골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

이 프로토콜에 차등 원심분리를 사용하면 최대 리터까지 쉽게 확장할 수 있어 1차 섬유아세포에서 엑소좀을 분리하는 데 이상적이라는 장점이 있습니다. 정제된 엑소좀은 다양한 질병 모델에서 분리된 다양한 세포 유형과 조직에서 얻을 수 있습니다. 엑소좀은 진단용 바이오마커로 사용할 수 있습니다.

그 절차를 시연하는 것은 d' Azzo Laboratory의 과학자 인 Diantha van de Vlekkert입니다.시작하려면 마우스 근육의 무게를 측정 한 다음 10cm 접시에 옮깁니다. 생물 안전 후드 아래에서 작업하고 메스로 근육을 다져 고운 반죽을 만듭니다. 잘게 다진 근육 페이스트를 50ml 튜브에 옮기고 조직 1mg당 부피의 3.5배를 사용하여 소화 용액을 추가합니다.

섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 완전한 해리를 돕기 위해 10분마다 5ml 피펫으로 현탁액을 철저히 혼합하십시오. 분해 용액을 비활성화하려면 20ml의 DMEM Complete를 세포 현탁액에 추가합니다.

50ml 튜브에 놓인 70마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 통해 피펫팅한 다음 추가로 5ml의 DMEM Complete로 셀 스트레이너를 세척합니다. 세포 현탁액을 300g에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 10ml의 DMEM Complete에 다시 현탁시킵니다.

세포를 10cm 접시에 심은 다음 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 산소 3%의 인큐베이터에 넣습니다. 골격근 섬유아세포 배양은 생리학적 광 조건을 보장하기 위해 낮은 산소 수준으로 유지되어야 합니다. 골격근의 산소 수치는 약 2.5%세포가 100% 합류점에 도달한 후 하루 더 배양한 다음 PBS로 헹구고 1밀리리터의 트립신화 용액을 첨가합니다.

세포를 10분 동안 배양한 후 DMEM Complete 10ml를 첨가하여 트립신화를 중지합니다. 세포 현탁액을 50ml 튜브로 옮긴 다음 실온에서 300g으로 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 20ml의 DMEM에 다시 현탁시키고 세포를 15cm 접시에 파종합니다.

배양된 섬유아세포에서 조건화된 배지를 15ml 튜브에 수집합니다. 컨디셔닝된 배지를 300g에서 10분 동안 원심분리하여 살아있는 세포를 펠릿화합니다. 상등액을 새로운 50ml 튜브로 옮기고 튜브를 2, 000g에서 10분 동안 원심분리하여 죽은 세포를 펠릿화합니다.

다음으로, 상등액을 38.5 밀리리터 폴리프로필렌 관에 옮기고 10, 000g에서 30 분 동안 튜브를 원심 분리하여 세포 소기관, 세포 자가사멸체 및 막 조각을 제거합니다. 엑소좀을 펠릿화하기 위해 상등액을 38.5ml 초투명 튜브에 옮기고 100, 000g에서 1.5시간 동안 초원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 버리고 약 1ml의 컨디셔닝 배지를 남깁니다.

엑소좀 펠릿을 세척한 후 최대 30ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 다시 매달아 놓습니다. 엑소좀을 100, 000g에서 1.5시간 동안 다시 원심분리합니다. 정제를 완료하려면 엑소좀 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.

엑소좀 펠릿 단계는 느슨하고 쉽게 분리할 수 있습니다. 따라서 PBS 상등액의 제거는 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 매우 조심스럽게 수행해야합니다. 섬유아세포 15cm 접시당 25마이크로리터를 사용하여 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS에 다시 현탁시킵니다.

마지막으로, BCA 단백질 분석 키트와 마이크로플레이트 리더를 사용하여 562나노미터에서 단백질 농도를 측정합니다. 이 프로토콜은 엑소좀을 정제하기 위한 재현성이 높고 일관된 방법입니다. 투과 전자 현미경은 이러한 엑소좀의 비교적 균일한 크기를 보여줍니다.

엑소좀 용해물의 면역블롯은 단백질 발현의 표준 패턴과 LDH 및 칼넥신 단백질 오염 물질의 부재를 보여줍니다. 엑소좀은 수크로스 밀도 구배(sucrose density gradient)에 의해 분리되었고, 개별 분획은 Alix, CD9 및 CD81에 대한 항체가 있는 웨스턴 블롯(western blot)에서 조사되었습니다. 엑소좀은 3분획에서 6분획까지 일관되게 침전되었습니다.

분리 및 농축된 생체 활성 엑소좀은 전자 현미경 및 질량 분석 분석뿐만 아니라 기능 연구를 위한 체외 및 생체 내 흡수 실험에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 저분비 세포에서 엑소좀을 분리하는 데 적합하며, 인체 섬유화 질환에서 엑소좀의 관여를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.