Name: 면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 면역형광법을 이용한 섬모 검출 방법으로 섬유아세포에서 1차 섬모를 신속하게 시각화합니다. 이 기술은 세포 신호 전달 및 질병 메커니즘 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 체코 국방부에 의해 지원되었다 - 장기 조직 개발 계획 군사 보건 과학 학부의 대량 살상 무기의 의료 측면, 국방부; 교육부, 청소년 및 스포츠, 체코 (특정 연구 프로젝트 번호: SV / FVZ201703) 및 PROGRES Q40/06. 또한 다니엘 디아즈에게 영어 개정에 대한 그의 친절한 도움에 감사드립니다.

1. 문화 매체, 솔루션 및 요리 준비
<ol><li>커버립(22 x 22mm)을 자동 클래브합니다. 6 개의 잘 접시를 준비하십시오. 태아 소 혈청 (FBS) 및 항생제 페니실린 / 연쇄 절제술을 하고 문체 배지를 실온 (RT)으로 따뜻하게합니다. 트립신-EDTA 사용 (0.25%) 및 1x PBS (칼슘과 마그네슘을 곁들인 인산염 완충식식염)이 세포를 통과한다.</li>
	<li>dH2O (800 mg의 PFA 에서 dH2O)로 신선한 4 % 파라 포름알데히드 (PFA)를 준비하십시오. PFA는 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다. 후드에서 30 분 동안 55 °C에서 용액을 저어 가열합니다. RT에서 냉각하십시오. 용액이 명확해질 때까지 1M 수산화 나트륨을 추가하십시오(pH = 7.2-7.4). 최대 1 주일 동안 4 °C에 보관하십시오. 참고: PFA는 독성; 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 화학 후드에 준비합니다.</li>
	<li>문화 매체 500mL, DMEM(덜벡코의 수정 독수리 매체)은 10% FBS, 1% 페니실린/연쇄절제술, 글루타민 2%를 함유하고 있습니다.</li>
	<li>멸균 dH2O (130 mg의 젤라틴 130 mg dH2O)로 13 mL의 젤라틴 용액13 mL을 준비하십시오. 6 웰 플레이트에 각 웰마다 1 % 젤라틴 2 mL을 사용합니다. 멸균을 유지합니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 사용하여 라미나르 플로우 후드를 청소하십시오. 실험을 시작하기 전에 라미나르 흐름 후드 내부에 필요한 재료를 배치합니다.</li>
</ol>2. 면역 세포 화학 염색을위한 세포 배양
<ol><li>표준 기술을 사용하여 세포(본 연구에서 C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)를 해동하고 준비된 매체의 ~10-12mL로 보충된 T75 플라스크에서 이를 플레이트한다. 세포가 70%에 도달할 때까지237°C/5% CO 2/90%의 상대 습도(RH)에서 배양한다.</li>
	<li>인큐베이터에서 세포를 제거하고 라미나르 흐름 후드에 배치합니다. 배양 매체를 제거하고 1x PBS로 세포를 2배 짧게 헹구는 다. T75 플라스크에 0.25% 트립신-EDTA의 ~2mL를 넣고 ~5분 동안 37°C에서 배양한다. 세포 분리를 모니터링하기 위해 반전 된 현미경에 주기적으로 확인하십시오. 참고: 잠복기 시간은 세포주에 따라 다르므로 경험적으로 결정되어야 합니다.</li>
	<li>10mL의 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재봉, 조심스럽게 파이펫팅하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 필요한 경우 플라스크를 다시 헹구십시오.</li>
	<li>셀 서스펜션을 50mL 원심관과 원심분리기를 ~200 x g에서 5분 동안 배치합니다. 상류제를 데칭하고, 문화 매체의 10mL를 추가하고, 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 셀 서스펜션의 20 μL을 복용하고 1:1 비율로 트립팬 블루와 혼합하고 표준 방법에 따라 사이토미터에 세십시오.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 6 웰 플레이트의 각 웰 안에 하나의 커버 슬립을 놓습니다. 웰에 ~ 2 mL을 부어 젤라틴으로 커버립을 코팅합니다. 이렇게 하면 세포가 커버립에 부착하는 데 도움이 됩니다. 젤라틴 용액을 제거하고 몇 분 동안 공기 건조하게하십시오. 커버립은 이제 세포의 재배를 위한 준비가 되었습니다. 즉시 재배를 시작합니다.</li>
	<li>각 우물에 100,000 섬유 아세포를 씨앗과 문화 매체의 2 mL을 추가합니다. 37°C/5% CO 2/90% RH에서224시간 동안 세포를 배양한다. 이 시점에서, 세포는 사용자의 요구에 따라 처리될 수 있다. 섬모를 유도하는 치료법은 이전에4,,5로기술되었다. 참고: 초기 시드 번호는 셀의 두 배 시간에 따라 달라지며 그에 따라 결정되어야 합니다.</li>
</ol>3. 체외에서 1 차 적인 섬모의 면역 형광 염색
<ol><li>RT에 4% 파라포름알데히드를 따뜻하게 하십시오. 파스퇴르 파이펫, 1x PBS(RT), 폐기물 용기, 15mL 원문 관, 마이크로파이프(0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1,000 μL) 및 팁. 인큐베이터에서 세포를 가져 와서 벤치에 놓습니다. 참고: 염색 절차는 멸균 조건에서 수행 될 필요가 없습니다. 모든 솔루션은 RT에 있어야 합니다.</li>
	<li>각 우물에서 미디어를 제거합니다. 커버슬립을 우물 안에 둡니다. 매우 부드럽게 1 x PBS의 2 mL로 셀 3 x를 씻으십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 각 웰에 4% PFA의 2mL을 추가하여 세포를 수정합니다. RT에서 10분 동안 배양하십시오. PFA를 제거하고 1배 PBS로 3배 세척합니다. 참고: 항상 충분한 볼륨을 사용하여 인큐베이션 기간 동안 전체 커버슬립을 덮습니다. 세포를 건조시키지 마십시오. 커버슬립에 직접 솔루션을 붓지 마십시오.</li>
	<li>사용하기 10분 전에 13mL로 0.5% 트리톤 X-100을 준비한다. 각 웰에 2mL를 추가합니다. 15분 동안 배양합니다. 1x PBS로 부드럽게 4배 세탁하십시오. 참고: Triton X-100은 RT에서 PBS에서 불용성입니다.</li>
	<li>사용 5 분 전에 염소 세럼을 해동하십시오. 염소 세럼을 블로킹 솔루션으로 1:20 비율로 1x PBS로 희석합니다. 각 커버슬립에 150 μL을 추가하고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 참고: 필요한 경우 차단 기간을 최대 60분까지 연장합니다. 염소 세럼으로 차단 한 후 세포를 씻지 마십시오.</li>
	<li>1 차 적인 항체를 해동 (즉, 안티 아세틸화 알파 tubulin 및 항 감마 tubulin) 5 분 사용 전에. 1x PBS에서 항체를 1:800 비율로 마우스 안티 아세틸화 알파 튜룰린과 토끼 항감마 튜룰린을 1:300 비율로 희석시킨다. 차단 솔루션을 제거합니다. 씻지 마십시오. 커버립에 항체 희석제 150μL을 넣고 RT에서 60분 동안 배양합니다. 참고: 1차 항체 용액의 500-1,000 μL을 하룻밤 동안 배양하는 경우 파라핀 필름으로 6웰 플레이트를 밀봉하고 4°C에 보관하십시오. 또는, 150 μL의 항체를 사용하고 습도 챔버에서 배양한다.</li>
	<li>1 차적인 항체를 제거합니다. 1x PBS 2mL로 커버립을 3x매우 부드럽게 씻으십시오. Cy3 양 항마우스와 알렉사 플루오488 염소 항토끼를 1:300 비율로 희석하여 1x PBS에서 이차 항체를 준비한다. 커버립에 이차 항체 희석제 150 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 45 분 동안 배양하십시오. 참고: 광표백을 피하기 위해 어둠 속에서 배양하십시오. 이차 항체의 그밖 조합은 필요에 따라 이용될 수 있습니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 DAPI(4', 6-디아미드노-2-페닐린돌) 솔루션을 준비합니다. -20°C에 초과 알리쿼트를 저장합니다. 1x PBS의 50mL에서 주식 알리쿼트(1:5,000)에서 10 μL을 희석시희석한다. 커버립에 이 희석 2mL를 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 5 분 동안 배양하십시오. 참고: 광표백을 피하기 위해 어둠 속에서 세포를 배양하는 것이 중요합니다. DAPI 희석은 최대 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>2 개의 바늘, 슬라이드, 핀셋 및 장착 미디어를 준비합니다. 슬라이드에 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>우물에서 DAPI 솔루션을 제거합니다. 1x PBS로 3배 세척합니다. 각 슬라이드에 마운팅 미디어를 한 방울 만 넣습니다. 바늘을 사용하여 우물 바닥에서 커버슬립을 부드럽게 들어 올립니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 뒤집어 마운팅 미디어를 부드럽게 놓습니다. 조심스럽게 거품을 제거합니다.</li>
	<li>슬라이드를 빛으로부터 보호하고 4 °C에서 밤새 보관하십시오.</li>
	<li>높은 배율로 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 1 차 적인 섬모를 시각화하십시오. 참고: 슬라이드는 최대 2개월 동안 4°C의 어둠 속에서 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

몇몇 저자는 1 차적인 섬모의 검출을 위한 다양한 방법을 기술했습니다, 때때로6또한 그들의 검출6,20,,21,,22에영향을 미칠 수 있는 각종 고정 방법을 기술합니다. 에 관계없이 탐지를 위한 완전하고 간단한 프로토콜을 찾기가 어렵습니다. 이러한 방법의 준비 가용성은 의심 할 여지없이 1 차 섬모 조사의 연구에 큰 도움이 될 것입니다, 특히 연구의 초기 단계에서 또는 선택한 세포주에서 기본 섬모의 존재를 테스트하는 빠르고 쉬운 방법. 따라서, 이 프로토콜은 다른 종류의 치료 후 시험관 내 1차 섬모의 검출을 위해 가능한 한 많은 세부 사항으로 기술된다.
본 프로토콜은,매일20,<sup cl...

1 차 적인 섬모는 세포의 어머니 중심과 관련 되 었던 감각, 독방, 막 바인딩, 비 momotile 구조. 1 차 섬모는 적혈구, 백혈구1,및 간세포2를제외한 대부분의 척추 동물 세포에서 발견된다. 1차 섬모는 마이크로튜부에 의해 구성된 길쭉한 축소메로 형성되며, 그 주요 성분은 α-tubulin이다. 축 사 메는 기저체에서 성장, 이는 γ-tubulin에서 구조화. 기본 섬모의 길이는 2-10 μm 사이다릅니다. 그러나, 그 치수는 글리시션, 기아, 저산소증, 세포독성 스트레스, 또는 이온화 방사선3,,4,,5,,6,,7에노출 된 후 변경 될 수 있습니다. 일반적으로, 세포는 세포 증식 및 분화8,,9에중요한 형태 발생 및 세포 신호 경로에 관여하는 단 하나의 1 차실을 갖는다.
1차 섬모는 세포 주기 진행 중에, 특히 G0/G1 단계 동안 동적으로 조절되며, HDAC6(히스톤 deacetylase 6)10에의해 매개되는 튜룰린 탈염과 관련된 과정에서 미토시스를 입력하기 전에 재조판된다. 1차 섬모 재흡수의 정확한 순간은 오로라 A, Plk1, TcTex-1 11,1112,13과같은 이 과정에 직접 관여하는 유전자의 세포 유형 및 발현에 따라 달라집니다.,, 세포 유형에 따라, 1 차 적인 섬모는 수용체의 다른 모형을 표현합니다, 이온 채널, 및 액티브 신호 통로. 이들은 증식및 생존에 영향을 미치는 가장 중요한 신호 수용체를 포함, EGFR, PDGFR, 및 FGFR. 또한 고슴도치, 노치 및 Wnt. 이러한 수용체 및 신호 경로 덕분에 하나 이상의 장기의 기능에 영향을 줄 수 있는 신호 경로 중 일부가 포함되어 있으며, 1차 섬모는 또한 화학 감각 기능을 수행합니다. 이 기능을 통해 1 차 적인 섬모 는 노치에 대 한 특정 리간드를 감지 할 수 있습니다., 호르몬, 그리고 세로토닌 또는 somatostatin 같은 생물학적 활성 물질. 다른 길이의 기본 섬모에 의해 전시 된 다른 특정 기능은 온도, 중력 및 진동(14)의변화에 대한 반응을 포함한다.
1차 섬모는 라이브 시각화, 전송 전자 현미경, 3D 이미징, 또는 1차,섬모5,15,,5,16,17의자동 검출을 위한 소프트웨어에 의해 다양한 방법을 통해 시각화될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 고도로 전문화 하 고 지속적인 연구 연구의 모든 단계에서 기본, 신속 하 고 쉬운 방법을 필요. 기재된 배양된 세포에서 1차 섬모를 검출하기 위한 쉽고 유용한 방법이기 다.

<table><tbody><tr><td>6웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>치수 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab')? 단편: 염소, 항토끼, IgG</td></tr>, <tr><td>항-튜불린 &감마;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>Myoblast (mouse)</td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&prime;)2 단편&ndash; 양에서 생산된 Cy3 항체</td></tr><tr><td>Dapi (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 변형 독수리&급성; S 매체</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>고포도당, 글루타민 없음, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco' MgCl</td><td>2 및 CaCl2 함유</td>된 인산염 완충 식염수 <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td>, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>멸균 여과, Gibco</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>마우스 배아 섬유아세포</td></tr><tr><td>단클론 항 아세틸 화 세틸 화 세불린</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T7451</td><td>마우스에서 생성 된 단일 클론 항 아세틸 화 세틸 화 소련 항체</td></tr><tr><td>NHLF</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td>1 차 폐 섬유 아세포 (인간)</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>158127-500G</td><td>분말</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0781</td><td>0.9% NaCl의 mL당 10,000 단위 페니실린 및 10mg 스트렙토마이신, 멸균 여과</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>피부 섬유아세포</td><td>Hradec Kr&aacute에 있는 Charles University, Faculty of Medicine에서 친절하게 선물; 사랑&eacute;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Square Cover</td><td>Slips Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>붕규산 유리, 22x22mm,</td></tr><tr><td>Square Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>Sterile-Filtered, Gibco</td></tr></tbody></table>

면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

1 차 적인 섬모는 세포 주기 진행 도중 동적으로 통제됩니다, 특히 세포 주기의 G0/G1 단계 도중, 미토시스의 앞에 resorbed되고. 1 차 섬모는 전송 전자 현미경 검사법, 3D 이미징, 또는 1 차 섬모의 자동 검출을 위한 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하여 고도로 정교한 방법으로 시각화될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 수행하기 위해서는 1차 섬모의 면역형성 염색이 필요하다. 이 간행물은 아세틸화 알파 튜룰린 (axoneme)과 감마 튜룰린 (기저 몸)을 염색하여 체외에서 1 차 섬모를 쉽게 검출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 면역 형광 염색 프로토콜은 비교적 간단하고 고품질의 이미지를 초래합니다. 본 프로토콜은 1차 섬모를 발현하는 4개의 세포주(C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)가 어떻게 고정되고 면역염색되고 형광 또는 공초점 현미경으로 이미지되었는지를 설명합니다.

1 차 적인 섬모의 면역 형광 염색은 고품질 심상을 초래하는 상대적으로 간단한 절차입니다. 이러한 실험에서, 1차 섬모를 발현하는 섬유아세포는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 형광 또는 공초점 현미경으로 고정, 면역염색, 이미지화되었다. 1차 실륨은 아세틸화된 α-tubulin 및 γ-tubulin을 사용하여 검출되었다. 1차 섬모의 평가는 다양한 수준에서 수행될 수 있으며 이와 관련하여 임의의 변화는 이온화 방사선, 세포 대사(예를 들어, 기아), 또는 화학적 치료(예를 들어, 세포정전기)5,,18에노출될 수 있다.
1차 섬모에 대한 이온화 방사선의 효과는 조사된 다양한 세포주(예를 들어, myoblast 세포주 C2C12)에서 연구되고 있으며(2, 6, 10 및 20 Gy) 및 1차 섬모 발생률의 변화를 분석하였다. al.4에서필리...

1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

이 프로토콜은 다양한 연구 노력 내에서 배양 된 세포에서 1 차 적인 섬모를 빠르고 쉽게 감지 할 수 있습니다. 방법은 1 차적인 섬모의 기초 바디에 영향을 미치는 무질서에서 이용될 수 있었습니다. 이 절차는 또한 파라핀 임베디드 조직에서 1 차적인 섬모를 염색하거나 형광이 필요한 그밖 실험을 위해 적용될 수 있습니다.22~22mm 커버 슬립을 오토클레이핑하고 실험을 위한 재료를 준비한다. FBS와 페니실린 연쇄 절제술을 해, 그리고 문체 매체를 실온으로 따뜻하게 합니다. 트립신 EDTA 및 PBS로 세포를 통과합니다.원고 의 방향에 따라 신선한 4 % 파라 포름 알데히드, 문화 매체 및 1 % 젤라틴 솔루션을 준비하십시오. 그런 다음 70 %에탄올로 라미나르 흐름 후드를 청소하고 필요한 모든 재료를 내부에 놓습니다. 파라포름알데히드는 매우 위험합니다.적절한 PPE는 항상 착용해야하며 화학 적 후드에서만 처리해야합니다. 원하는 세포를 70%로 성장한 후 인큐베이터에서 분리하여 라미나르 플로우 후드에 놓습니다. 배양 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 헹구는 다.배양 플라스크에 0.25%의 트립신 EDTA의 약 2밀리리터를 추가하고 5분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 분리를 모니터링하기 위해 반전 된 현미경에서 세포를 주기적으로 확인하십시오. 세포가 분리되면 배양 배지의 10 밀리리터에서 부드럽게 다시 중단하여 단일 셀 서스펜션을 만들기 위해 조심스럽게 파이펫팅합니다.셀 서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 200배 G'로 옮긴다. 상류제를 데칭한 다음 10 밀리리터의 배양 배지를 추가하고 펠릿을 부드럽게 재보냅니다. 셀 서스펜션의 마이크로리터 20개를 사용하여 일대일 볼륨 비율로 트라이팬 블루와 혼합하십시오.그런 다음 표준 혈중계를 사용하여 세포를 계산합니다. 6개의 웰 플레이트의 각 웰 안에 커버 슬립을 놓고 커버 슬립을 젤라틴 용액의 2밀리리터로 코팅하여 커버 슬립에 부착된 세포가 미끄러지는 데 도움이 됩니다. 젤라틴을 제거하고 접시가 몇 분 동안 공기 건조하게하십시오.씨앗 100, 000 각 우물에 섬유 아세포와 배양 배지의 두 밀리리터를 추가. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 상대 습도 90%로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 세포를 치료하여 섬광을 유도한다.4%의 파라포름알데히드를 실온으로 데우고 목초지 파이펫, ABS, 폐기물 용기, 15밀리리터 원판 튜브, 마이크로 파이펫 및 팁을 준비합니다. 인큐베이터에서 세포를 가져 와서 실험실 벤치에 놓습니다. 각 우물에서 미디어를 제거하고 덮개가 미끄러져 둡깁니다.PBS의 두 밀리리터로 셀을 세 번 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 세포를 고치기 위해 각 웰에 4 %PFA의 2 밀리리터를 추가합니다. 상온에서 10분 동안 플레이트를 배양한 다음 PFA를 제거하고 PBS로 세척을 반복합니다.각 웰에 0.5%트리톤 X-100의 밀리리터 2개를 넣고 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 PBS로 우물을 네 번 씻으시면 됩니다. 차단 용액을 만들려면 염소 세럼을 5분 동안 해동하고 PBS에서 1 대 20 비율로 희석합니다.이 솔루션의 마이크로리터 150개를 각 커버 슬립에 넣고 플레이트를 20분 동안 배양합니다. 1차 항체를 5분 동안 해동하고, 텍스트 원고에 설명된 대로 PBS에서 별도로 희석한다. 커버 슬립에서 차단 용액을 제거하고 두 항체 용액의 150 마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 상온에서 60 분 동안 접시를 배양하십시오. 1차 항체를 제거하고 PBS의 2밀리리터로 커버 슬립을 세 번 부드럽게 씻습니다. CY3 양 항마우스 및 알렉사 플루오 488 염소 안티 토끼PBS에서 1 ~ 300 비율로 희석하고, 커버 슬립에 두 이차 항체 용액의 150 마이크로 리터를 추가합니다.PBS의 50 밀리리터에 10 마이크로리터를 희석하여 작동하는 DAPI 솔루션을 준비하고 이 희석제 2밀리리터를 커버 슬립에 추가합니다. 상온에서 어둠 속에서 5분 동안 접시를 배양합니다. 커버를 슬라이드에 놓기 전에 두 개의 바늘, 핀셋 및 장착 미디어를 준비하고 모든 슬라이드에 레이블을 지정합니다.우물에서 DAPI 용액을 제거하고 PBS로 세 번 세척합니다. 각 슬라이드에 마운팅 미디어를 한 방울 만 넣습니다. 바늘을 사용하여 우물 바닥에서 커버 슬립을 부드럽게 들어 올립니다.그런 다음 그것을 뒤집어 핀셋을 사용하여 장착 매체의 드롭 위에 부드럽게 놓습니다. 조심스럽게 거품을 제거합니다. 슬라이드를 빛으로부터 보호하고 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오.다음 날에는 높은 배율로 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 1 차 적인 섬모를 시각화합니다. 이 프로토콜은 면역스테인을 고치고, 1차 섬모를 발현하는 다양한 세포주를 이미지화하는 데 사용되었다. 마우스 근세포가 다양한 용량에서 이온화 방사선에 노출되었을 때, 더 높은 용량이 다중 1차 섬모의 출현을 유도하는 것으로 나타났다.낮은 복용량 단일 기본 섬모의 출현 귀 착되 게 하는 동안. 유사하게, 인간 폐 섬유아세포가 저용량으로 방사되었을 때, 단일 1차 섬모는 면역형광에 의해 검출되었다. 1 차적인 섬모에 있는 증가는 신진 대사 스트레스가 1 차적인 섬모의 사건에 영향을 미친다는 것을 보여주는 굶주린 마우스 배아 섬유아세포에서 관찰되었습니다.피부 섬유아세포가 120 나노몰러 독소루비신으로 치료되었을 때, 그들은 단일 1 차실을 표현했다. 더 높은 복용량 여러 기본 섬모의 모양을 유도. 1.25 나노 몰라 탁솔로 치료 된 섬유 아세포도 단일 기본 실륨을 표현했다.그러나 다중 섬모는 더 높은 복용량으로 처리 후에 검출되지 않았습니다. 이 프로토콜을 열 때 모든 PPE 규정을 따라야 합니다. 선택의 세포주의 배양 요구를 명심하고 신중하게 항체를 선택하십시오.이 절차는 세포가 복구할 수 없기 때문에 다른 절차를 직접 따를 수 없습니다. 대신 병렬 실험을 프로그래밍해야 합니다.

simple-detection-of-primary-cilia-by-immunofluorescence

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

후각 감각 뉴런의 섬모는 신호 전달 캐스케이드의 단백질을 포함하고 있지만, 냉동 절편에서 그 분포에 대한 자세한 공간 분석은 어렵습니다. 여기에서는 전체 마운트 라벨링 및 섬모 단백질의 얼굴 시각화를 위한 최적화된 접근 방식에 대해 설명합니다.

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

여기에서는 생체 내 및 생체 외 특정 생리학적 반응에 관여하는 신경 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 고전적인 기술인 c-FOS 단백질 면역조직학적 검출을 기반으로 하는 프로토콜을 제시합니다.

은 C-FOS 단백질 면역 조직 검색 : 특정 생리적 반응에 관여 중앙 진학의 마커로서 유용한 도구<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 전의 VIVO</em

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

이미지를 분석하기 위해 인공 지능(Ai)을 사용하는 것은 일반적으로 사용되는 방법에 비해 강력하고 편향이 적으며 빠른 접근 으로 부상하고 있습니다. 여기서 우리는 Ai가 세포 세포, 1차 섬모를 인식하고 길이 및 염색 강도와 같은 특성을 엄격하고 재현 가능한 방식으로 분석하도록 훈련했습니다.

1차 섬모 평가에 대한 인공 지능 접근 방식

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

고속 비디오 현미경 분석은 비교적 수행하기 쉽고 빠르며 비용 효율적이며 숙련 된 손에는 원발성 섬모 운동 장애의 첫 번째 라인 진단을위한 상당히 신뢰할 수있는 도구로, 진단 및 중증 폐 질환 치료와 관련된 모든 센터에서 사용할 수 있어야합니다.

원발성 섬모 운동장애의 일선 진단을 위한 고속 비디오 현미경 분석

이 방법은 조직 수집에서 섬모 조직 분석에 이르기까지 광물화된 조직의 넓은 영역에 걸쳐 원발성 섬모를 3차원으로 제 자리에서 이미지화하기 위해 ARL13B-CENTRIN-2 형질전환 마우스 모델에서 내인성 신호를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 조직에도 적용될 수 있습니다.

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

층병증 장애는 종종 핵막의 변화를 일으켜 핵 누출 및 누출을 유발할 수 있습니다. 이 연구는 이중 가닥 DNA(dsDNA)와 함께 핵 층을 시각화하는 면역형광 방법을 제시하여 포유류 세포의 핵 구조와 무결성을 평가할 수 있는 수단을 제공합니다.

면역형광에 의한 포유류 세포의 핵 블리빙 및 DNA 누출 검출

배우세요 면역형광법을 이용한 섬모 검출 방법으로 섬유아세포에서 1차 섬모를 신속하게 시각화합니다. 이 기술은 세포 신호 전달 및 질병 메커니즘 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

더 많은 동영상 탐색