Name: 진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포를 분리하는 방법을. 1mg 조직당 최대 200개의 칼슘 내성 심근세포를 얻어 심장 질환 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 실험 의학의 월터 브렌델 센터에서 안드레아스 덴도르퍼감사하고 싶습니다, LMU 뮌헨, 슬라이스 프로토콜에 대한 도움. 인간 심근 조직 샘플을 제공하기 위해 우리는 심장 외과의 학과에서 가잘리 미나바리와 크리스티안 하임, 대학 병원 에를랑겐, 에리히 & 한나 Klessmann 연구소에서 헨드릭 밀팅, Ruhr-대학 보훔과 무한나드 알카사르 소아 심장 학부, 대학 병원 에를랑겐에서 감사드립니다. 흐름 세포측정을 지원하기 위해 우리는 번역 연구 센터 (TRC), 대학 병원 에를랑겐에서 사이먼 Völkl과 동료에게 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 기술 지원을 위해 세포 및 분자 생리학 에를랑겐 연구소의 로렌츠 맥카고와 셀린 그뤼닝거에게 감사드립니다.
이 작품은 DZHK에 의해 지원되었다 (심장 혈관 연구를위한 독일 센터), 임상 연구를위한 학제 간 센터 (IZKF) 에를랑겐 뉘른베르크 대학의 대학 병원에서, 그리고 Universitätsbund 에를랑겐 뉘른베르크.

쥐를 가진 모든 실험은 동물 관리 및 사용 위원회 미텔 프랑켄, 바이에른, 독일에 의해 승인되었습니다. 인간 심장 조직 샘플의 수집 및 사용은 에를랑겐 뉘른베르크 대학과 루르 대학 보훔대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 헬싱키 선언 지침에 따라 연구를 수행했습니다. 환자는 조직 수집 전에 서면 통보 된 동의를 주었습니다.
암컷 위스타 쥐(150-200 g)는 시판적으로 얻어지고, 100 mg/kg의 티오펜탈 나트륨을 주사하여 마취하고, 자궁 경부 탈구에 의해 안락사되어 흉부 절제술과 심장 절제에 뒤따랐다. 인간 심장 조직 샘플은 기계 보조 장치의 이식 중에 좌심실 정맥 코어에서 수집되었으며, 중격 절제술에서, Fallot 교정 수술의 테트라로지에서, 또는 절제 된 심장의 무료 좌심실 벽에서 수집되었습니다. 다음 프로토콜은 인간 심실 조직에서 격리를 설명합니다. 쥐 심근세포의 분리는 그에 따라 수행되었지만 다른 효소(재료 표참조). 프로토콜의 회로도 워크플로우는 그림 1에설명되어 있습니다.
1. 완충제, 솔루션 및 효소 준비
<ol><li>표 1에나열된 버퍼 및 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>용액 1, 2, 3 및 수정된 Tyrode의 용액을 37°C로 데우기. 사용 전까지 절삭 액을 4°C로 저장합니다. 참고: 1-2심근 슬라이스의 경우 총 약 15mL, 8mL 및 5mL의 용액 1, 2 및 3mL의 용액은 하나의 35mm 조직 배양 접시에서 격리가 필요합니다. 여러 접시에서 동시 심근세포 절연을 위해 그에 따라 확장하십시오. 절단 용액은 몇 달 동안 -20 °C에서 동결 및 보관 할 수 있습니다.</li>
	<li>단백질제 XXIV 1 mg(재료 표 참조)을미리 냉각된 15mL 원심분리기 튜브에 넣고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. 이것은 하나의 샘플을 처리하기위한 것입니다. 그에 따라 양을 확장합니다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오.</li>
	<li>콜라게나아제 CLSI 8 mg(재료 표 참조)을15mL 원심분리기 튜브에 넣고 사용전까지 얼음에 보관하십시오. 이것은 하나의 샘플을 처리하기위한 것입니다. 그에 따라 양을 확장합니다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오. 주의: 효소 분말의 흡입을 피하기 위해 얼굴 마스크를 착용하거나 연기 후드 아래에서 작업하십시오. 참고: 효소 활성은 다른 제비에서 다를 수 있습니다. 따라서, 최적의 농도가 다를 수 있으며 새로 구입한 각효소(16)와함께 결정되어야 한다.</li>
</ol>2. 심근 조직의 저장 및 운송
<ol><li>냉각, 4°C 절삭 용액(표1)에인간의 심장 샘플을 저장 및 운반한다.</li>
	<li>추가 조직 처리 및 진동 슬라이싱에 동일한 솔루션을 사용합니다. 참고: 생검 및 외과 심장 샘플은 4°C에서 절삭 용액으로 즉시 이송되어야 하며, 이 프로토콜을 적용하기 전에 최대 36시간 동안 4°C에서 저장또는 운반할 수 있다.</li>
</ol>3. 조직의 처리 및 슬라이스
참고: 조직 슬라이스 프로토콜은 피셔 외15를따릅니다.
<ol><li>티슈 블록트리밍 주의: 인간의 심장 조직은 잠재적으로 전염성이 있습니다. 항상 보호복을 사용하고 기관의 안전 규정을 준수하십시오. 사용 된 블레이드를 조심스럽게 처리하고 안전 용기에 폐기하십시오.<ol>
<li>표본을 20mL 냉삭식 용액으로 채워진 100mm 조직 배양 접시에 넣고 냉각된 4°C 플레이트를 유지합니다.</li>
		<li>메스로 과도한 섬유질 조직과 상복부 지방을 제거하십시오. 교원 간 표본의 경우 내카르듐 근처의 trabeculae 및 조직 층을 제거하십시오. 참고: 섬유질 조직은 뻣뻣하고 흰색으로 나타납니다. 지방은 일반적으로 부드럽고 흰색에서 노란색으로 나타납니다. Trabeculae 및 내내막 조직 층은 상피 층의 심근에 비해 느슨한 조직 조성 및 비정렬 섬유 배향으로부터 식별 될 수있다</li>
		<li>최적의 진동 처리를 위해, 더 큰 조직 견본에서 메스로 약 8mm x 8 mm x 8 mm의 직사각형 조직 블록을 잘라. 작은 생검이 이 단계를 건너뛰고 아가로즈 포함으로 이동하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>저융점 아가로즈에 심장 조직을 포함<ol>
<li>유리 비커에 절삭 용액의 10 mL에 저융점 아가로즈 400 mg을 끓입니다. 주의: 화상을 피하기 위해 장갑과 안전 안경을 착용하십시오. 열 보호 마모로만 핫 유리 제품을 처리하십시오.</li>
		<li>뜨거운 용존 아가로즈 젤로 10mL 주사기를 채웁니다. 주사기를 밀봉하고 아가로즈가 37°C 의 수조에서 15분 이상 평형화되도록 하십시오.</li>
		<li>집게를 사용하여 숙성된 심장 표본이나 생검을 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 넣고 에피카르듐을 아래로 향하고 멸균 면봉으로 과도한 액체를 제거하십시오.</li>
		<li>주사기를 비우고 조직 위에 평형 아가로즈(3.2.2단계)를 붓습니다. 아가로즈를 붓는 동안 집게로 운동에 대한 조직을 확보하십시오. 조직이 아가로즈에 완전히 침지되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>즉시 접시를 얼음 위에 놓고 아가로즈가 10 분 동안 굳어지게하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>심근 을 슬라이스<ol>
<li>새로운 면도날을 진동의 블레이드 홀더에 장착하고 가능하면 블레이드의 z-편향을 조정하여 진동을 보정합니다. 참고: 이 프로토콜은 적외선 보조 교정 장치와 진동을 사용하여 블레이드를 최소한의 z-편향(측정된 편향 및 0.1 μm)으로 수평 위치에 정렬합니다.</li>
		<li>메스를 사용하여 진동의 표본 홀더에 맞는 아가로즈 조직 블록을 절제하십시오. 안정성을 보장하기 위해 조직이 여전히 아가로즈 (아가로즈 마진 ≥ 8mm)에 충분히 침지되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>아가로즈 블록을 시편 홀더에 고정시 얇은 층의 시아노아크라일레이트 접착제와 부드러운 압력으로 고정합니다.</li>
		<li>시편 홀더를 티슈와 함께 진동 욕조에 넣습니다. 절단 용액으로 목욕을 채우고 진동의 외부 냉각 탱크에 채워진 분쇄 된 얼음으로 가공 내내 4-6 °C에서 유지하십시오.</li>
		<li>≤0.1 mm/s의 전진 속도, 80Hz의 진동 주파수, 1.5mm의 측면 진폭, 15°의 블레이드 각도로 300μm 두께의 슬라이스를 생성합니다. 슬라이스를 처리 할 때, 조직 자체 대신 아가로즈를 잡고 조직 손상을 피하십시오. 필요한 경우 최대 2시간 동안 절단 용액에 슬라이스를 저장합니다. 참고: 심근세포는 진피에 병행하여 지향됩니다. 따라서 과도한 심구체 손상을 피하기 위해 에피카르듐과 병행하여 절단하는 것이 중요합니다. 일정한 두께의 균일한 조각만 절연에 사용해야 하므로 처음 1-3 개의 슬라이스를 버리는 것이 좋습니다. 작은 조직 생검에 대 한, 그러나, 단지 첫 번째 조각을 폐기.</li>
		<li>40-100x의 배율로 표준 광 현미경의 밑에 심근세포 정렬을 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 조직 소화
<ol><li>실험실 셰이커에 열판을 놓고 37°C로 데우십시오. 65 rpm에서 실험실 셰이커를 시작합니다.</li>
	<li>단백질아제(1.3단계에서 제조)를 용액 1(1.1 단계 및 1.2단계)에 2mL로 용해하고 사용전까지 37°C에서 배양한다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오.</li>
	<li>콜라게나아제(1.4단계에서 제조)를 용액 1(1.1 단계 및 1.2단계)에 2mL로 녹이고 사용전까지 37°C에서 배양한다. 단백질과 콜라게나아제는 섞지 마십시오. 주의: 용존 효소가 피부와 눈 부상을 일으킬 수 있기 때문에 보호 안경과 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>염화물(CaCl2)을콜라게나아제 함유 용액(4.3단계에서 제조)에 추가하여 5μM의 최종 농도를 가짐니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 진동 욕조에서 5mL의 미리 냉각 된 절단 용액 (1.1 및 1.2 단계)으로 채워진 깨끗한 60mm 조직 배양 접시로 조직 조각을 옮기고 얼음을 유지하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 블레이드 또는 집게심심심부로 심근 조직에서 아가로즈를 제거합니다. 참고: 심근 조각의 과도한 장력과 전단 응력을 피하십시오.</li>
	<li>초기 세척을 수행하려면, 열판에 깨끗한 35mm 조직 배양 접시를 놓고 2mL의 예열(37°C) 용액 1로 채우십시오. 1-2심 슬라이스를 조리된 접시에 포셉으로 옮기세요. 1mL 파이펫으로 용액을 흡인하고 세척 단계 2x를 수행하여 절단 용액의 잔재를 제거합니다. 참고: 심장 조각을 흡인하지 마십시오. 솔루션과 슬라이스는 교반 열판에서 35 °C의 일정한 온도에 남아 있어야합니다. 필요한 경우 열판 온도를 조정합니다.</li>
	<li>접시에서 용액 1을 제거하고 단백질제 용액의 2mL(단계 4.2)를 추가합니다. 65 rpm에서 열판에서 12 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>2mL의 예동용 1(37°C)로 2배 세척합니다.</li>
	<li>접시에서 용액 1을 제거하고 콜라게나제 용액 2mL(4.3 단계 및 4.4)를 추가합니다. 65 rpm에서 열판에서 적어도 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>가벼운 현미경 아래에 접시를 배치하여 30, 35, 40 분 등에서 무료 개별 심근세포에 대한 확인. 솔루션의 상당한 냉각을 피하기 위해 신속하게 작업할 수 있습니다. 참고: 필요한 소화 시간은 조직 체질 및 섬유증 정도에 따라 달라질 수 있습니다. 조직이 눈에 띄게 부드러워지고 부드럽게 당길 때 쉽게 해리되는 즉시 최적의 소화 시간에 도달했습니다. 충분한 조직을 사용할 수 있는 경우, 여러 조각은 다양한 소화 시간과 병행하여 소화될 수 있습니다.</li>
	<li>조직이 소화되고 개별 심낭이 보이면(단계 4.11), 2mL의 예온용 2(37°C)로 세척하고 2mL로 다시 채웁니다.</li>
</ol>5. 조직 해리
<ol><li>섬유를 조심스럽게 분리하여 소화된 조직 조각을 집게로 분리합니다.</li>
	<li>일회용 파스퇴르 파이펫(개구부 직경 >2 mm)으로 여러 번 조심스럽게 파이펫을 사용하세요. 참고: 집게와 파이펫팅을 사용하면 기계적 스트레스를 유발하고 심근세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 그러나, 그것은 세포의 분리를 위한 결정적인 단계입니다. 미세 한 집게를 사용하여 셀 손상을 최소화하고 조각을 작은 조각으로 조심스럽게 분리하십시오.</li>
	<li>광 현미경하에서 해방된 막대 모양의 심근세포에 대해 확인하십시오.</li>
</ol>6. 생리칼슘 농도 재도입
<ol><li>열판에서 35°C에서 교반하는 동안 칼슘 농도를 5 μM에서 1.5m로 천천히 증가시면 됩니다. 10mMM 및 100mM CaCl2 스톡 솔루션을 사용하십시오. 권장 단계: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1,200, 1,500 μM. 각 단계 사이의 5 분 인큐베이션 간격으로 증가 된 칼슘 수준에 적응 할 수 있습니다.</li>
	<li>소화되지 않은 조직 덩어리를 집게로 조심스럽게 제거하거나 칼슘 이끝에 180 μm 모공 크기로 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터링하십시오.</li>
</ol>7. 기계 분리 제의 제거
<ol><li>교반을 멈추고 1,000 μL 파이펫으로 상단에서 용액(~700 μL)의 1/3을 천천히 제거합니다. 심근 세포의 포부를 피하십시오. 참고: 소화되지 않은 조직이 제거되면 심근세포가 접시 중앙에 축적되어 세포 없는 용액의 포부를 용이하게 합니다. 그렇지 않은 경우, 세포 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 세포가 35°C에서 10분 동안 퇴적할 수 있도록 한 다음, 슈퍼나탄의 700 μL을 흡인한 다음, 세포를 다시 일시 중단하고, 35mm 조직 배양 접시로 다시 이송하고 7.2단계로 진행한다.</li>
	<li>용액 3의 700 μL을 세포에 추가하고 열판에서 교반을 재개하고 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>7.1 및 7.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 심근세포가 최소 10분, 실온에서 최대 30분 또는 1분 동안 50xg에서 회전할 수 있도록 합니다. 상체를 완전히 제거하고 수정된 Tyrode의 솔루션 또는 원하는 실험 버퍼에서 다시 일시 중지합니다. 참고: 심근세포는 사용하기 전에 37°C 및 5% CO2에서 몇 시간 동안 수정된 Tyrode의 용액(표1)에보관할 수 있습니다.</li>
	<li>40배 및 200배배율의 표준 광 현미경으로 세포 품질을 검증합니다. 참고: 심근세포의 약 30~50%는 막대 모양이어야 하며 멤브레인 블B없이 매끄럽고 명확한 교차 줄무늬를 표시해야 합니다. 실행 가능한 세포의 단지 5-10%는 자발적인 수축을 보여주어야 합니다.</li>
</ol>

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살아있는 심근세포의 고립은 40년 전에 확립되었고 여전히 심장 연구에서 많은 실험적 접근법의 전제 조건이지만 예측할 수 없는 결과를 가진 어려운 기술로 남아 있습니다. 효소 용액을 가진 관상 동맥의 관류를 통해 심근 세포 절연은 일반적으로 작은 동물의 심혼을 위해 이용되고 실행 가능한 세포의 다수를 산출합니다. 그러나, 이것은 상대적으로 복잡한 시스템과 전문 지식이 필요합니다. 더욱이, 대부분의 인간 조직 견본은 이 방법에 적합하지 않습니다, 때문에 그들의 작은 크기 또는 관상 동맥 분기의 부재, 이는 바람직한 인간 심근세포의 격리를 위한 새로운 방법을 만듭니다. 여기에 설명된 프로토콜은 얇은 심장 조직 조각의 외상성 생성을 기반으로 하며, 이는 효소 소화를 받게 됩니다. 그것은 왼쪽 심실 보조 장치 이식에서 apical 코어와 같은 동물 심근 심근 및 인간 심근체에 적용될 수 있습니다, 중격 심근 절제술에서 내막 생검, 또는 절제 된 심근 (보충 표 1참조), 안정적으로 실행 가능한, 칼슘 내성 ...

심근세포 생리학에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있는 길을 열어준 정액 기술은 온전한 심장1에서살아있는 심실 심근세포의 격리이다. 고립 된 심근 세포는 정상적인 세포 구조 와 기능을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다., 또는 생체 내 실험의 결과; 예를 들어, 세포 전기 생리학 또는 심폐소생 수축 커플링의 변화를 평가하기 위해 심장 질환의 동물 모델에서. 추가적으로, 고립된 심근세포는 세포 배양, 약리학 내정간섭, 유전자 전달, 조직 공학 및 많은 그밖 응용을 위해 이용될 수 있습니다. 따라서 심근세포 분리를 위한 효율적인 방법은 기본 및 번역 심장 연구에 근본적인 가치가 있습니다.
설치류와 같은 작은 포유류와 돼지 나 개와 같은 더 큰 포유동물의 심근세포는 일반적으로 조잡한 콜라게나아제 및 / 또는 프로테아제가 함유 된 용액으로 심장의 관상 동맥 관류에 의해 격리됩니다. 이는 심근세포 분리를 위한 "금본위제" 방법으로 설명되어 있으며, 그 결과 실행 가능한 세포2의최대 70%의 수율을 초래한다. 접근은 또한 허용심근세포산출량 3,,4,45의결과로, 인간의 심혼과 함께 이용되었습니다. 그러나 관상 동맥 관류는 관상 동맥 가지를 포함하는 온전한 심근 또는 큰 심근 웨지를 사용할 수 있는 경우에만 가능하기 때문에, 대부분의 인간 심장 표본은 그들의 작은 크기와 적당한 혈관의 부족으로 인해 이 접근에 적합하지 않습니다. 따라서 인간의 심근 세포의 고립은 어렵습니다.
인간 심근 표본은 주로 가변 크기의 조직 덩어리(약 0.5 x 0.5 x 0.5 cm ~ 2 x 2 x 2cm)로 구성하며, 끝막생기 생검6,중격 절제술7,VAD 이식8,또는 심어진 하트9를통해 수득된다. 심근 세포 격리를 위한 일반적인 절차는 가위 또는 메스를 사용하여 조직을 다진 것으로 시작합니다. 세포 대 세포 접촉은 칼슘이 없거나 낮은 칼슘 완충제에 침수하여 중단됩니다. 이것은 원유 효소 추출물 또는 프로테아제 (예 : 트립신), 콜라게나아제, 히알루로니다제 또는 엘라스타제와 같은 정제 효소를 함유한 다중 소화 단계로 이어지며 세포외 매트릭스가 분해되고 심근세포의 해방을 초래합니다. 최종적으로 중요한 단계에서, 생리적 칼슘 농도는 신중하게 회복되어야 하며, 칼슘-역설(10,,11,,12)으로인해 세포 손상이 발생할 수 있다.11 이 격리 방법은 편리하지만 일반적으로 비효율적입니다. 예를 들어, 한 연구는 심근 조직의 거의 1 g후속 실험에 적합한 심근 세포의 충분한 수를 얻기 위해 필요 했다 발견13. 낮은 수율에 대 한 가능한 이유는 조직을 다진의 상대적으로 가혹한 방법. 이 심근 세포는 효소 소화에 의해 방출 될 가능성이 가장 높지만 청크 가장자리에 위치한 심근 세포가 특히 손상 될 수 있습니다.
인간 표본에서 얻은 세포의 격리 효율성 및 품질에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 측면은 조직 허혈의 지속 기간. 대부분의 프로토콜은 좋은 결과를 위한 전제 조건으로 실험실에 짧은 수송 시간을 언급합니다. 이것은 가까운 심장 수술 시설을 가진 실험실에 인간 심실 심근 세포의 연구를 제한합니다. 함께, 이러한 제한은 인간의 심근 세포에 있는 동물 모형에서 중요한 사실 인정의 확인을 방해합니다. 소량의 조직에서 높은 심근세포 수율을 허용하는 향상된 격리 프로토콜은 운송 시간이 연장된 후 심각한 손상없이 바람직하게는 바람직합니다.
여기에 기진도14,,15로생성된 얇은 심근 조직 슬라이스의 효소 소화에 기초한 격리 프로토콜이다. 우리는 조직 조각에서 격리가 가위로 다진 조직 덩어리에서 그것보다 훨씬 더 효율적이다는 것을 보여줍니다. 설명된 방법은 소량의 심근 조직에서 생존 가능한 인간 심근세포의 높은 수율을 허용할 뿐만 아니라 최대 36시간 동안 차가운 심근용액에 저장되거나 운반된 표본에도 적용가능하다.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanedionemonoxime</td><td>Carl Roth</td><td>3494.1</td><td>순도>99%</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Carl Roth</td><td>163.2</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 일수화물</td><td>Alfa Aesar</td><td>B250009</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산</td><td>Fluka Biochemica</td><td>49450</td><td></td></tr><tr><td>낮은 융점 아가로스</td><td>Carl Roth</td><td>6351.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Carl Roth</td><td>A537.1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth</td><td>8551.2</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Dyes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 CLS 유형</td><td>I Worthington</td><td>LS004196</td><td>4 mg / mL (활성 : 280 U / mg)의 인체 조직에 사용콜라</td></tr><tr><td>겐 분해 효소 CLS 유형 II</td><td>Worthington</td><td></td><td>LS004176 1.5 mg / mL (활성 330 U / mg)의 쥐 조직에 사용프로</td></tr><tr><td>테아제 XIV</td><td>시그마 알드리치</td><td>P8038</td><td>0.5 mg / mL (활성&ge; 3.5 U / mg)</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 XXIV</td><td>의 쥐 조직에 사용Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>0.5 mg/mL (활성: 7-14 U/mg)</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>의 인체 조직에 사용됨BD <td>Bioscience</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Compact shaker</td><td>에드먼드 B&uuml; hler</td><td>KS-15 B control</td><td>교반 방향 : 수평</td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>Carl Roth</td><td>EA65.1</td><td>세포 분쇄의 경우 내부 팁 직경이 &ge인 피펫 만 사용하십시오. 2mm</td></tr><tr><td>펜치</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>히트블록</td><td>VWR</td><td>BARN88880030</td><td></td></tr><tr><td>나일론 넷 필터, 180 &마이크로; m</td><td>Merck</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 100, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 35, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 60, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome (VT1200S)</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>Z-편향의 적외선 보조 보정을 위한 VibroCheck 포함</td></tr></tbody></table>

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

동물과 인간의 심혼에서 심실 심장 근세포의 격리는 심장 연구에서 근본적인 방법입니다. 동물 심근 세포는 일반적으로 소화 효소와 관상 관상 관류에 의해 격리됩니다. 그러나 인간의 심근 세포를 고립시키는 것은 인간 심근 세포가 일반적으로 관상 동맥 관류를 허용하지 않기 때문에 도전적이며, 대체 절연 프로토콜은 실행 가능한 세포의 가난한 수율을 초래합니다. 또한, 인간의 심근 표본은 드물며 현장 심장 수술을 받는 기관에서만 정기적으로 사용할 수 있습니다. 이것은 인간 심근세포에 동물에서 사실 인정의 번역을 방해합니다. 여기에 설명된 인간 및 동물 심근에서 심실 심근세포의 효율적인 격리를 가능하게 하는 신뢰할 수 있는 프로토콜이 있습니다. 세포 손상을 최소화하면서 표면 대 부피 비율을 높이기 위해 심근 조직 슬라이스 300 μm 두께는 진동기를 가진 심근 표본에서 생성됩니다. 조직 조각은 프로테아제와 콜라게나아제로 소화됩니다. 쥐 심근은 유동 세포 계수에 의정서를 확립하고 생존 가능한 칼슘 내성 심근세포의 수율을 정량화하는 데 사용되었습니다. 일반적으로 사용되는 조직-청크 방법과 비교하여 막대 모양의 심근세포의 상당히 높은 수율을 보였다(41.5 ± 11.9 vs. 7.89 ± 3.6%, p&lt; 0.05). 프로토콜은 쥐 심근에서와 유사한 수율이 있는 실패하고 실패하지 않는 인간 심근으로 변환되었으며, 다시 조직 청크 방법(45.0 ± 15.0 대 6.87 ± 5.23 세포/mg, p&lt; 0.05)보다 현저하게 높았다. 특히, 제시 된 프로토콜과 함께 가능한 인간의 심근 세포의 합리적인 수를 분리 할 수있다 (9-200 세포 / mg) 조직의 최소한의 양에서 (&50 mg). 따라서, 이 방법은 인간과 동물의 심장 모두에서 건강하고 실패한 심근에 적용가능하다. 더욱이, 감기 심근용액에서 최대 36시간 까지 저장된 인간 조직 표본으로부터 흥분및 수축근구를 분리할 수 있어 현장 심장 수술이 없는 기관의 실험실에 특히 유용한 방법을 렌더링할 수 있다.

격리 효율을 확인하기 위해, 프로토콜은 쥐 심근증과 함께 사용되었고, 실행 가능한 심근세포의 결과 수는 관상 동맥 관류를 통해 격리및 작은 조직 덩어리로부터의 격리에 의해 얻어진 숫자와 비교되었다(청크 절연, 그림 2). 조직 조각으로부터의 청크 격리 및 격리는 동일한 심혼에서 수행되었다. 그러나 관상 동맥 관류를 통한 격리를 위해 온 심장이 사용되었습니다. 관상 동맥 관류는 주로 막대 모양과 교차 줄무늬 심근세포를 산출했다. 심근 슬라이스로부터의 격리로 막대 모양의 세포의 비율이 낮았지만 총 수는 여전히 높았습니다. 대조적으로, 조직 덩어리로부터 격리 한 후, 몇 개의 막대 모양의 세포가 복구되었습니다 (그림 2A). 유동 세포측정은 결과를 정량적으로 비교하는 데 사용되었습니다. 상대적으로 큰 크기와 교차 감소로 인해 심근세포는 일반적으로 전방 및 측면 분산 모두에 대해 큰 값을 표시합니다. 이러한 특성은 유동 세포 분석...

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

이 프로토콜은 운송 시간 후에도 인간과 동물의 심장 샘플과 함께 작동합니다. 밀리그램당 최대 200개의 근세포가 진동편 절단 조직 조각으로부터 분리될 수 있습니다. 심근세포의 전기생리학적, 구조적 및 생화학적 분석은 심장 질환의 메커니즘을 발견하고 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.100밀리미터 의 조직 배양 접시를 채운 후, 20 밀리리터의 냉삭한 용액을 사용하여 조직 샘플을 배양 접시에 놓습니다. 접시에 문화 접시를 섭씨 4도까지 식힙니다. 동물과 특히 인간에게서 살아있는 조직 견본이 잠재적으로 전염성이 있다는 것을 명심하십시오.가위 또는 메스를 사용 하 여, 샘플에서 과잉 섬유 조직 및 상피 지방을 제거 합니다. 더 큰 조직 샘플의 최적의 진동 처리를 위해 메스를 사용하여 조직에서 8 밀리미터 큐브를 자른다. 생검에서 더 작은 견본을 위해, 이것은 필요하지 않습니다.하나는 상피 지방 층에 의해 에피카르늄을 식별 할 수 있습니다. 과도한 지방을 제거한 후, 티슈 블록을 접시에 넣고, 에피카르듐을 아래로 향합니다. 조직 포함을 준비하려면 400 밀리그램의 낮은 융점 아가로즈를 절단 용액 10밀리리터로 끓입니다.뜨거운 용존 아가로즈 젤로 10 밀리리터 주사기를 채웁니다. 주사기를 밀봉하고 아가로즈가 평형화 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 집게를 사용하여 트림 시편을 깨끗한 35mm 조직 배양 접시로 옮기고, 에피카르듐은 아래쪽으로 향합니다.그런 다음 멸균 면봉으로 시편에서 과도한 유체를 제거합니다. 집게를 들고 이동에 대한 표본을 확보하십시오. 그리고 아가로즈의 주사기를 그 위에 비우고 표본을 완전히 몰입시게 하십시오.즉시 접시를 얼음 위에 놓고 아가로즈가 10 분 동안 굳어지게합니다. 사용하지 않은 면도날을 진동의 블레이드 홀더에 장착합니다. 가능하면 블레이드의 Z 편향을 조정하여 진동을 보정합니다.메스를 사용하여 진동의 시편 홀더에 맞는 아가로즈 조직 블록을 절제합니다. 안정성을 보장하기 위해 조직이 여전히 아가로즈에 충분히 침지되어 있는지 확인하십시오. 아가로즈 마진, 적어도 8 밀리미터.시편 홀더에 얇은 시아노아크라일트 접착제를 발라주세요. 그리고 아가로즈 티슈 블록을 홀더에 부드럽게 누릅니다. 절단 용액으로 진동 목욕을 구축 할 수 있습니다.그런 다음 진동의 외부 냉각 탱크를 분쇄 된 얼음으로 채우고 절단 공정 전반에 걸쳐 섭씨 4 ~ 6도의 온도를 유지합니다. 아가로즈 티슈 블록을 포함하는 표본 홀더를 진동 욕조에 넣습니다. 원고에 설명된 진동 설정을 사용하여 300개의 마이크로리터 두께의 슬라이스를 생성합니다.심근세포 섬유가 심실 벽에 정렬되는 방식이기 때문에 병렬 에피카르듐으로 섹션을 만드는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 너무 많은 피해가있을 것입니다. 표준 광 현미경을 사용하여 심근세포와 조직 조각의 정렬을 확인하십시오.조직을 손상시키지 않으려면 조직 자체 대신 아가로즈를 잡으세요. 심근세포 섬유는 균일하게 정렬되어야하며 근구는 수축해서는 안됩니다. 실험실 셰이커에 열판을 놓고 섭씨 37도까지 데우십시오.65 RPM에서 실험실 셰이커를 시작합니다. 단백질을 용액 1의 2 밀리리터에 녹입니다. 그리고 콜라게나아제, 용액 1의 2 밀리리터로 용해하십시오.그러나 단백질과 콜라게나아제는 혼합하지 마십시오. 콜라게나제 용액에 염화칼슘을 추가하여 5개의 마이크로몰라를 최종 농도로 유지합니다. 두 솔루션을 섭씨 37도에서 배양합니다.집게를 사용하여 조직 조각을 깨끗한 60mm 조직 배양 접시로 옮기하십시오. 5밀리미터의 사전 냉각 절삭 용액을 제공합니다. 얼음이나 차가운 접시에 접시를 보관하고 블레이드 나 집게를 사용하여 조직에서 아가로즈를 조심스럽게 제거하십시오.조직 슬라이스의 초기 세척을 수행하려면, 열 블레이드에 깨끗한 35 밀리미터 조직 배양 접시를 놓습니다. 그리고 미리 데워진 용액 1개로 2밀리미터를 채우게 하십시오. 제조 된 접시에 하나 또는 두 개의 조직 조각을 전송합니다.그런 다음 세척 단계에 1 밀리미터 파이펫을 사용합니다. 슬라이스를 세척한 후, 접시에서 용액을 하나씩 제거하고 단백질제 용액의 2밀리리터를 추가합니다. 65 RPM의 셰이커와 함께 열블레이드에서 12분 동안 슬라이스를 배양합니다.미리 데워진 용액 2밀리리터로 티슈 슬라이스를 두 번 더 씻으시면 됩니다. 다음으로, 식기에서 용액을 하나씩 제거하고 콜라게나제 용액 2밀리리터를 추가합니다. 65 RPM에서 흔들리면서 열블레이드에서 적어도 30분 동안 슬라이스를 배양합니다.잠복 15 분 후, 가벼운 현미경으로 접시를 검사하여 무료 개별 심근세포에 대한 확인. 개별 심낭이 보일 때까지 5분마다 계속 확인합니다. 그런 다음, 미리 데워진 용액 2밀리리터로 슬라이스를 두 번 세척하여 대체 소화.그리고 2 개의 밀리리터용액으로 접시를 리필하십시오. 미세 한 집게를 사용하여 조심스럽게 티슈 슬라이스의 섬유를 분리합니다. 심근 세포에 손상을 피하기 위해 신중하게 계속 작동합니다.그리고 파이펫을 여러 번 피펫으로 사용하며 파이펫을 지나면 됩니다. 그런 다음, 막대 모양의 심근세포가 가벼운 현미경으로 접시를 검사하여 분리된 것을 확인합니다. 접시를 다시 37°C의 열판에 놓고 흔들어 서 동요합니다.10 밀리몰러와 100 밀리머 칼슘 염화물 재고 솔루션을 추가하여 조직 현탁액의 칼슘 농도를 5 마이크로몰어에서 1.5 밀리몰러로 천천히 증가시면 됩니다. 칼슘 증가가 완료되면, 남은 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 먼저 서스펜션의 동요를 중지합니다.다음으로, 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 서스펜션 상단에서 용액의 1/3을 천천히 제거합니다. 심근 세포의 포부를 피하십시오. 그런 다음 3개의 용액의 마이크로리터를 세포에 추가합니다.10분간의 교반 후, 이 세척 단계를 반복하십시오. 서스펜션을 15밀리리터 원심분리튜브로 옮기. 그리고 심근세포가 실온에서 퇴적물을 최소 10분, 최대 30분 동안 허용합니다.상체를 완전히 제거합니다. 그리고 수정된 티로드 용액 또는 원하는 실험 버퍼에서 펠릿을 다시 중단한다. 가벼운 현미경을 사용하여 세포 품질을 확인합니다.심근세포의 30~50%는 막 결점 없이 도장 모양으로 매끄럽게 만들어야 합니다. 그리고 표시, 명확한 교차 줄무늬. 격리 효율을 확인하기 위해, 프로토콜은 쥐 심근에 적용되었다.그리고 관상 동맥 관류 및 격리를 통해 격리와 비교하여 작은 조직 덩어리에서. 프로토콜을 사용할 때 막대 모양 의 세포의 낮은 비율이 관찰된 다음 관류에 의해 격리된 후 관찰되었다. 그러나 총 수는 여전히 높았다.대조적으로, 조직 덩어리에서 격리, 적은 막대 모양의 세포를 산출. 유동 세포측정은, 결과를 정량적으로 비교하는 데 사용되었다. 조직 조각에서 심근세포의 분리는 관상 동맥 관류에 의해 얻어진 수율에 도달하지 않습니다.그러나 조직 덩어리에서 심근 세포 격리보다 훨씬 높은 수율을 제공합니다. 다음으로, 프로토콜은 인간 심근에 적용되었다. 심근 조각에서 격리, 하이드 숫자와 막대 모양인간의 심근 세포의 큰 비율을 산출.그리고 둥근 심근 세포의 단지 작은 비율. 심근 조각에서 격리, 조직 덩어리에서 격리 보다 막대 모양의 심근 세포의 눈에 띄게 높은 수 결과. 광정수화는 심근 슬라이스로부터 분리된 후 심근세포 생존가능성이 실질적으로 높다는 것을 확인했습니다.기술된 프로토콜로 분리된 인간 세포는 구조 적 분석을 실시할 수 있다. 알파 액틴 염색, 조밀 한 일반 Z 라인 패턴과 1.92 마이크로 미터의 평균 sarcomere 길이를 공개, 휴식 심근 세포에. LTCC 및 RyR 염색, 명확한 클러스터가 세포막 과 T 튜블러 근처에서 공동 국화되는 것으로 나타났다.고립 된 심근 세포는 흥분 하 고 세포 전기 생리학 또는 흥분 수축 커플링에 대 한 연구에 사용할 수 있습니다. 행동 잠재적인 모양과 지속 시간, 다른 사람에 의해 보고 된 범위에 있었다, 심실 심근 세포에 대 한, 실패 인간의 마음에서. 칸 보컬 라인 스캐닝에 의해 기록 된 칼슘 과도, 자극 후 명확한 업 스트로크를 보여 주었다.그리고, 잡음 비율에 허용 신호. 수축에 의한 심근세포 단축은 하부 세포 경계의 편향으로부터 볼 수 있다. 이 프로토콜에 의해 얻어진 이졸개 심근세포의 수가 많기 때문에 세포 배양이 가능합니다.이것은 인간 심근세포의 유전자 전달, 약리학 시험 및 조직 공학을 허용할 수 있습니다. 중요한 응용 프로그램은 인간 세포에 있는 동물 모형에서 사실 인정의 확인입니다. 심부전은 매우 제한된 치료 옵션을 가진 임상 증후군입니다.향상된 심근세포 격리 기술은 진단과 미래 치료를 위한 세포 표적을 확인하는 것을 도울 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를...

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

이 프로토콜은 청크 소화 접근법을 사용하여 성인 마우스 심장으로부터 단일 심방 심근세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 접근법은 패치 클램프 연구에서 심방 근세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있는 우측 또는 좌심방 근세포를 분리하는 데 사용됩니다.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

우리는 인간 심실 심근 조직의 생체 외 배양을 위한 프로토콜을 제시한다. 수축력 및 동역학에 대한 상세한 분석뿐만 아니라 생체 내 생리 환경을보다 면밀히 모방하기 위해 사전 및 후부하의 적용을 허용합니다.

장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조

배우세요 진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포를 분리하는 방법을. 1mg 조직당 최대 200개의 칼슘 내성 심근세포를 얻어 심장 질환 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

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