독성 테스트를 위해 공기 중 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 공기 액체 인터페이스 기관지 상피 모델
2020년 5월 13일
설명된 세포 배양 및 생체 내 기관지 모델의 세포 배양 및 노출 방법은 독성 검사를 위한 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 것이다.
이 프로토콜은 공기를 통해 인간 기관지 상피 세포를 배양하고 노출시키는 방법을 설명합니다. 이것은 흡입된 입자에 대한 폐의 노출을 연구하기 위한 보다 현실적인 모델입니다. 폐 세포는 폐의 실제 환경과 유사하도록 이러한 방법으로 준비되었습니다. 세포는 점액을 생산하고 단단한 장벽을 형성하여 몇 주 동안 생존 할 수 있습니다. 이 방법은 공기 중 입자의 독성 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 흡입으로 복용한 기도 및 약물의 전염병을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 처음 시도하는 경우 애자일을 생성하려면 전문가의 지식이 필요하다는 점을 명심하십시오. 또한 측정을 위한 전용 장비가 필요합니다. 예열된 세포 배양 배지 또는 CCM에서 세포를 6-well 삽입을 위해 밀리리터당 500, 000개의 세포 농도로 희석하는 것으로 시작합니다. 그리고 250, 12 잘 삽입을 위한 밀리리터 당 000개의 세포. 무균 조건에서 삽입물이 있는 세포 배양 플레이트를 놓고 세포 현탁액을 혼합한 후 세포 배양 삽입물의 멤브레인 위에 피펫으로 예열된 CCM으로 기저 측면으로 채웁니다. 접시를 덮고 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 세포가 포화 상태에 도달 할 수 있도록 7 일 동안 침수 된 상태에서 세포를 배양하고 2-3 일마다 CCM을 변경합니다. 경상피 전기 저항을 측정하려면 젓가락 전극 세트가 추가된 하전된 상피 전압저항계를 사용하십시오. 70% 에탄올로 전극을 청소합니다. 더 긴 전극을 접시 바닥에 닿을 때까지 외부 배양 매체에 놓습니다. 그리고 멤브레인에 닿지 않고 매체의 더 짧은 전극. 셀이 없는 빈 삽입물에 대한 측정값 수집을 시작합니다. 측정이 안정화될 때까지 기다렸다가 저항을 옴 단위로 기록합니다. 이 측정은 셀 또는 블랭크 저항이 없는 인서트 멤브레인의 저항입니다. 각 인서트에 대해 측정을 반복하고 블랭크 저항을 빼서 실제 저항을 구하고 인서트의 표면적을 곱합니다. 인서트의 정점 쪽에서 매체를 제거하고 예열된 CCM을 웰의 기저측 쪽에 추가합니다. 매체는 바닥에서 멤브레인에 닿아야 하지만 인서트 상단으로 누출되지 않아야 합니다. 인큐베이터의 공기-액체 계면에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 7일 동안 세포를 배양합니다. 2-3일마다 기저측 배지를 교체합니다. 입자에 노출되기 직전에 1% 나노 입자 현탁액을 준비합니다. NP를 96% 에탄올로 미리 적십니다. 얼음 위의 비커에 바이알을 1%NPs.Put 최종 농도로 순수한 물을 추가합니다. 서스펜션을 16분 동안 초음파 처리하고, 분산액으로 병을 저어준 다음, 작은 튜브를 통해 병을 연동 펌프에 연결하고 유량을 시간당 25밀리리터로 조정합니다. 노출 하루 전에 자동 노출 스테이션 또는 AES를 켜고 캐비닛의 온도가 37도에 도달하도록 합니다.
개요
본 연구는 독성 테스트를 위해 공기 중 입자의 반복적인 흡입 노출을 시뮬레이션하는 인비트로(in vitro) 기관지 모델 개발에 초점을 맞춥니다. 배양된 인간 기관지 상피 세포는 장기간의 생존력과 실제와 유사한 점액 생성을 보여주어, 본 모델이 독성학 연구 및 감염성 질환 연구에 적합함을 입증합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 독성학
- 호흡 생물학
- 인 비트로(In vitro) 모델
배경
- 현실적인 폐 노출 모델의 필요성
- 흡입 입자 연구의 중요성
- 약물 전달 및 감염성 질환 연구로의 응용
사용된 방법
- 인간 기관지 상피 세포의 세포 배양 기술
- 기액 계면 배양 조건
- 경상피 전기 저항 측정
주요 결과
- 세포가 조밀한 장벽을 형성하고 점액을 생성함
- 제어된 조건 하에서 수주 동안 생존력 유지
- 독성 평가 활용에 대해 검증된 방법
결론
- 개발된 모델은 흡입 입자에 대한 폐 노출을 효과적으로 모사함
- 독성 시험 및 호흡기 연구에 있어 중요한 시사점을 제공함
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
실제와 유사한 인 비트로(in vitro) 기관지 상피 모델은 예측 가능한 흡입 독성 시험과 호흡기 약물 전달 연구에 매우 중요합니다. Calu-3 세포를 이용한 공기-액체 계면(ALI) 시스템은 인간의 기도 조건을 밀접하게 모방하여 반복적인 저용량 노출 연구를 가능하게 하며, 초기 단계의 화합물 평가에서 더 높은 중개 연구 신뢰도를 제공합니다. 이러한 접근 방식은 호흡기 바이오 제약 파이프라인에서 생리학적으로 유의미하고 재현 가능한 모델에 대한 필요성을 충족시킵니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 흡입 화합물이 기도 상피에 미치는 영향에 대한 기전적 위험 제거가 가능합니다.
- 장기간 밀착 연접(tight junction)과 점액 생성을 유지함으로써 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 호흡기 독성 및 안전성 평가에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 상피 장벽 무결성의 정량적 측정을 위해 검증되고 재현 가능한 시스템을 제공합니다.
- 반복적인 저농도 입자 노출에 대한 분석 표준화를 지원합니다.
- 지속적인 흐름 조건에서 공기 중 화합물 효과의 신뢰할 수 있는 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 바이오마커 연구를 위해 질환 관련 기도 모델과 일치합니다.
- in vitro 발굴 단계부터 전임상 흡입 독성 워크플로우까지의 연속성을 보장합니다.
- 실제 노출 시나리오를 모델링하여 후기 단계의 탈락 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 ALI 기관지 모델은 호흡기 치료제 및 흡입 독성 연구를 위한 발견부터 전임상 단계까지의 연속 공정에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 기도 장벽 기능 및 입자 독성에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 재현 가능하고 정량적인 경상피 전기저항 및 생존율 판독값을 제공합니다.
- 분석: 노출 농도 및 전달 용량의 지속적인 모니터링을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 질병 관련 엔드포인트를 통해 in vitro 발견 내용을 전임상 흡입 연구로 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 공기 중 입자 및 약물 연구에 적용 가능한 표준화된 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 호흡기 독성 시험에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 반복 노출 프로토콜의 재현성과 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 호흡기 포트폴리오 개발 시 go/no-go 결정과 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 흡입 화합물 및 제형의 위험 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- ALI 세포 배양 및 상피 장벽 측정에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 지속적인 흐름 노출 및 저항 모니터링을 위한 전용 장비가 필요합니다.
- 노출 프로토콜 및 데이터 분석을 위한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 모델의 제한 범위 내에서 다양한 공기 중 입자 유형 및 농도에 적용 가능합니다.
- 장기간의 배양 기간 동안 세포 생존율과 밀착 연접(tight junction)의 무결성을 유지하는 것이 중요합니다.
