Name: EYFP 태그CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 질량 분광분석을 이용하여 EYFP-CENP-A의 유비쿼터션 부위를 식별하는 방법을. 면역침전과 질량 분석을 통해 세포 생존에 필수적인 센트로미어 조립 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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난징대학교 모델동물연구센터의 리차오준 에게 대량 분석해 주셔서 감사합니다. Yanmini Dalal, 후카가와 타츠오, 모델 동물 연구 센터, 난징 대학 및 Greehey 어린이 암 연구소의 현재 연구원들에게 유용한 토론, 실험 지도 및 시약에 감사드립니다. 돈 W. 클리블랜드, 다니엘레 파치네티, 얀미니 달, 민부이, 구스타보 더블유 리온, 존 톰슨, 로렌스 S. 커쉬너, 암루타 아슈테카르, 벤 E. 블랙, 글레니스 A. 로그스돈, 겐지 토고, 새벽 S. 챈들러에게 절경 선물을 주셔서 감사합니다. Y.N. 장쑤성 '이중일급' 건설기금, 장쑤성 자연과학기금(SBK2019021248), 장쑤성제16대 6대 인재봉우리펀드(TD-SWYY-001), 장쑤성 '외국인 전문가 백인재 프로그램' 기금(SBK2019000000000000000000000000000000), 309개 국립과학재단(306998년) 이 연구는 부분적으로 NCI 보조금 R21 CA205659에 의해 지원되었다.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

여기서 우리는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위한 질량 분광분석 방법을 설명하여 EYFP 태깅이 CENP-A K124R 돌연변이 단백질8에서다른 리신에서 유비쿼터티화를 유도한다는 것을 시사한다. 그 결과, EYFP-CENP-A K124R에서 리신 306(K306)에 대한 유비쿼터션을 성공적으로 확인했으며, 이는 대량 분석 분석을 통해 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당합니다. 여기서 설명된 질량 분광분석은 CENP-A WT-Flag12의리신 124(K124) 유비쿼터티화 부위를 이전에 식별하는 모방 방법이다. 따라서, 이 방법은 다른 태그 및 그밖 centromere 운동장 단백질을 가진 인간 CENP-A 단백질에 적용될 수 있습니다. LC-MS/MS를 기반으로 하는 질량 분광분석은 일반적으로 광범위한 단백질의 잠재적인 번역 후 변형(PTM)을 식별하도록 허용됩니다. 여러 분석/분석(즉, 생체 유비쿼터스...

대부분의 진핵생물에서 스핀들 마이크로투볼은 각 염색체의 단일 영역에 부착해야 하며, 이는 센트로메르라고 불릴 것이다. 운동장은 센트로메르에 있는 단백질의 복합체입니다. 센트로메트와 운동장 단백질의 움직임과 운동장 및 백혈구의 구조를 연구하는 것은 염색체 불안정성(CIN) 및 암 진행을 이해하는 데 중요합니다. 주요 질문은 센트로메어의 염색체 위치와 기능(즉, 센트로메어 정체성)이 어떻게 결정되고 정확한 염색체 분리에 어떻게 참여하는지입니다. 대부분의 종에서 CENP-A라고 불리는 특정 히스톤과 같은 단백질을 함유한 특수 뉴클레오종의 존재는 원로메르 정체성을 정의합니다. 따라서 CENP-A는 센트로메르 정체성의 비 DNA 지표(후생유전학 마크)가 될 것을 제안된다. CENP-A가 인간의 중심 정체성을 정의하는 방법의 메커니즘을 해명하는 것이 중요합니다.
홀리데이 접합 인식 단백질(HJURP)은 CENP-A-특이적 샤페론으로 향로골 뉴클레오좀1,,2,,3로CENP-A를 침전시한다. 우리는 이전에 CUL4A-RBX1-COPS8 E3 리개구세가 리신 124 (K124) 및 센트로메어 국소화4에CENP-A 유비쿼터션에 필요하다고 보고했다. 또한, 우리의 결과는 새로 합성 CENP-A의 센트로메어 모집이 기존의 유비쿼터스 CENP-A 를 필요로 하는 것으로 나타났다5. 따라서 CENP-A 유비쿼터틸레이션이 세포 분열 간의 분화를 통해 상속된다는 것을 시사하는 모델이 제공되었다.
우리의 연구 결과와 Yu et al.의 결과와는 달리, CENP-A및 그것의 센트로메릭 현지화에 관하여 부정적인 결과는 최근에66간행되었습니다. 이 기사는 리신 124 (K124)에 CENP-A 수정은 K124R의 돌연변이가 CENP-A centromere 국소화 세포 생존도6에영향을 미치지 않았다는 것을 보여주는 부정적인 결과에 기초하여 인간 센트로메머의 설립, 유지 보수 및 장기 기능에 분산되어 있다고 주장했다. 그러나, 그들의 결과 와 결론에 토론을 위한 충분 한 여지가 있다, 그리고 우리는 이미 그들의 이전 간행물 7에 있을 수 있는 어떤 문제가 있을 수 있습니다 설명했다. 내인성 CENP-A의 크기보다 훨씬 더 큰 분자량을 가진 CENP-A와 단백질을 융합시키는 것에 주의를 기울여야 합니다: 예를 들어, 30kDa강화된 노란 형광 단백질(EYFP)을 ~16kDaCENP-A로 융합하고 EYFP-CENP-A K124R 단백질융합을 분석하여 1-1-1-1-1-1-1-RPE 계통의 EFP-CENP-A K124R 단백질 융합을 분석하였다. K124 유비퀴틴은 구조적 예측4에기초하여 HJURP에 직접 결합할 것으로 예상되지 는 않았지만, 모노 유비퀴틴의 첨가는 CENP-A의 단백질 형성에 영향을 미칠 것으로 예상된다. CENP-A 형성의 단백질은 큰 융합 단백질의 존재에 의해 변경될 수 있고, 이러한 형태 변화는 유비쿼터틸화의 손실로 인한 구조적 변화를 가리킬 수 있다. 우리는 대형 단백질의 융합이 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이체에서 K124 이외의 리신에서 유비쿼터스화를 유도하고 다른 부위에서 이러한 보비쿼터션은 원래 K124R 단일 돌연변이 표현형을 억제/마스크하는 것이 좋습니다. 큰 태그 단백질 (EYFP)을 가진 CENP-A K124R 돌연변이 단백질에서 다른 리신에서 유비쿼터션이 발생한다는 증거는 우리의 이전 간행물8에서보고되었다. EYFP 태깅은 EYFP-CENP-A K124R의 다른 리신 부위의 유비쿼터티케이션을 유도하고 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이가 HJURP에 결합한다는 것을 발견했습니다. 그 결과, 다른 부위의 이 유비쿼터션은 원래 K124R 단일 돌연변이 표현형을 억제/마스크하며, EYFP-CENP-A WT와 K124R 돌연변이체 모두 센트로메르 현지화를 보였다(pBabe-EYFP-CENP-A WT 및 K124R 돌연변이를 pBafp-EYFP와 함께 사용하고 비교하였다). 그 결과, 플래그 태그가 지정되거나 태그가 지정되지 않은 CENP-A K124R 돌연변이가 치명적이지만 단일비비퀴틴 융합에 의해 구조될 수 있음을 보여주었으며, 이는 CENP-A 유비쿼터션이 세포 생존에 필수적임을 시사합니다.
최근 몇 년 동안, 많은 연구는 CENP-A 단백질및 기타 센트로메트르-키네토초레 단백질의 번역 후 변형(PTM)을 생체 내 및 시험관내 9,10,,11모두에서 식별하기 위해 다른 분석법을개발하였다., 크로마틴의 기능을 조절하는 주요 메커니즘인 히스톤 단백질의 PTM과 유사하게, 센트로메릭 크로마틴 성분의 PTM은 또한 센트로메어의 전반적인 구조와 기능을 조절하는 필수적인 메커니즘에 관여한다. CENP-A PTM 사이트의 대다수는 CENP-A 함유 뉴클레오소머에 특이적이지만, 그 중 일부는 히스톤 H3에 보존되어 있지만, 이러한 잔류물의 수정이 centromere-특정 기능에 기여한다는 것을 시사한다. 인산화, 아세틸화, 메틸화 및 유비쿼터틸레이션을 포함한 CENP-A의 PTM은 이전에보고되었다 9,CENP-A는 그것의 아미노산 종점 및 C-terminus 그의 톤 접이식 도메인에 PTM및 그들의 조합 배열의 다양한 복종을 실시하는 것을 건의합니다. 여러 기능에서 CENP-A 수정의 중요성은 우리의 등 많은 그룹에 의해 밝혀졌다. 이러한 기능은 센트로메어에서 CENP-A 증착을 포함, 단백질 안정성, 및 CCAN의 모집 (구성 중심-관련 네트워크)9. 그러나 CENP-A PTM의 제한된 연구 와 연구 결과는 직접 또는 간접적으로 기능을 조절하는 표준 히스톤 중 하나로 비교가 이루어지는 곳에서 미리 형성됩니다. 이러한 CENP-A PTM을 식별하는 방법론에 초점을 맞춘 기술 보고서도 제한됩니다.
CENP-A 유비쿼터셜화는 세포 분열5사이의 분무를 통해 상속되고 세포생존가능성에필수적이지 않은12개의CENTromere에서 CENP-A 증착이 필요하기 때문에, CENP-A 유비쿼터션을 식별하는 방법은 향후 원롬의 기능적 활동, 포지셔닝 및 구조를 연구하는 데 필수적일 것이다. 따라서, 여기서 우리는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명하며, EYFP 태깅이 CENP-A K124R 돌연변이 단백질8에서다른 리신에서 유비쿼터티화를 유도한다는 것을 시사한다. 다른 제어 분석 및 분석의 프로토콜 (면역 형광 분석, 식민지 아웃 성장 분석, 및 생체 유비쿼터션 분석)도 주요 질량 분석 분석의 결과를 제대로 논의하기 위해 제시됩니다.

<table><tbody><tr><td>Equpiments/Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 단백질 저결합 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>질량 분석</td></tr><tr><td>10cm 세포 배양 접시</td><td>BIOFIL/JET, 중국</td><td>700224</td><td>10cm 조직 배양 접시 (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 클러스터</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6-웰 배양 </td></tr><tr>플레이트<td>CentriVap</td><td>LABCONCO</td><td>-</td><td>질량 분석 분석을 위한 진공 건조 펩타이드용 탁상용 진공 농축기</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15cm x 75 &mu; m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>질량 분석 분석용 액체 크로마토그래피(RPLC) 컬럼</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x 오일 이멀젼 렌즈</td><td>라이카</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PHE</td><td>100X 오일 이멀젼 렌즈</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x 이멀젼 렌즈</td><td>라이카</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PH 3 CS</td><td>63X 이멀젼 렌즈</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF 트랜스퍼 멤브레인</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 전동 형광 현미경</td><td>Leica</td> <td>전동</td> <td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Leica EL6000 소형 광원</td><td>Leica</td><td></td> 형<td>광 여기용 외부 광원</td></tr><tr><td>Micro Cover 유리(22mm x 22mm)</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Cover 유리(22mm x 22mm)</td></tr><tr><td>모델 V16-2 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 장치</td><td>Apogee 전기영동/CORE 생명 과학</td><td>31071010</td><td>겔 전기영동 장치 I 더 큰 SDS-PAGE 겔</td></tr><tr><td>nanoLC.2D</td><td>Eksigent Technologies</td><td>-</td><td>질량 분석 분석을 위한 액체 크로마토그래피 시스템</td></tr><tr><td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0335BOX</td><td>질량 분석</td></tr> <tr><td>분석을 위한 상용 4%-12% Bis-Tris 단백질 겔Olympus FLUOVIEW FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>ORCA-R2 디지털 CCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>CCD 카메라</td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>바인딩 사이트</td><td>AD100.1</td><td>면역형광 염색 조직의 발수 장벽용</td></tr><tr><td> CULTURE DISHES 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>10cm 조직 배양 접시</td></tr><tr><td>젤 실행용 수직 전기영동(빅 사이즈)</td><td>Junyi, China</td><td>JY-SCZ6+</td><td>더 큰 SDS-PAGE 젤을 적용하는 젤 전기영동 장치 II(Yohei lab, PE23)</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro slides</td></tr><tr><td>primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CENP-A 항체</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>마우스 단클론 항체</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>마우스 단클론 항체</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Rabbit polyclonal 항체</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Rabbit polyclonal 항체</td></tr><tr><td>항-GFP 항체</td><td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td><td></td><td>Rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>anti-HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Rat monoclonal antibody</td></tr><tr><td>anti-HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&ndash; 1-AP</td><td>토끼 다클론 항체</td></tr><tr><td>항 유비퀴틴</td><td>베틸 연구소</td><td>A300-317A-1</td><td>토끼 다클론 항체</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 I(0.1% SDS와 호환 가능)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>초음파 발생기</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 초음파 발생기 Microtip 스텝, 솔리드, 나사산 9.5mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>초음파 처리 용 디스럽터 혼</td></tr><tr><td>Branson 초음파 초음파 발생기 Microtip 테이퍼 6.5mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>초음파 처리 용 Microtip</td></tr><tr><td>버퍼 A1</td> <td>-</td><td></td> <td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 m NaCl; 0.5 % Nonidet P-40; 0.5 % 데 옥시 콜레이트; 0.5 % SDS; 1 mM EDTA; 완전한 EDTA 무료 프로테아제 억제제 시약</td></tr><tr><td>완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 Roche</td><td></td><td>11-873-580-001</td> 버퍼 A1 Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life <td>Sciences 용 완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 시약</td></tr><tr><td></td><td></td><td>질량 분석을위한 CAS 6104-59-2</td><td>Coomassie 블루 솔루션</td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛 용액 (2.3 % 크리스탈 바이올, 0.1 % 암모늄 옥시 레이트, 20 % 에탄올)</td> <td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>콜로니 염색</td></tr><tr><td>용 DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>핵 염색 DMEM</td></tr><tr><td>: F12 매체</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM : F12 매체</td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화, US origin</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (소 태아 혈청)</td></tr><tr><td>고포도당 DMEM (Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>high-glucose DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfection reagent I for chemical transfection</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfection reagent II for chemical transfection</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher A412-4</td><td>Fixation</td><td> reagant</td></tr><tr><td>무지방 분유(카네이션 분유 대체품 승인)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871(재주문 번호 190915; Lot# 90629)</td><td>무지방 탈지유</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>환원 혈청 매체</td></tr><tr><td>p-페닐렌디아민</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>매체 장착용</td></tr><tr><td>페니실린, 스트렙토마이신; Liquid</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>페니실린-스트렙토마이신</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 솔루션</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>폴리-L-라이신, 0.1% w/v, 물 중</td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민 [PEI]; 1.0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&ndash; 2</td><td>화학적 트랜스펙션을 위한 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>III: 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드,</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td>, <td>pQCXIP-EYFP-CENP-A를 사용한 생체 내 유비퀴틸레이션 분석을 위한 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드,</td></tr><tr><td>웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼, I</td></tr><tr><td>염기서열분석 등급 트립신</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>질량 분석</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto 최대 감도 기판</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>초고감도 강화 화학발광(ECL) 기판</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>멸균 조직 배양 등급</td></tr><tr><td>물 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼 II((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)-</td><td></td><td>-</td><td>Western Blot Stripping Buffer II</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW software</td><td></td><td></td> <td>Olympus-Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>분석 FV31S-DT software</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>cellSens Dimension 소프트웨어 Ver. 1. 18</td><td></td><td></td> <td>Olympus-Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio 분석 소프트웨어 ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Software</td><td></td> <td>D</td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>면역 얼룩 감지를 위한 화학발광 이미저</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>-</td><td>면역 블롯 감지를 위한 적외선 이미징 시스템</td></tr><tr><td>OpenCFU 세이프트웨어</td><td>-</td><td>-</td><td>콜로니 카운팅용 (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab 버전 5.5.2. 과학 이미징 소프트웨어</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>A</td></tr><tr><td>ProteinPilot 소프트웨어 버전 4.5</td><td>AB SCIEX-Software</td><td></td> <td>F 질량 분석</td></tr><tr><td>용 수량 1 차원 분석 소프트웨어</td><td>Bio-Rad-Software</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ System</td><td>AB SCIEX-Mass</td><td></td> <td>Analysis Instrument</td></tr><tr><td>Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B1</td></tr><tr><td>Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B2</td></tr></tbody></table>

eyfp 태그cenp-a(eyfp-cenp-a)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

운동장과 원로메머의 구조와 역학을 연구하는 것은 염색체 불안정성(CIN) 및 암 진행을 이해하는 데 중요합니다. 센트로메르의 염색체 위치와 기능(즉, 중심정체성)이 어떻게 결정되고 정확한 염색체 분리에 참여하는가하는 것은 근본적인 질문입니다. CENP-A는 원로메르 정체성의 비DNA 지표(후생유전학 마크)로 제안되며, CENP-A 유비쿼터틸화는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적이다.
여기서 우리는 CENP-A K124R 돌연변이 단백질에 EYFP 태그로 인해 다른 리신에서 유비쿼터틸화가 유도된다는 것을 건의하는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위해 질량 분광 분석을 설명합니다. EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306) 유비쿼터티션이 성공적으로 확인되었으며, 이는 대량 분석 분석을 통해 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당하는 것으로 확인되었다. 주의 사항은 단백질의 기능을 분석하는 도구로서 GFP/EYFP 또는 고분자량 단백질의 태깅을 사용하는 데 대해 논의된다. 현재 기술적 한계는 또한 보편성 대역의 검출, 사이트별 유비쿼터틸화(들)의 식별, 그리고 전체 세포 주기 동안 살아있는 세포 또는 특정 단일 세포에서 의 편형의 시각화를 위해 논의된다.
여기에 제시된 질량 분광분석 방법은 다른 태그 및 기타 센트로메레-키네토초레 단백질을 가진 인간 CENP-A 단백질에 적용될 수 있다. 여러 분석/분석으로 구성된 이러한 결합 방법은 유비쿼터틸레이션의 기능적 역할을 식별하는 데 관심이 있는 연구자에게 권장될 수 있습니다.

EYFP-CENP-A K124 돌연변이는 유비쿼터틸화, HJURP와의 상호 작용 및 백혈구 국소화의 결함 없음을 나타내며 세포 치사성도 없다. 여기서 파키네티 외(2017)6에 의해 보고된 시스템은 재구성되었다: 디플로이드 인간(RPE-1) 세포에서 하나의 중단및 하나의 ''플로시드'를 운반하는 CENP-A 대립구(CENP-A-/F), EYFP-CENP-A는 pBabe-EYFP 레트로바이러스 벡터로부터 발현되었다.CENP-A-/F 이 시스템에서는CENP-A-/F 제일로부터 내인성 CENP-A의발현이 Cre재조합6에의해 중단될 수 있다. 내인성 CENP-A의 손실을 구출하는 EYFP-CENP-A WT 또는 K124R돌연변이(도 1A)의유전자 구조는 레트로바이러스 통합이 수행되었...

CENP-A 유비쿼터스는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적입니다. 여기서 우리는 EYFP 태그CENP-A (EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터션을 확인하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명합니다.

EYFP 태그CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

이 방법은 EYFP 태그CENP-A 단백질의 유비쿼터스를 식별할 수 있게 합니다. 그것은 또한 다른 테스트 및 다른 단백질을 가진 인간 CENP-A 단백질에 적용될 수 있습니다. 이것의 주요 장점은 중요한 생물학적 중요성을 가진 EYFP CENP-A K124R 유비쿼터스 사이트를 식별하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.그것은 기능성 단백질의 넓은 범위의 번역 후 수정을 조사하기 위하여 확장될 수 있었습니다. 단백질 A 구슬을 안티 GFP 항체로 결합하는 것으로 시작합니다. 에탄올을 제거하기 위해 완충A1을 3회 이상 정제한 면역침전 반응당 단백질 A 비슬 25개소를 세척한다.그런 다음 버퍼 A1을 사용하면 50% 비드 솔루션을 만듭니다. 구슬에 항GFP 항체의 2개의 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 버퍼 A1을 순 비드 볼륨의 20배에 추가합니다. 4~18시간 동안 섭씨 4도에서 종단 회전을 수행합니다.회전에 대한 최적의 지속 시간은 면역 침전의 효율에 따라 경험적으로 결정되어야합니다. 회전 후 1분 동안 구슬을 100배 g로 원심분리하고 바운드되지 않은 상체를 제거합니다. 버퍼 A1을 추가하여 구슬의 50% 용액을 만들고 각 면역 침전 반응에 대해 이 솔루션의 25 마이크로리터를 사용합니다.면역 침전을 수행하기 위해 초음파 처리 및 동결 / 해동을 통해 버퍼 A1에서 세포를 lyse합니다. 단백질 농도를 측정하고 다른 IP 샘플 중 단백질 양을 정상화한다. 그런 다음 SDS 페이지에서 실행하려면 각 튜브에서 샘플의 5 %를 제거합니다.나머지 리자테를 25마이크로리터의 단백질 A 비드를 안티-GFP 항체에 결합하고 4~18시간 동안 섭씨 4도에서 종단 간 회전을 수행한다. 완충A에서 세포를 용인하고 이전에 설명한 바와 같이 면역 침전제를 수행한 후, 전체 면역 침전제의 10%를 유지하여 EYFP CENP-A 유비쿼터틸레이션을 확인하고 유비쿼터스 EYFP CENP-A의 위치를 정확하게 결정한다. 질량 분석 분석에 다른 90%를 사용합니다.시판 되는 4-12%비스-트리스 단백질 젤에서 질량 분광법 샘플을 실행합니다. 그런 다음 쿠마시 블루 염색을 수행하고 질량 분광분석을 위해 50-70 킬로달톤 젤 영역을 절제합니다. 각 젤을 작은 조각으로 슬라이스한 주사위로 0.5 밀리리터 저단백질 결합 튜브에 넣습니다.25 밀리모어 암모늄 중탄산염으로 50%의 아세토닐릴 100마이크로리터로 젤 조각을 씻으시다. 10-15 분 동안 소용돌이. 그런 다음 그들을 아래로 회전하고 상체를 폐기합니다.마지막 세척 후, 30 분 동안 벤치 상단 진공 농축기젤 조각을 건조. 마이크로리터 시퀀싱 등급 트립신당 10 나노그램의 마이크로리터 10개를 추가하고 젤 조각이 5분 동안 수분을 보충하도록 합니다. 그런 다음 25 밀리몰러 암모늄 중탄산염을 추가하여 젤 조각을 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 소화할 수 있을 만큼 충분합니다.다음 날, 소화된 수퍼나티를 깨끗한 0.65 밀리리터 실리콘 튜브로 옮기고 50%의 아세토닐릴과 5%의 포믹산 용액을 추가합니다. 10 분 동안 샘플을 소용돌이. 그런 다음 그것을 아래로 회전하고 추출 튜브로 상체를 전송합니다.샘플을 두 개의 마이크로리터에 다시 농축합니다. 그런 다음 3%의 아세토닐릴과 2%의 마이크로리터 8개와 포믹산 용액을 추가합니다. 15 분 동안 소용돌이를 내고 30 분 동안 16, 000 배 g로 회전합니다.질량 분석 기기와 결합된 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 LC-MS/MS로 MS 데이터 수집을 수행합니다. 시료의 8마이크로리터를 역상 액체 크로마토그래피 컬럼에 주입하고 원고 지시에 따라 60분 만에 용매 B의 2-80% 그라데이션으로 펩티드를 분리한다. 데이터 종속 획득 모드를 사용하여 대량 분광법 데이터를 수집합니다.상용 소프트웨어를 열어 데스크톱의 질량 분석 데이터를 분석합니다. 새 검색을 시작하려면 상단 메뉴의 LC 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 추가 버튼을 클릭하여 원래 MS 원시 데이터 파일을 업로드합니다.데이터베이스 검색 방법으로 파라곤 방법에서 인간 단백질 ID를 선택하고 UniProt 호모 사피엔스 데이터베이스에 대한 원본 MS 원시 데이터 파일을 검색합니다. 트립신을 소화 효소로 선택하고 원고 방향에 따라 나머지 매개 변수를 설정합니다. 결과 파일 이름을 입력하고 메뉴 오른쪽에 있는 단추로 저장을 클릭합니다.그런 다음 검색 결과를 저장하기 위한 폴더를 선택하고 저장 단추를 클릭합니다. 프로세스 버튼을 클릭하여 검색을 시작합니다. 검색이 끝나면 입력된 검색 이름이 있는 데이터가 선택한 폴더에 자동으로 저장됩니다.임의의 특정 펩티드의 MS/MS 스펙트럼을 얻으려면, 소프트웨어 F.에서 검색 결과를 열고 상단 메뉴의 단백질 리스트에 있는 단백질을 클릭하고 중간 메뉴에서 펩티드를 클릭한다. 이 펩티드의 MS/MS는 메뉴 하단에 나타납니다. MS/MS 스펙트럼을 내보내고 저장하려면 스펙트럼을 복사하여 적절한 파일 형식으로 붙여 넣습니다.내인성 CENP-A의 손실을 구출하는 EYFP CENP-A 야생형 또는 K124R 돌연변이의 유전자 구조는 레트로바이러스 통합이 수행되었을 때 안정적으로 표현되었다. 내인성 CENP-A의 발현은 Cre 재조합의 유도 후 7일 후에 검출되지 않았다. EYFP CENP-A 야생형과 K124R 단백질 발현은 초기 내인성 CENP-A 단백질과 유사한 수준으로 나타났다.EYFP CENP-A 야생형과 K124R 돌연변이는 내인성 CENP-A의 남은 발현이 중단된 후 7일 만에 백중항국화를 보였다. EYFP CENP-A 야생형과 K124R 돌연변이는 태그가 지정되거나 태그가 지정되지 않은 CENP-A 와일드 타입및 K124R 돌연변이체와 달리 HJURP와 의한 유비쿼터티 및 상호 작용을 보였다. 세포 생존능력은 남은 내인성 CENP-A 알렐의 붕괴 후 14일 동안 콜로니 아웃성장 분석서를 수행하여 평가되었다.EYFP CENP-A 야생형과 K124R 돌연변이체는 남은 내인성 CENP-A 알레의 붕괴 후 14일 만에 비슷한 수의 구조된 콜로니를 보였다. IP 질량 분광법은 CENP-A 마이너스 F 세포에서 EYFP CENP-A K124R에서 리신 306에서 유비쿼터티를 공개했다. 모두 함께, 이러한 결과는 대형 단백질의 융합이 원래 K124R 단일 돌연변이 표현형을 억제하는 CENP-A에서 K124R 이외의 리신에서 유비쿼터티화를 유도한다는 것을 시사한다.이 프로토콜을 시도할 때, 대량 분광법 샘플을 실행하기 위하여 상업적으로 이용가능한 4%12%비스-트리스 단백질 젤을 사용하십시오. 젤 조각에 적절한 트립신을 추가하고 모든 효소가 흡수 될 때까지 재수화하십시오. 낮은 분자량 태깅 또는 프로빙 기술은 실제로 유비쿼터스를 시각화하고 전체 유기체 수준에서 공간 측두단백질 유비쿼터틸화 신호를 조사하는 데 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

EYFP 태그가 지정된 CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비퀴틸화를 식별하기 위한 질량 분석

걱정의 정량 분석​​ (포스터 공명 에너지 전송) 신호를 포함하는 새로운 방법을 효소 반응 속도론을 연구에 설명되어 있습니다.

정량은 SENP1 단백 분해 효소 반응 속도론 결정에 대해 (포스터 공명 에너지 전송) 분석 안달

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

여기에서는 인간 세포에서 내인성 및 외인성 centromere-kinetochore 단백질을 검출하고 고정(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올 고정)을 통한 간접 면역형광 염색을 통해 centromeres-kinetochores에서 이러한 단백질 수준을 정량화하는 프로토콜을 보고합니다.

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

여러 조사, 생 포스트 번역 상 수정 대상 단백질에 대 한 매우 도전 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술 개발 특정 PTM 타겟팅, 선호도 행렬 acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, 및 티로신 인 산화 수정 대상에 대 한 검색에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 및 필터 시스템 활용 간소화 된 단일 시스템을 사용 하 여 단백질입니다.

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

배우세요 질량 분광분석을 이용하여 EYFP-CENP-A의 유비쿼터션 부위를 식별하는 방법을. 면역침전과 질량 분석을 통해 세포 생존에 필수적인 센트로미어 조립 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

EYFP 태그CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석

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