호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

이 프로토콜은 유충 제브라피시 아스페르길루스 감염 모델을 보여주며, 이 곰팡이에 대한 선천성 면역 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 유충 제브라피시 모델의 주요 장점은 며칠 동안 감염되는 동안 살아있는 숙주 동물 내부의 면역 세포 병원체 상호 작용 및 감염 진행을 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 모델의 결과는 면역이 손상된 환자의 침습성 아스페르길루스증을 치료하기 위한 새로운 치료 표적의 발견에 적용할 수 있습니다.

유충 제브라피쉬에 포자를 미세하게 주입하는 것은 일관되고 재현 가능한 결과를 얻기 전에 상당한 연습이 필요한 어려운 기술입니다. 미세 주입을 수행하려면 압력 주입기, 진공 압력 장치, 풋 스위치, 마이크로 피펫 홀더, 마이크로 매니퓰레이터, 마그네틱 스탠드 및 플레이트와 함께 제공된 설정을 사용하십시오. 모두 압축 공기 공급원에 연결됩니다.

압축 공기 밸브를 엽니다. 그리고 마이크로인젝터를 켭니다. 압력을 약 25psi로, 강화를 60밀리초로, 진공 압력 단위를 1psi로 설정합니다.

마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 마이크로 주입 바늘에 3-5 마이크로 리터의 PBS 또는 페놀 레드가 함유 된 포자 현탁액을 로드합니다. 그런 다음 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. Aspergillus fumigatus는 인간의 기회주의적 병원체입니다.

장전된 바늘로 피부에 구멍이 날 위험이 있습니다. 바늘은 마이크로인젝터에 매우 단단히 부착되어야 하며, 연구원들은 구멍이 나지 않도록 항상 장갑을 끼고 바늘 주위의 손 움직임에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 바늘 끝이 가장 낮은 배율로 실체 현미경 아래에서 보이도록 미세 조작기를 배치합니다.

바늘을 계속 볼 수 있도록 4배 확대/축소합니다. 그런 다음 날카로운 집게를 사용하여 바늘 끝을 자릅니다. 주입 페달을 밟아 액적의 크기를 시각화합니다.

그리고 약 3나노리터의 포자 현탁액이 나올 때까지 바늘을 계속 자릅니다. 준비가 되면 주입 플레이트에 유충을 배치하는 동안 실수로 바늘에 부딪히지 않도록 미세 조작기와 바늘을 치우십시오. 주입 플레이트에서 E3 트리카인을 붓습니다.

그리고 마취된 2일 된 약 24마리의 유충을 가능한 한 적은 E3로 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 유충이 향하는 방향에 따라 유충을 정렬하고 오른쪽을 향하는 모든 유충을 한 줄로 배치하고 모두 왼쪽을 향하도록 아래 행에 배치합니다. 현미경을 가장 낮은 배율로 설정한 상태에서 바늘이 30-60도 각도로 유충에 가깝도록 미세 조작기를 다시 가져옵니다.

가장 높은 배율로 확대합니다. 그리고 미세 조정 손잡이를 사용하여 바늘의 위치를 추가로 조정하십시오. 포자 현탁액을 유충 옆의 액체에 주입하여 30-70개의 포자가 바늘에서 나오는지 확인합니다.

그런 다음 바늘이 첫 번째 유충 바로 위에 있고 첫 번째 유충 근처에 위치하도록 플레이트를 움직입니다. 바늘을 향하고 있는 유충부터 시작합니다. 이낭 주위의 조직을 통해 바늘을 삽입하고 후뇌 심실로 구멍을 뚫어 유충의 올바른 방향을 얻기 위해 필요에 따라 플레이트를 움직입니다.

바늘 끝이 후뇌실 중앙에 있는지 육안으로 확인합니다. 그런 다음 풋 페달을 밟아 포자를 주입하고 바늘을 부드럽게 집어넣습니다. 양쪽 줄에 모든 유충을 주입한 후 바늘을 다시 치우십시오.

그리고 더 낮은 배율로 확대/축소합니다. 페놀 레드 염료는 각 유충의 뒷뇌에서 여전히 볼 수 있어야 합니다. 주사에 실패한 유충은 모두 처분하고 남은 유충은 새 E3로 접시에서 씻어내어 페트리 접시로 옮깁니다. E3로 유충을 두 번 헹구고 마취에서 회복되었는지 확인하십시오.

주사 직후 유충 8마리를 1.7ml 튜브에 옮겨 넣고 안락사시킵니다. 암피실린과 카나마이신이 함유된 PBS 1mL를 준비합니다. 유충이 있는 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.

그런 다음 PBS 90마이크로리터에 항생제를 첨가합니다. TissueLyser에서 유충을 6분 동안 분당 1800회 진동으로 균질화합니다. 그런 다음 30초 동안 17, 000회 G로 스핀다운합니다.

각 튜브의 균질화된 현탁액을 표지된 GMM 플레이트의 중앙으로 피펫팅하고 일회용 L자형 스프레더를 사용하여 펴 놓습니다. 림에 퍼지지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 2-3일 동안 거꾸로 배양합니다.

그런 다음 형성된 군체의 수를 세십시오. 주입된 나머지 유충을 3.5mm 접시 두 개로 나눕니다. 하나는 약물 치료용이고 다른 하나는 대조군용입니다.

가능한 한 많은 액체를 제거하고 차량 제어 장치가 있는 E3를 한 접시에 추가합니다. 그리고 E3는 타자에 대한 관심의 처리와 함께. 피펫을 사용하여 각 유충을 96웰 플레이트의 우물로 옮깁니다.

그리고 7일 동안 그들의 생존을 모니터링하십시오. 이미징 당일에는 100마이크로몰 PTU가 있는 3.5mm 페트리 접시 하나와 E3 트리카인이 있는 접시 하나를 준비합니다. Z-wedge E 장치의 챔버에 E3 트리카인을 추가하고 P100 마이크로피펫을 사용하여 챔버와 구속 채널에서 기포를 제거합니다.

그런 다음 챔버 외부의 모든 초과 E3 트리카인을 제거합니다. 유충 한 마리를 피펫으로 올려 E3 PTU를 사용하여 접시에 옮깁니다. 그런 다음 가능한 한 적은 액체로 E3 트리카인으로 옮깁니다.

30초 후, 마취된 유충을 상처 및 포획 장치의 장전실로 옮깁니다. 상처 챔버에서 E3 트리카인을 제거하고 장전 챔버로 방출하여 유충의 꼬리를 제한 채널로 이동시킵니다. 유충이 측면, 등쪽 또는 배쪽 측면에 위치하여 거꾸로 된 대물렌즈로 뒷뇌를 이미지화할 수 있는지 확인하십시오.

컨포칼 현미경으로 유충을 이미징한 후 E3 트리카인을 상처 챔버로 방출하여 유충을 구속 채널에서 로딩 챔버로 밀어 넣습니다. 유충을 집어 E3 tricaine이 함유 된 접시로 다시 옮깁니다. 그런 다음 가능한 한 적은 액체로 E3 PTU가 있는 접시에 옮깁니다.

PTU로 헹구고 48웰 플레이트에 다시 옮깁니다. 아스페르길루스(Aspergillus) 포자를 제브라피시 유충의 뒷뇌에 미세주입하고 감염 결과를 모니터링했습니다. 야생형 유충에서는 거의 죽음이 관찰되지 않았으며, 전체 실험에서 80-100%의 유충이 살아남았다.

면역이 억제된 유충에서 생존율의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 감염된 야생형 유충의 군집 형성 단위를 정량화했을 때, 포자의 지속성과 시간이 지남에 따라 느린 제거가 관찰되었습니다. 감염 후 1일, 2일, 3일, 5일, 7일에 생존하는 포자의 수를 주입된 포자의 수로 정규화하여 복제본 간의 지속성과 제거율을 비교했습니다.

대식세포를 라벨링했을 때, 유충의 약 50%에서 마이크로세포 군집이 관찰되는 것은 일반적으로 감염 후 2-3일 후부터 관찰되었습니다. 호중구 모집은 지연되었는데, 주로 진균 발아 후에 발생했다. 곰팡이 부담은 대부분의 유충에서 전체 실험 동안 지속되었습니다.

일부 지역에서는 감염 후 5일 후에 완치가 관찰되었습니다. 유충의 또 다른 하위 집합에서는 뒷뇌 외부 영역으로의 곰팡이 전파가 관찰되었습니다. 이낭 주변 지역은 이러한 전파가 발견된 한 위치입니다.

곰팡이 발아는 일반적으로 유충의 60%에서 5일 이내에 관찰되었습니다. 식세포 군집 면적, 대식세포 모집 및 호중구 모집은 모든 유충에서 시간이 지남에 따라 다양했습니다. 일부는 실험 전반에 걸쳐 상승 추세를 보이고 다른 일부는 시간이 지남에 따라 해결됩니다.

이 절차는 CRISPR과 같은 제브라피시의 유전자 조작과 결합하여 아스페르길루스에 대한 성공적인 선천성 면역 반응에서 특정 숙주 경로에 대한 요구 사항을 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 아스페르길루스 선천성 면역 세포 상호 작용을 살아있는 온전한 숙주에서 실시간으로 시각화할 수 있었습니다.