의 경우, EGFR 비대칭 디머 구조는 돌연변이가 디머 인터페이스의 큰 부분을 형성하는 키나아제 도메인의 병실 B 세그먼트에 위치하기 때문에 연구된다. 야생 형 및 A702V 돌연변이 EGFR 구조는 다음과 같이 준비됩니다.</li>
	<li>야생형 비대칭 디머 구조는 PDB 구조 2GS2로 구성되며, 처음에는 단황 형태로 표시됩니다. 비대칭 배열에서 활성제 및 수신기 키나아제가 포함된 생물학적 어셈블리로 변환하려면 키메라에서 2GS2를 (1.1)에서와 같이 열고 도구 → 고차 구조 → 단위 셀 메뉴를 클릭하여 대칭 계산을 수행한다. 2GS2 구조를 선택하고 복사본 만들기를 입력합니다. 마지막으로 대칭 작업으로 인해 이름의 여러 복사본에서 단일 비대칭 디머를 선택하고 저장합니다.</li>
	<li>1.8단계에서 야생형 비대칭 EGFR 구조를 사용하여 치아메라의 로타머스 옵션에 → → 구조 편집 도구를 사용하여 알라닌 702을 바이로 대체하여 A702V 돌연변이를 구축합니다. 참고: 통칭하여, 6개의 단백제 및 2개의 희미한 EGFR 구조물은 각각 ΔELREA 및 A702V 돌연변이 연구 결과를 위해 제조됩니다. 각 구조는 이후 마에스트로프로그램(31)에서 단백질 준비 마법사를 사용하여 시뮬레이션을 위해 처리되고 MD 시뮬레이션은 호박프로그램(32)으로이루어진다.</li>
	<li>가져오기 구조 옵션에 → 파일 → 사용하여 마에스트로의 구조를 엽니다. 그런 다음 단백질 준비 마법사 버튼을 클릭하고 다음을 선택하십시오: 수소 원자 추가, 누락된 사이드 체인 원자를 구축하고, PROPKA를 사용하여 pH 7.0에서 이온화 성 잔류물의 프로토네이션 상태를 결정하고, 수소 본딩을 위한 아스파라진, 글루타민 및 히스티딘 잔류물의 방향을 최적화하고, 마지막으로 구조를 최소화한다.</li>
</ol>2. 시스템 설정
<ol><li>호박색 소프트웨어 패키지에 포함된 도약 프로그램을 엽니다. ff14SB 포스필드(33)와 TIP3P 수분분자(34)를 source leaprc.protein.ff14SB수입한다(출처leaprc.water.tip3p). ATP 바운드 시스템의 경우 ATP35(로드앰버파라름 frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep)에대한 매개 변수도 가져옵니다.35 그런 다음 구조를로드합니다(mol = loadpdb structure.pdb).</li>
	<li>단백질의 표면 원자에서 모든 방향으로 10Å를 확장하는 명시적 TIP3P 물 분자를 가진 옥타히드랄 상자에 구조를솔바테 (solvateoct mol TIP3PBOX 10.0).</li>
	<li>내장 된 시스템(몰 확인)을확인하고 필요한 이온(가산 몰 Na + 0)을추가하여 중화하십시오. 생체 분자 시스템을 충분히 모델링하려면 시뮬레이션 상자에- 원자를추가하여 시스템 염농도를 0.15M(아디온몰 Na+ X, 아디온 몰 Cl-X)로가져와 X가 원하는 염농도 * 물 분자 수 * 물 분자 당 부피 * 물 분자 수 * Avogadro 의 숫자로 대체됩니다.</li>
	<li>후속 프로덕션시뮬레이션(saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd)에대한 입력역할을 하는 토폴로지 및 좌표 파일을 생성하고 저장합니다.</li>
</ol>3. 분자 역학 시뮬레이션
<ol><li>호박색을 사용하여 처음에는 시뮬레이션 시스템을 가장 가파른 하강 사이클500사이클로 지정하고 경사도 에너지 최소화를 우회하여 불리한 구성을 우회합니다. 여러 단계로 최소화를 수행하여 25kcal mol -1 Å -2에서 0 kcal mol-1 Å-2에서 solute 원자에 적용 된 구속을 점차적으로 낮추어 .-1 -2<ol>
<li>최소화 입력 파일에서, min.in,총 최소화 주기(maxcyc = 5000)에 대한 maxcyc 변수를 조정하고, 가장 가파른 하강 알고리즘에 대한 사이클 수를 상태하도록 한다. restraint_wt 변수를 사용하여 구속 마스크 매개 변수에 지정된 솔루트 원자에 구속력을 적용합니다. 그런 다음 다음과 같이 최소화를 실행합니다. $AMBERHOME/빈/샌드러 -O-i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd 참고: 사용된 전략 및 실제 매개 변수는 자신의 기본 설정에 따라 다를 수 있습니다. 자세한 내용 및 지침은 호박 색 매뉴얼 및 웹 사이트<a href="https://ambermd.org/index.php" target="_blank">(https://ambermd.org/index.php)에서</a>찾을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0K에서 300K까지 100ps의 시스템을 가열하여 10kcal mol-1 Å-2 구속을 solute 원자에 설정합니다. 이렇게 하려면 heat.in 입력 파일에서 tempi = 0.0, temp0 = 300.0, dt = 0.002 ps, nstlim = 50000 및 restraint_wt = 10을 설정합니다. 다음 명령으로 가열을 수행하십시오. $AMBERHOME/빈/샌드러 -O-i heat.in -o heat.out -p X.prmtop-c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
</li>
	<li>NPT 앙상블 아래 900 ps에 대한 시스템을 평형화; 상수 수의 원자,온도(temp0 = 300.0)및압력(ntp = 1),베렌센 방법(ntt= 1)으로제어한다. 장거리 정전기 상호 작용을 위해 9Å 거리차단(컷 = 9.0)을설정합니다. 점차적으로 0.1 kcal mol-1 Å-2 (restraint_wt = 0.1)로솔루트 원자 구속을 낮춥니다. 위의 매개 변수를 다음과 같이 설명하는 평형 입력 equil.in 실행합니다. $AMBERHOME/bin/sander-O-i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst
</li>
	<li>구속되지 않은 5ns 시뮬레이션(dt = 0.002 ps, ntslim = 2500000)으로평형을 마무리합니다. $AMBERHOME/bin/sander-O-i equil_final.in-o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
</li>
	<li>온도, 압력, 밀도 및 에너지 값을 검사하여 시스템이 평형화되었는지 확인합니다. $AMBERHOME/빈/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out xmgrace 요약. 온도/밀도/ETOT/에토트/EKTOT
</li>
	<li>100 ns (설정 dt = 0.002 ps,ntslim = prod.in 5000000)에 대한 생산 시뮬레이션을 수행하고 10 ps(ntwx = 5000)마다적합성을 저장합니다. $AMBERHOME/빈/샌드러 -O-i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst
</li>
</ol>4. 분석
<ol><li>육각 검사<ol>
<li>X.prmtop 호박 색 토폴로지 파일과 VMD36에서해당 prod.mdcrd 궤적 파일을 열어 야생 유형 및 돌연변이 EGFR 키나아제 시뮬레이션 중에 샘플링된 적합성을 시각화한다. 편리한 이차 구조 표현을 사용하여 기록된 궤적에서 단백질의 전반적인 구조적 역학을 분석합니다. 촉매 필수 K745 - E762 염교와 같은 관심있는 원자 / 잔류물 사이의 특정 상호 작용을 볼 수 있습니다.</li>
		<li>또는 시뮬레이션 중에 샘플링된 여러 준수를 PDB 형식으로 저장하고 Chimera 프로그램을 사용하여 엽니다. MatchMaker 옵션을 사용하여 초기 또는 중앙값 구조에 구조를 겹쳐줍니다. 초기/중앙분리구구조를 솔리드로 표시하고 나머지 정렬된 구조를 페이드 화이트로 표시합니다. 이 방법을 사용하면 기록된 구조 움직임을 보다 명확하게 시각화할 수 있습니다. 참고 : MDS에서 변형 앙상블의 효과적인 표현 및 처리를위한 제안은 멜빈 등 에서 찾을 수있습니다. 37.</li>
	</ol></li>
	<li>RMSD 및 RMSF 분석<ol>
<li>Cpptraj 프로그램(38)을 사용하여 루트 평균 제곱 편차(RMSD) 및 루트 평균 제곱 변동(RMSF) 계산을 계산하여 단백질의 글로벌 안정성을 분석하고 다양한 구조 단위의 유연성을 검사합니다. rmsd.in 및 rmsf.in 입력 파일에서 RMS 피팅에 대한 참조로서 초기 구조의 백본 원자(RMSD용) 및 Cα 원자(RMSF용)를 나타냅니다. rmsd/rmsf.in 파일에서 호박색 토폴로지파일(parm X.promtop)과해당 궤적 파일(trajinprod.mdcrd)을가져옵니다. 그런 다음 명령 Cpptraj를 실행 -i rmsd / rmsf.in. 분석을 위해 출력 데이터를 플롯합니다.</li>
		<li>또는 Cα 원자 RMSD를 기반으로 각 잔류물을 형성 앙상블과 색상을 정렬합니다. 이렇게 하려면 키메라의 적합성을 열고 매치메이커 옵션에 맞게 조정합니다.<ol>
<li>도구 → 묘사 → 특성으로 렌더링으로 이동합니다. 변형 앙상블및 Cα RMSD의 잔류물을 특성으로 선택하고 확인을 클릭합니다. 순응의 체인 추적은 각각 높고 중간 및 낮은 구조적 안정성의 영역을 반영하는 파란색 → 흰색 → 빨간색으로 칠하게됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>수소 결합 분석<ol>
<li>ATP와 야생형/ΔELREA EGFRs 간의 수소 결합 상호 작용을 분석합니다. 이 작업을 수행하려면 hbond.inCpptraj 스크립트를 준비합니다. 3.5Å 미만의 기증자 수용가 거리와 135°보다 크거나 동일한 결합 각도로 수소 결합을 정의합니다. ATP와 EGFR 간의 수소결합(hbond All nointramol dist 3.5 out nhb.agr avgout avghb.dat)을가진 분자 간 수소 결합에 대해서만 분석을 지정합니다. 스크립트를 Cpptraj-i hbond.in로 실행합니다.</li>
		<li>EGFR 키나아제 활동의 주요 잔류물인 잔류물 K745와 E762 간의 분자 내 상호 작용을 평가하기 위해 이 스크립트를 사용합니다. 이를 위해 K745를 수소결합 기증자로 지정하고 E762를 hbond.in 수소결합 수용자로 지정하고 그에 따라 스크립트를 실행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>원자 간 모니터링 거리<ol>
<li>VMD에서 야생형 및 ΔELREA 아포 EGFRs의 궤적을 열어 K745와 E762 사이의 거리를 측정한다. 마우스 → 레이블 → 본드를 클릭하여 Glu762 및 Nz의 Cδ를 선택합니다. 그래픽 → 레이블이 → 그래프로 그래프를 플로팅하여 시뮬레이션 중 거리를 모니터링 →합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>무료 에너지 계산<ol>
<li>ATP와 야생형/ΔELREA EGFRs 간의 예상 결합 없는 에너지를 계산하고, 야생형/A702V EGFRs의 활성화기와 수신기 키나아제 사이에, 앰버 패키지에서 사용할 수 있는 분자 역학(MM-GBSA)모듈(39)을 사용한다. ΔELREA 연구에서 수용체로서 ATP를 리간드 및 EGFR로 설정합니다. A702V 연구에서는, 수신기 키나아제를 리간드 및 활성기 키나아제수용체로 지정한다.</li>
		<li>먼저 PBRadii 값을 mbondi2로설정하는 도약 프로그램에서 리간드, 수용체 및 리간드 수용체 복합 PDB 파일을 별도로 준비한다. PDB 파일의 경우 가스 위상 황색 토폴로지(.prmtop)를 저장하고 파일을 조정합니다.</li>
		<li>그런 다음, mmgbsa 입력 파일에서, mmgbsa.in, igb = 2, 소금콘 = 0.1을설정한다. 시뮬레이션의 궤적, 준비된 수용체/리간드 앰버 파일 및 MMPBSA.py mmgbsa.in 매개 변수를 사용하여 바인딩 에너지 계산을 실행합니다. $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py-O-i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop-cp complex.prmtop-rp receptor.prmtop-lp ligand.prmtop-y prod.mdcrd-eo output.csv
</li>
		<li>그래프를 플로팅하여 출력 데이터, output.csv를분석합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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이 연구에서 설명된 프로토콜은 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 EGFR 키나아제 도메인의 체세포 돌연변이를 활성화하여 발생하는 로컬 및 글로벌 구조적 변화를 조사하는 데 중점을 둡니다. 야생 형 및 돌연변이 EGFRs의 X 선 결정 구조는 귀중한 구조적 통찰력을 제공하지만 하나 또는 몇 가지 정적 표현을 묘사합니다. 그러나 ErbBs의 생물학적 기능에 내재된 것은 효소적으로 비활성 및 활성 티로신 키나아제 사이의 필요한 전환이며, 키나아제 단량체 사이의 구조와 분자 내 상호 작용 모두에서 동적 변화를 불러일으킨다. MD 시뮬레이션은 따라서 야생형 구조, 도입된 ΔELREA 삭제 돌연변이 및 A702V 돌연변이를 포함하는 EGFR 티로신 키나아제 도메인의 동적 특성을 조사하기 위해 수행되었다. 이러한 시뮬레이션은 구조에서 이러한 돌연변이의 가능성이 있는 역할을 해명하고 티로신 키나아제 도메인의 형성에 미치는 영향이 EGFR 키나아제 활성에서 실험적으로 관찰된 증가로 이어질 수 있는 방법을 밝히는 데 성공했습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 돌연변이의 영향을 평가하기 위해 관련 구조의 사용입니다. 관련 시뮬레이션 입력 구조를 선택하는 한 가지 방법은 정적 3D 구조에서 돌연변이의 위치를 시각화하고 인접한 아미노산 및 구조 단위에 대하여 가능한 충격을 검사하는 것입니다. 이 연구에서는, 예를 들어, A702V EGFR 돌연변이가 비대칭 디머 인터페이스를 형성하는 병수 B 세그먼트에 위치하기 때문에, 단량체가 아닌 시뮬레이션을 위한 디머 구조의 사용은 매우 중요하다. 단명구조의 사용은 수신기 키나아제의 병수막 B 세그먼트를 용매에 노출시키고, 안정화 상호작용으로부터 이를 박탈하고, 돌연변이에 의해 더 큰 소수성 잔류물 및 이솔루신(941)과의 상호작용에 의해 강화되었을 것이다. 더욱이, PDB 파일의 좌표로 표현되는 3D 구조가 반드시 연구에 사용해야 하는 생물학적 관련 구조에 반드시 대응하지는 않는다는 점은 주목할 만하다. 예를 들어 ErbB4, PDB 코드 3BCE의 구조와 함께 PDB 좌표는 트리머에 해당하지만 이는 결정 접점으로 인한 것입니다(이 구조를 시각화할 때 단조체 간의 접점은 거의 볼 수 없습니다). PDB 파일 내의 매트릭스는 결정적 관련 구조를 재구성하는 데 사용될 수 있으며, 이는 원래간행물(42)에보고된 생물학적으로 관련된 3D 구조에 해당하는 사슬을 식별하도록 시각화될 수 있다. 프로토콜의 또 다른 필수 단계는 다른 루프 영역에서 누락된 아미노산을 구축하는 것과 같은 시뮬레이션 입력 구조를 적절히 준비하고, 특히 돌연변이 부근에 위치한 경우를 이에 적절하게 준비하는 것이다. PDB에는 수많은 야생형 EGFR 구조가 존재하지만 제한된 수의 돌연변이 EGFR 구조만 사용할 수 있습니다. 따라서 돌연변이 구조도 모델링해야 합니다. A702V와 같은 단일 잔류물 돌연변이의 경우, 키메라는 잔류물을 돌연변이하는 데 사용하였다. 반면, ΔELREA 삭제 돌연변이의 경우 모델러가 사용되었습니다.
시뮬레이션 입력 파일에 활용되는 다양한 매개변수는 예를 들어, 최소화 주기의 수, 시스템을 한 번에 원하는 온도로 가열하거나 여러 중간 온도를 통해 천천히 가열하거나, 평형 및 생산 시뮬레이션을 위한 기간 - 연구의 분자, 작업의 목표 및 자신의 선호도에 따라 수정될 수 있다. MD 시뮬레이션을 수행하는 동안 입력 파일, 사용 중시뮬레이션 소프트웨어와 관련된 문제 또는 사용자 오류로 인해 발생할 수 있는 오류가 발생하는 것도 일반적입니다. 따라서 오류 메시지를 주의 깊게 검사하여 오류의 원인을 이해하는 것이 매우 중요합니다. 대부분의 시뮬레이션 프로그램에는 사용자가 소프트웨어 개발자와 대부분의 문제를 해결할 수 있는 다른 사용자에게 질문을 제기할 수 있는 메일링 리스트가 있습니다. 또한 사용자 매뉴얼은 가정 및 제한 사항을 포함하여 시뮬레이션 프로토콜의 세부 사항을 이해하는 데 상당한 도움을 제공합니다. MD 시뮬레이션은 분자의 동적 특성을 탐색하는 중요한 도구이지만, 계산 결과는 유효성을 평가하기 위해 다른 정보 소스와 함께 신중하게 평가되어야 한다는 점을 기억하십시오. 가능하면, 연구 하에 단백질에 전문가인 연구원과 함께 일하십시오, 특히 관련 습식 실험실 실험 연구가 이루어지는 경우, 이는 구조적 해석에 대한 결과를 제공하고 가설을 테스트하기 위한 구조적 관찰에 기초하여 이루어질 수 있는 실험을 제안하는 역할을 합니다.
이 연구에서, 프로토콜은 EGFR 키나아제 구조물에 대한 ΔELREA 및 A702V 돌연변이의 동적 구조적 영향을 검사하는 데 효과적이었다. 시뮬레이션에 따르면 ΔELREA는 기능적으로 필수적인 αC 나선을 억제하고 비활성 키나아제에서 안정화된 활성 키나아제로의 형성적 변화를 촉진한다는 것을 밝혔다. 시뮬레이션 결과는 ΔELREA 삭제 돌연변이 및 야생형 EGFR을 갖는 폐암 세포주에 티로신 키나아제 억제제의 효과를 입증한 약물 반응 데이터에 의해 독립적으로 지원되며, 활성 키나아제 형성을 인식하는 약물에 의한 더 큰 억제가 야생형 EGFR12보다ΔELREA에 대해 보고되었다. A702V 돌연변이를 통해 MD 시뮬레이션은 야생 형에 비해 활성기-수신기 키나아제 인터페이스의 안정화가 증가하고 서로에 대한 활성제 및 수신기 키나아제의 높은 친화성을 나타내며, EGFR 키나아제의 활성화된 형태 유지를 함께 지원합니다. 수신기 키나아제의 병수막 B 세그먼트에 위치한 A702V 돌연변이는 활성화 상태의 지속 시간을 연장하는 기능인 활성기 키나아제와의 소수성 상호 작용을 증가시킬 것이다. A702V 돌연변이는 성장 인자의 부재에서 세포 생존을 지원하고 EGFR 돌연변이9에대한 체외 스크리닝에서 확인되었다.

수용체 티로신 키나아제(RTKs)의 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 패밀리(ErbB)는 EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 및 ErbB4/HER4의 4명의 멤버를 포함한다. ErbB 수용체는 세포 성장 및 증식, 분화, 이주 및 생존1,,2와같은 근본적인 세포 과정을 조절하고, 따라서 강력한 프로토 온코진이다. ErbB 수용체의 비정상적인 활성, 특히 EGFR 및 ErbB2는 ErbB 수용체가 암 치료제2,,3에대한 주요 표적을 만드는 인간 암과 자주 연관되어 왔다.
ERBB 유전자의 몇몇 체세포 변경은 인간 악성,3,4,45에서보고되었습니다. 가장 잘 특징적인 예는 비소세포 폐암(NSCLC)에서 EGFR 키나제 도메인내의 재발성, 활성화 점 돌연변이 및 짧은 프레임 내 삭제를 포함한다. 이러한 EGFR 돌연변이는 암 성장의 주요 동인을 나타내며, 항암제를 표적으로 하는 EGFR에 대한민감도를 예측6,,77,8. 그러나, 대부분의 암에서, EGFR에 있는 체세포 돌연변이는 이 재발하는 "핫스팟"의 외부에서 생기고 수용체의 전체 1210 잔류 범위에 걸쳐 분포됩니다. 실제로, EGFR 1차 서열을 따라 잔류물의 대부분은 인간 암9에서돌연변이되는 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 핫스팟을 제외하고, 암 관련 EGFR 돌연변이의 대다수의 기능적 중요성은 알려지지 않은 남아 있습니다.
ErbBs의 단백구조는 대형 아미노 말단 세포 외 도메인으로 구성되며, 그 다음에 세포 내 신호 단백질을 위한 도킹 부위를 포함하는 세포내 티로신 키나아제 도메인 및 C-말단 꼬리 영역으로 이어지는 단일 반막 나글로 구성됩니다. 리간드 결합은 세포 외 영역에서 극적인 형성 변화를 유발하며, 이는 서로 대칭적으로 교차하고 방향족/ 소수성 표면과 상호 작용하는 이질화 암을 노출시킴으로써 수용체 조광기의 형성을 용이하게 합니다. 수용체 이압 형성시 티로신 키나아제 도메인은 비대칭적으로 접촉하게된다(도 1),수용체 단량체의 C-말단 꼬리를 인광하는 키나아제의 활성화를 초래하고, 이어서 다운스트림 신호10,,11의활성화에 있다.
<img alt="EGFR 신호 다이어그램; 수용체 구조, 키나아제 도메인에 대한 세포외, 막 위치." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: EGFR 디머의 구조. EGFR은 세포외 도메인이 성장 인자(EGF, 표피 성장 인자)를 결합할 때 이산화됩니다. 수신기 키나아제 도메인은 활성기 키나아제 도메인과의 비대칭 상호 작용을 통해 활성화되고, C-말단 꼬리는 티로신 잔류물에서 자동 포광화된다(타미라트 외12에서수정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
단백기 이머 전환 중에 발생하는 동적 구조 재배열 로 인해 <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg" alt="정적 평형 다이어그램, ΣFx=0, 힘 균형 방법, 교육 물리학 개념." data-altupdatedat="1754922859000"> 비대칭 디머의 형성과 관련된 키나아제 활성화와 함께 수용체 구조의 전체 길이를 따라 돌연변이가 잠재적으로 수용체 기능에 영향을 미칠 수 있다. 여기에서 우리는 돌연변이와 시각화의 모델링이 기능에 대한 결과를 설명하기에 충분했던 우리의 이전 연구에서 몇 가지 예를 설명합니다.
실시예 1: 보고된 돌연변이, ErbB413에서D595V, ErbB4 이질화 및인산화(14)가증가하였다. 돌연변이의 위치의 시각화는 관찰된 기능적 효과를 이해하는 데 중요한 요소였다: D595V는 ectodomain의 조광암의 대칭 크로스오버에서일어났다(도 2A). 무기는 크게 방향족과 소수성이며, 발린에 의한 극성 아파르트산의 교체는 "끈적끈적한" 소수성 상호작용을 증가시키고, 이압을 안정화시키고, 따라서 인산화가 일어날 때 시간의 길이를 증가시킬 것으로 예상된다14. 처음에는 각 팔에 아스파르트를 발견하는 것은 놀랍지만, 돌이켜 보면 극성 측면 체인이 그대로 이량의 친화성과 수명을 감소시키고 따라서 키나아제 매개 인산화 및 신호화를 제한하는 활동을위한 타이밍 메커니즘으로 생각할 수 있습니다. 그런 다음 Valine에 의한 교체는 ErbB4 디머를 더욱 안정화시킴으로써 이 보호 장치를 제거합니다.
<img alt="단백질-리간드 상호작용, 분자도, 아미노산 잔기 표시, 구조 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 키나아제 죽은 ErbB4를 생성하는 돌연변이 및 돌연변이를 활성화하는 ErbB4의 위치. (A)D595(D595V 돌연변이 활성화)는 ErbB4 ectodomain 모델의 방향족/소수성 조광암에 위치하고 있다; 무기는 성장 인자 바인딩에 연결; (근처의 잔류물은 막대기로 표시됩니다). (B)ErbB4에서 G802(G802dup 돌연변이 비활성화)는 ATP 및 촉매 D861(D861Y 돌연변이 비활성화)의 아데닌 링 주위의 결합 포켓을 형성하는 데 도움을 주며 Mg2+(도시되지 않음) 및 Γ 인산염 군을 모두 결합합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
실시예 2: 키나아제 도메인의 ATP 결합 부위를 표적으로 하는 체세포 돌연변이가 신호가 불가능한 장애인 또는 키나아제 죽은 수용체로 이어지는 효소 활성을 변경하거나 제거할 것으로 예상할 수 있다. 유방, 위, 대장, 또는 NSCLC15를가진 환자에게서 보고된 9개의 돌연변이의, 시험될 때 9개의 돌연변이의 2개는 높게 감소된 인산화 활동16: G802dup (G → GG) 및 D861Y를 시험할 때. 두 가지 신체 돌연변이 모두 티로신 키나아제 도메인구조(도 2B)의ATP 결합 부위 내에서 발견되었으며, 유연한 글리신, 중복, 아데닌 링 부위및 작은 아파르트산을 말단 인산염 근처의 부피가 큰 티로신으로 대체하여 Mg2+-ATP가 물리적으로 결합을 방지할 수 있다. 그러나, ErbB4는 ErbB2와 이종성구를 형성할 수 있기 때문에 - ErbB2는 성장 인자를 결합하지 않으며 이종화하기 위해 수행하는 ErbB와의 연관성에 따라 달라집니다 - ErbB2 (활성)----- ErbB4(키나아제-죽은) 이종구는 Erk/Akt 신호 경로를 통해 세포 증식을 자극할 것이지만, 세포는 키나아제-죽은 ErbB4 및 STAT5 통로활성화(16)의부족으로 인해 분화하지 않았다.
최근 연구에서, ErbBs의 동적 움직임은 ErbB 기능에 대한 일부 돌연변이의 효과 이해와 관련이 있음을 명백해졌으며, 특히 티로신 키나아제 도메인 내에서 발생하는 돌연변이가 있습니다. 티로신 키나아제 도메인은 ATP가 결합하는 촉매 부위에 의해 분리되는 N-lobe (주로 β 시트)와 C-lobe (주로 알파 헬리칼)로 구성됩니다. N-lobe는 αC 나선 및 P 루프를 포함하는 반면, 활성화(A-loop) 및 촉매 루프는 C-lobe17,,18,,19에존재한다. 티로신 키나아제 도메인의 결정 구조는 두 가지 비활성 적합성을 밝혀, 구조의 대부분은 Src와 같은 비활성 상태를 가지고있다. 활성 형태에서 ATP 결합 부위를 향한 A 루프 포인트의 촉매 아스파르타트및 αC 나선은 ATP 결합 포켓("αC-in" 변형)을 지향하며, 강력한 글루타메이트-리신-이온-쌍의 상호작용을 형성한다.
ErbBs와 성분 키나아제 도메인은 매우 역동적인 실체이기 때문에 특히 기능 및 생물학적 활동에 대한 돌연변이의 영향이 ErbBs의 형성 상태에 단단히 연결될 가능성이 있는 경우, 그들이 경험하게 될 동적 변화의 범위에 대하여 돌연변이를 평가하는 것이 중요합니다. ErbBs의 X선 결정 구조는 3D 구조의 정적 스냅샷을 제공하며, 이는 돌연변이의 동적 결과를 이해하는 데 관련이 있거나 관련이 없을 수도 있습니다. 3차원(3D) 구조에 사용할 수 있는 "에너지 풍경"에 대응하는 동적 변화의 범위를 조사하기 위해, 분자 역학(MD) 시뮬레이션은20을널리 사용한다. 티로신 키나아제 도메인 내의 국소 형태 적 변화 또는 복잡한 안정화로 이어질 돌연변이의 경우, 100 ns의 순서에 대한 시뮬레이션이 충분할 수 있습니다. 그러나, 더 큰 스케일 형태 변경(예를 들어, 키나아제 도메인의 활성 및 비활성 적합성 사이의 전환)은마이크로초(21)의순서에 따라 더 긴 시뮬레이션 시간을 필요로 한다.
아래에 설명된 프로토콜과 관련하여 티로신 키나아제 도메인 내에서 2개의 돌연변이를 활성화하는 것을 고려한다(도3). 두 돌연변이 모두 키나아제의 활성 여부를 결정하는 로컬 형태 변화를 경험하는 위치에서 키나아제 도메인 내에 위치하므로 MD 시뮬레이션이 두 인스턴스모두에 적용되었습니다. 첫 번째 경우, 우리는 EGFR 수신기 키나아제 도메인의 ATP 결합 부위 및 촉매 기계에 직접 영향을 미치는 변화를 고려하여 NSCLC4,,7에널리 연루되는 엑슨 19 삭제 돌연변이의 결과를 구체적으로 조사한다. δ746ELREA750 돌연변이는 αC 나선 앞에 있는 β3-αC 루프의 길이를 감소시키는 - 키나아제 활성화에 결합/활성 부위쪽으로 이동하고 ATP와의 상호 작용을 위해 리신을 배치하여 나선과 K745의 E762 사이의 중요한 정전기 상호 작용을 형성하는 데 참여하는 나선-12도메인을 사전 활성화한다. 두 번째 경우, 우리는 EGFR의 A702V 돌연변이를 고려, iScream 플랫폼9에 의해 밝혀 및 NSCLC 환자(22)에서확인 된 새로운 기능 의 게인 활성화 돌연변이로 나타났다. 수신기 키나아제 도메인에 대한 Alanine-702는 수신기 및 활성기 키나아제 도메인의 인터페이스에서 병수형 세그먼트 B에 위치하며, 이 비대칭 키나아제 디머 복합체 및 키나아제 형태 변화가 활성화9에필요하다.
<img alt="단백질 상호 작용 다이어그램; 표지된 나선이 있는 활성화제 및 수신기 키나아제 구조." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: EGFR의 비대칭 키나아제 도메인 디머입니다. A702V 돌연변이는 활성제 키나아제의 isoleucine 941에 근접하고, 활성기 및 수신기 키나아제 도메인의 중요한 인터페이스에 위치할 것이다. 비대칭 디머의 형성에 의해 유도된 반형성 변화는 키나아제 활성화로 이어진다. ELREA 서열을 포함하는 β3-αC 루프는 αC 나선보다 직접 선행되는; 활성화 하는 동안, αC 나선은 ATP 바인딩 사이트 쪽으로 안쪽으로 이동 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>앰버 소프트웨어</td><td>University of California, San Francisco</td><td>버전 2018</td><td>실행 가능한</td></tr><tr><td>키메라 프로그램</td><td>샌프란시스코 캘리포니아 대학교의 바이오 컴퓨팅, 시각화 및 정보학을위한 리소스</td><td>버전 1.13.1</td><td>실행 가능한</td></tr><tr><td>EGFR struture 파일</td><td>단백질 데이터 뱅크</td><td></td><td>EGFR 구조의 3D 좌표</td></tr><tr><td>Maestro</td><td>Schr&ouml; dinger LLC</td><td>버전 2018-3</td><td>실행 모델</td></tr><tr><td>러 프로그램</td><td>The Andrej &Scaron; 알리 연구소, 바이오 제약 과학 및 제약 화학과, 캘리포니아 대학교 샌프란시스코</td><td></td><td>키메라 프로그램</td></tr><tr><td>VMD 소프트웨어</td><td>이론 및 계산 생물 물리학 그룹, 일리노이 대학교 어바나 - 샴페인</td><td>버전 1.9.3</td><td>실행 파일에</td></tr> 포함</tbody></table>

분자 역학 시뮬레이션을 통해 egfr 체형 돌연변이를 활성화하는 구조적 효과 해독

Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

피하 성장 인자 수용체에서 발생하는 수많은 체세포 돌연변이(EGFR) 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 가족(ErbB)은 암 환자로부터 보고되었지만, 상대적으로 적은 시험이 테스트되고 ErbBs에 기능적 변화를 유발하는 것으로 나타났다. ErbB 수용체는 리간드 결합 시 이질화되고 활성화되며 수용체의 동적 형태 변화는 다운스트림 신호 유도에 내재되어 있습니다. EGFR 기능, A702V 및 Δ746ELREA750 삭제 돌연변이를 변화시키기 위해 실험적으로 나타난 두 개의 돌연변이에 대해, 우리는 분자 역학(MD) 시뮬레이션이 야생 형 EGFR과 비교하여 돌연변이 티로신 키나제 구조의 (1) 형성 안정성을 어떻게 조사할 수 있는지 다음 프로토콜에서 설명한다. (2) 구조적 결과 및 형태 적 전환 및 관찰 된 기능 변화에 대한 관계; (3) 돌연변이가 활성화된 비대칭 이량체에서 키나아제 도메인 간의 결합뿐만 아니라 결합의 강도에 대한 효과; 및 (4) 활성화 된 효소와 관련된 EGFR 결합 부위 내의 주요 상호 작용에 대한 돌연변이의 효과. 이 프로토콜은 구조 역학 및 생물학적 기능과의 관계를 탐구하는 수단으로 MD 시뮬레이션을 사용하여 단백질 구조를 조사하는 데 보다 일반적으로 유용할 수 있는 상세한 단계별 절차뿐만 아니라 지침을 제공합니다.

설명된 프로토콜은 EGFR 키나아제 구조상 ΔELREA 및 A702V 돌연변이의 구조적 효과를 연구하기 위해 사용되었다. 프로토콜의 한 가지 적용은 MD 시뮬레이션에서 RMSD 및 RMSF 값을 계산하여 돌연변이가 로컬 구조/형태 안정성에 미치는 영향을 조사하는 것이었습니다. A702V 돌연변이가 병수막 B 세그먼트에 위치함에 따라, 시작 구조에 비해 수신기 키나아제의 이 세그먼트의 RMSD는 야생형 및 A702V EGFR 모두에 대해 계산되었다. 그결과(도4A)는야생형 EGFR 키나아제 도메인(평균 RMSD 1.1 Å - 95% CI 0.01)에 비해 돌연변이의 병치 B 세그먼트가 100ns 시뮬레이션(평균 RMSD 0.7 Å - 95% 신뢰 구간(CI) 0.009 동안 형성 안정성이 증가한 것으로 나타났다. 이는 알라닌 702(메틸 그룹 사이드 체인)를 부피가 큰 소수성 잔류물, 발린(isopropyl group 측망)으로 대체하기 때문에 이머 인터페이스에서 더 단단한 소수성 상호작용의 결과일 가능성이 높으며, 이솔루신(941)을 가진 수신기 키나아제 도메인에 V702의 소수성 상호작용이 증가할 가능성이 높다.
ΔELREA 돌연변이는 β3-αC 루프에 위치하며, 기능적으로 중요한 αC 나선에 인접한다. αC 나선의 형태는 EGFR 키나아제의 활성 및 비활성 상태 사이의 이동키입니다. 활성 상태에서 αC 나선의 형성 안정성은 MD 시뮬레이션 동안 나선 내의 Cα 원자에 대한 RMSF를 검사하여 평가하였다(도4B):전반적으로, 야생형(평균 RMSF 1.1 Å - 95% CI 0.4)의 변동이 낮습니다(평균 RMSF 1.1 - 95% CI 0.4) N 단자 잔류물에 대해 기록된 변동의 가장 높은 차이. 각각 야생형 키나아제 도메인과 ΔELREA 키나아제 도메인의 중앙분리구에 각각 중첩된 시료 준수는 이러한 결과(도4C)를지원한다(도4C):야생형 및 ΔELREA 키나아제 도메인 모두 β3-αC 루프 및 αC 나선을 제외한 중첩 된 적합성에 대한 전반적인 안정성이 있으며, 이는 명확하게 ΔFRA에서 보다 안정적입니다. 이러한 연구 결과는 ELREA 서열의 삭제가 활성 상태 αC 나선의 이동을 억제하여 활성 형성을 억제하고 따라서 안정화한다는 것을 나타냅니다. 더욱이, αC 나선은 비대칭 디머 인터페이스의 일부를 형성하기 때문에, 돌연변이내의 αC 나선에 대한 구속은 비대칭 디머를 안정화시킬 가능성이 매우 높으며 활성화된 상태의 지속 시간을 연장한다.
프로토콜의 또 다른 응용 프로그램은 시뮬레이션 중에 일어나는 주요 분자 간 상호 작용의 동작을 조사하는 것입니다. 따라서, EGFR 효소 활동의 기본인 K745와 E762 간의 상호작용은, MD 시뮬레이션 동안 두 잔류물의 측면 사슬 극지 원자 사이에 형성된 수소 결합의 백분율 점유율을 측정하여 활성 형 야생형 및 ΔELREA EGFR 키나아제 모두에 대해 분석되었다(그림5A):이 주요 정전기 상호작용은 광형 키나아제 도메인에서 더 자주 형성되었다. 시뮬레이션 중 Mg2+-ATP 및 ΔELREA EGFR 키나아제도메인(도 5B)의상호작용도 평가되었다(도5C):ΔELREA의 수소 결합 수는 야생 형 EGFR(평균 가치 3.2 ~95%CI 0.04)보다 더 많았다.Figure 5 수소 결합의 추가 분석은 K745가 ΔELREA EGFR에서 ATP의 인산염 그룹과 더 자주 상호 작용하는 것으로 나타났습니다, 이는 ΔELREA 돌연변이 EGFR 키나아제 도메인의 시뮬레이션에 언급 된 보다 안정적인 K745-E762 상호 작용에 연결된다.
프로토콜에 설명된 MD 시뮬레이션은 단백질 단백질 및 단백질 리간드 상호 작용을 위한 결합의 상대적인 자유 에너지를 평가하는 데도 유용하다. 야생형 및 A702V EGFRs의 활성제 및 수신기 키나아제 도메인 과 ATP와 야생형 및 ΔELREA 돌연변이 EGFR 키나아제 도메인 간의 결합 에너지, 분자 역학에서 계산된 유전자 변형 소생 표면적(MMGBSA)계산(도 6A):A702V 돌연변이는 더 낮은 평균 ΔG바인드 값(평균 ΔG바인드 = -76 kcal/mol - 95% CI 0.47)을 생성하여 야생형 EGFR 도메인(평균 ΔGbind = -61/ci)과 는 대조적으로 더 유리한 이량상호 작용을 나타낸다. 이러한 관찰은 A702V EGFR 키나아제 도메인에 대해 관찰된 소수성 상호 작용 증가로 인해 보다 안정적인 병인 B 세그먼트 및 더 단단한 이량 인터페이스와 일치한다. 야생형 및 ΔELREA EGFR 키나아제도메인(도6B)에대한 ATP 결합의 경우 MMGBSA 계산은 ΔELREA 돌연변이체(평균 ΔG바인드 -57 kcal/mol - 95% CI 0.43)를 사용하여 더 강한 ATP 결합을 예측합니다(평균 ΔG바인드 -57 kcal/mol - 95% CI 0.43) 야생형 EGFR(평균 ΔG bind -48 kcal/- CI.95%)에 비해. 이러한 결과는 야생형 도메인에 비해 ATP와 ΔELREA EGFR(도5C)사이에 기록된 수소 결합의 수가 많을수록 일치한다.Figure 5
또한 프로토콜을 사용하여 시뮬레이션 중에 관찰된 변형 변화를 조사할 수도 있습니다. 현재 연구에서는, 비활성 EGFR 규형에 대한 ΔELREA 돌연변이의 효과는 시뮬레이션으로부터 샘플링된 적합성의 육안 검사 및 중첩에 의해 연구되었다. 분석결과 ΔELREA EGFR 키나제도메인(도7A)에서αC 나선의 내동움직임을 발견했으며, 이는 활성 상태로의 전환 중에 예상되는 구조적 변화이다. 대조적으로, 야생형 비활성 EGFR의 αC 나선은 초기형성(도 7B)을유지했다. 따라서, MD 시뮬레이션은 키나아제활성(40)및41을증가시키기 위해 실험적으로 나타난 삭제돌연변이가활성 상태로 비활성 키나아제에서 형성적 변화를 촉진한다는 제안을 뒷받침한다.
<img alt="단백질 역학 분석; EGFR 시뮬레이션 그래프 A/B, 형태 변화 C; 분자 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: MD 시뮬레이션 중 활성 EGFR 키나아제 도메인의 야생 형 및 돌연변이 변형 안정성. (A)RMSD(백본 원자)는 야생형(blue) 및 A702V(빨간색) 수신기 키나아제 도메인의 병수 B 세그먼트를 통해. (B)RMSF(Cα 원자)는 αC 나선의 잔류물 위에 야생형(블루) 및 ΔELREA(골드)를 상회한다. (C)야생형(왼쪽) 및 ΔELREA(오른쪽) EGFR 키나아제 도메인의 중화된 적합성; 중앙분리구에 대하여 각 잔류물의 RMSD(Cα 원자)를 기준으로 착색된 사슬 흔적. 색상은 파란색에서 흰색, 빨간색까지 다양하며, 이는 높은 영역에서 낮은 형태 적 안정성까지의 영역을 나타냅니다. 빨간색으로 칠색으로 칠해진 격리된 키나아제 도메인의 "무료" N단자 영역은 그대로 EGFR 구조에서 이러한 수준의 이동성을 나타내지 않습니다. Chakroborty 외.9 (그림 4A 생물학적 화학 저널의허가하에 재현) 및 타미랏 외12에서적응된 수치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="EGFR 단백질 결합 분석; 막대 차트, 분자 구조도, 수소 결합 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: MD 시뮬레이션 중 활성 수신기 키나아제에서 볼 수 있는 주요 특징: K745-E762 염교, αC 나선 및 ATP와의 상호 작용. (A)야생형(blue) 및 ΔELREA(골드) EGFR 키나아제 도메인의 시뮬레이션 중 K745-E762 상호작용의 백분율 점유율. (B)ATP(스틱)와 상호작용하는 야생형 및 ΔELREA 돌연변이의 잔류물. MG2 + (녹색) ATP 및 D855와 좌표. (C)MD 시뮬레이션 중 야생형 및 ΔELREA EGFR 키나아제 도메인을 모두 가진 ATP에 의해 형성된 수소 결합의 수입니다. 타미라트 외12에서그림 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="결합 자유 에너지 그래프; EGFR, A702V, ΔELREA 변이체의 ΔG(kcal/mol) 대 시간(ns)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: 시뮬레이션 중에 돌연변이 키나아제 도메인에 대해 상대적 자유 결합 에너지가 낮아집니다. (A)야생형(blue)과 A702V(빨간색) EGFR의 활성제 및 수신기 키나아제 도메인 간의 상호작용을 위해 계산된 결합 에너지. (B)ATP의 ΔG바인드를 야생형(블루) 및 ΔELREA(골드) EGFR 키나아제 도메인에 결합한다. Chakroborty 외.9 (그림 6A 생물학적 화학 저널의허가하에 재현) 및 타미랏 외12에서적응된 수치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="EGFR 단백질 구조 다이어그램, 야생형 대 ΔELREA, αC 나선 및 A-루프 변경을 보여줍니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7: 야생형 및 ΔELREA 비활성 EGFR 키나아제 도메인의 중첩 된 적합성. αC 나선 및 A 루프 나선의 형태(A)야생 형 (파란색의 중앙 구조) 및(B)ΔELREA EGFRs (금). 다른 샘플링 된 적합성, 흰색 페이드; MD 시뮬레이션 전에 초기 구조, 분홍색. 타미라트 외12에서그림 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜의 목적은 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 EGFR 키나아제 단백질의 돌연변이를 활성화하기 때문에 발생하는 동적 구조적 변화를 검사하는 것입니다.

분자 역학 시뮬레이션을 통해 EGFR 체형 돌연변이를 활성화하는 구조적 효과 해독

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

분자 동적 시뮬레이션은 분자 운동을 탐구하는 데 사용할 수 있으며 생화학 적 및 세포 기능을 이해하는 데 중요한 변형 변화를 나타낼 수있는 계산 기술입니다. 거대 분자에 액세스할 수 있는 동적 모션의 범위를 조사하는 것은 어렵습니다. 실험 데이터와 함께 분자 동적 시뮬레이션의 결과를 사용하면 기능적 중요성을 평가할 수 있습니다.우리는 암 환자에서 관찰된 돌연변이가 EGFR 표적화 확인 및 리간 드바인딩에 어떻게 영향을 미치는지 분자 동적 시뮬레이션을 사용하여 시연할 것입니다. 야생형 아포 활성 EGFR의 키나아제 구조를 준비하려면 키메라 시각화 프로그램을 열고 파일 메뉴에서 ID.단백질 데이터 뱅크 데이터베이스를 선택하고 단백질 데이터 뱅크 2GS2 코드를 지정합니다. 누락된 구조 2GS2 요소를 빌드하려면 다른 EGFR 구조에서 이러한 세그먼트를 획득합니다.5개의 잔류글루타메이트(746)를 EGFR에서 알라닌 750 ELREA 삭제하도록 구성하려면, 즐겨찾기, 시퀀스 및 쇼 시퀀스를 클릭하여 야생형 2GS2 시퀀스를 엽니다. 그리고 결과 시퀀스 창에서 편집을 클릭하고 시퀀스를 추가하여 삭제 돌연변이 FASTA 형식 시퀀스를 선택합니다. 정렬 창에서 구조 및 모델 또는 상동성을 선택합니다.팝업 창에서 2GS2 복합 구조를 모델링할 쿼리로 템플릿 및 돌연변이 시퀀스로 지정한 다음 zDOPE 점수 및 육안 검사를 기반으로 결과 모델에서 돌연변이 모델을 선택합니다. 야생형 아포 비활성 EGFR 키나아제 구조를 준비하기 위해, 단백질 데이터 뱅크 구조 2GS7을 열고 다른 EGFR 구조에서 누락된 세그먼트를 추가하여, 입증된 바와 같이 삭제 돌연변이 형태를 모델링한다. ATP 바인딩 야생형 활성 EGFR 키나아제 구조를 준비하기 위해 단백질 데이터 뱅크 구조 2ITX를 원리 구조로 사용하여 다른 EGFR 구조를 사용하여 누락된 세그먼트를 구축하고 모델러를 사용하여 삭제 돌연변이 형태를 모델링하는 것을 입증하였다.야생형 EGFR 비대칭 이머 구조를 구성하기 위해, 키메라에서 2GS2를 열고 공구를 클릭하고, 고차 구조 및 단위 셀을 비대칭 배열에서 활성제 및 수신기 키나아제함유 생물학적 어셈블리로 변환한다. 2GS2 구조를 선택하고 복사본을 입력한 다음 대칭 작업으로 인한 디머의 여러 복사본에서 단일 비대칭 디머를 선택하고 저장합니다. 알라닌 702 valine 돌연변이를 구축하려면 도구, 구조 편집 및 로타머를 선택하여 알라닌 702를 바이로 대체합니다.마에스트로의 구조를 열고 단백질 준비 마법사 버튼을 클릭한 다음 수소 원자를 추가하고 누락된 측면 체인 원자를 채우고 사전 프로세스를 클릭합니다. pH 7.0에서 이온화성 잔류물의 프로토네이션 상태를 결정하기 위해, 정제를 클릭하고 PROPKA를 사용하여 수소 결합을 위한 아스파라진, 글루타민 및 히스타민 잔류물의 방향을 최적화한 다음 구조를 최소화합니다. 시뮬레이션 시스템을 설정하려면 LEAP 프로그램을 열고 앰버 FF14SB 힘 필드와 TIP3P 물 분자를 가져옵니다.ATP 바인딩 시스템의 경우 ATP에 대한 매개 변수를 가져오고 구조를 로드합니다. 단백질의 표면 원자에서 모든 방향으로 10 개의 앙스트롬을 확장하는 명시적 TIP3P 물 분자를 가진 옥타헤드랄 상자에 구조를 솔바테하십시오. 벨트 시스템을 확인하고 필요한 이온을 추가하여 중화하십시오.생체 분자 시스템을 충분히 모델링하려면 시뮬레이션 상자에 나트륨 과 염화물 원자를 추가하여 시스템 염분 농도를 0.15 어금니로 가져온 다음 토폴로지 및 조정 파일을 생성 및 저장하여 후속 생산 시뮬레이션에 대한 입력으로 사용하십시오. 호박색을 사용하여 처음에는 에너지가 시뮬레이션 시스템을 최소화하여 불리한 구성을 우회합니다. 최소화 입력 파일에서 총 최소화 주기및 사이클 수에 대한 최대 사이클 변수를 조정하여 가장 가파른 하강 알고리즘의 사이클 수를 나타냅니다.구속 력 변수를 사용하여 구속 마스크 매개 변수에 지정된 솔루트 원자에 구속력을 적용합니다. 여러 단계로 최소화를 수행하여 솔직 원자에 적용되는 구속을 두더지 앙스트롬 사각형당 25~0킬로칼로리로 낮추고 명령을 사용하여 최소화를 실행합니다. 0에서 300 켈빈까지 100 picoseconds에 대한 시스템을 가열하고 솔직 한 원자에 평방 앙스트롬 구속 당 10 킬로 칼로리 어어를 설정하는 명령을 사용합니다.그런 다음 명령을 사용하여 가열을 수행합니다. 이소레 동종 앙상블 아래 900 picoseconds에 대한 시스템을 상화하고 장거리 정전기 상호 작용을위한 9 개의 앙스트롬 거리 차단을 설정하고, 점차적으로 두더지 앙스트롬 사각형 당 0.1 킬로칼로리로 솔루트 원자 구속을 낮추고 억제되지 않은 5 나노 초 시뮬레이션으로 평형을 마무리합니다. 표시된 대로 명령으로 균등화를 실행합니다.텍스트를 조정하여 100나노초 동안 프로덕션 시뮬레이션을 수행할 수 있도록 조정한 다음 10pico초마다 저장되는 준수를 수행한 다음 표시된 대로 명령으로 시뮬레이션을 실행합니다. 야생 유형 및 돌연변이 EGFR 키나아제 시뮬레이션 중에 변형 샘플을 시각화하려면 시각적 분자 역학에서 호박 색 토폴로지 파일과 해당 궤적 파일을 엽니다. 그리고 편리한 이차 구조 표현을 사용하여, 기록된 궤도에서 단백질의 전반적인 구조적 역학을 분석한다.그런 다음 촉매 필수 리신 745-글루타메이트 762 소금 다리와 같은 원자와 관심잔류 사이의 특정 상호 작용을 봅니다. 또는 단백질 데이터 뱅크 형식으로 시뮬레이션 중에 샘플링된 여러 적합성을 저장하고 Kymera에서 적합성을 엽니다. 중매기 옵션을 사용하여 초기 또는 중앙분리구 구조에 구조를 중첩하고 중앙분리형 구조의 중간 구조를 페이드 화이트의 나머지 구조를 표시하여 기록된 구조 움직임을 보다 명확하게 시각화할 수 있도록 합니다.야생형 및 돌연변이 EGFR의 글로벌 안정성을 분석하고 다양한 구조 단위의 유연성을 검사하기 위해 호박색 유형학 및 해당 궤적 파일을 가져옵니다. 루트 평균 제곱 편차 입력 파일에서 초기 구조의 백본 원자를 루트 평균 사각형 피팅에 대한 참조로 나타냅니다. 루트 평균 정사각형 변동 입력 파일에서 초기 구조의 C-알파 원자를 루트 평균 사각형 피팅에 대한 참조로 나타냅니다.그런 다음 CPPTRAJ 프로그램을 사용하여 분석을 실행하고 출력 데이터를 플롯합니다. 또는, 변형 앙상블을 정렬하고 C-알파 원자 루트 평균 사각 편차에 따라 각 잔류물을 색칠, 키메라의 적합성을 열고 중매 옵션에 정렬합니다. 특성별로 도구, 묘사 및 렌더링을 선택합니다.변형 앙상블의 잔류물을 선택하고 C-알파 루트 평균 사각형 편차를 특성으로 설정한 다음 확인을 클릭합니다. 응표의 체인 추적은 각각 높은, 중간 및 낮은 구조 안정성의 영역을 반영하는 파란색, 흰색 또는 빨간색으로 칠하게 됩니다. ATP와 야생형 및 삭제 EGFR 간의 수소 결합 상호 작용을 분석하려면 CPPTRAJ 스크립트를 준비하여 이 작업을 수행합니다. 분자 간 수소 결합에 대한 분석을 노인트라몰 변수와만 지정하고 3.5 앙스트롬 이하의 기증자 수용자 거리와 135도 보다 크거나 동일한 결합 각도를 가진 수소 결합을 정의한다.분자 내 상호 작용을 평가하기 위해, 예를 들어, 촉매적으로 중요한 리신과 글루타민산 잔류물 사이의, 리신을 수소 기증자로 지정하고 글루타민트는 수용체 잔류물으로 지정하고 결과의 분석을 허용하도록 지시된 대로 스크립트를 실행한다. ATP와 야생형 및 삭제 EGFRs 간의 결합 없는 에너지를 계산하기 위해, LEAP 프로그램에서 가스상 리간드 수용체 및 리간드 수용체 복합 단백질 데이터 뱅크 파일을 준비하고 ATP를 수용체로서 리간드 및 EGFR로 설정한다. 일반화된 태어난 무선 값을 M 본드 I2로 설정합니다. 그런 다음 가스 상 단백질 데이터 뱅크 파일에 대한 호박토폴로지 및 좌표 파일을 생성합니다.유사하게, 야생형 및 알라닌 702 볼린 EGFRs의 활성제 및 수신기 키나아제 사이의 결합 없는 에너지를 계산하기 위해, 수신기 키나아제를 수용체로서 리간드 및 활성제 키나아제로 지정하고 해당 토폴로지 및 좌표 파일을 저장한다. 태어난 표면적 입력 파일을 일반화한 분자 역학을 준비하고 IGB 값을 2로 설정하고 소금콘을 0.1로 설정합니다. 그런 다음 mmpbsa를 사용하.황색에서 사용할 수있는 py 스크립트는 바인딩 에너지 계산을 실행하고 출력 데이터를 분석하기 위해 지시 된 대로 명령을 입력합니다. 이러한 대표적인 100 나노초 시뮬레이션 동안, 알라닌 702 볼린 돌연변이는 야생형 EGFR에 비해 더 엄격한 소수성 상호작용으로 인해 병자멤브레인 B 세그먼트의 형성 안정성이 증가하는 것으로 나타났다. 알라닌 702 valine 돌연변이는 또한 활성 EGFR 키나아제 형성을 유지하는 더 유리한 디머 상호 작용을 나타내는 야생 형 EGFR에 비해 활성제와 수신기 키나아제 사이의 결합의 낮은 자유 에너지를 나타냈다.삭제 돌연변이의 시뮬레이션은 야생 형 EGFR에 비해 기능적으로 키 알파 C-나선의 낮은 C-알파 원자 변동을 초래하고, EGFR 활성 상태의 시간을 연장. 삭제 돌연변이는 또한 야생 형 EGFR에 비해 EGFR 효소 활성에 대한 주요 상호 작용인 리신 745및 글루타메이트 762의 측면 사슬 극성 원자 사이의 수소 결합의 빈번한 형성을 초래했다. 또한, ATP와 EGFR 사이의 수소 결합의 수는 야생 형 EGFR에 대한 것보다 삭제 돌연변이에 대한 더 컸다.삭제 돌연변이는 또한 EGFR 비활성 상태 알파 C-나선의 내적 움직임을 초래, 활성 상태로 전환 하는 동안 예상 되는 구조적 변화. 대조적으로, 야생 형 비활성 EGFR의 알파 C-나선은 초기 형성을 유지했다. 돌연변이의 충격을 평가하기 위하여는, 구조물의 적당한 형성 상태를 선택하고 제대로 준비하고 이 구조물을 평형하는 것이 중요합니다.이러한 기술 간의 시너지 효과는 결과의 해석에 도움이 되고 추가 습식 실험실 실험을 알릴 수 있으므로 분자 동적 시뮬레이션과 실험 연구를 결합하는 것이 중요합니다.

deciphering-structural-effects-activating-egfr-somatic-mutations-with

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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