성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

안녕하세요, 저는 크리스 글렘보트스키입니다. 저는 피닉스에 있는 애리조나 대학교 의과대학의 교수입니다. 저는 이곳 피닉스에 위치한 심혈관 중개 센터(Translational Cardiovascular Center)의 소장입니다.

오늘 우리의 새로운 기술을 시연할 두 분, 저의 박사후 연구원이자 교육 교수인 에릭 블랙우드 박사와 선임 연구원 알리나 빌랄 양을 소개하고자 합니다. 현재의 심장 근세포 분리 프로토콜은 배양에서 세포의 수와 생존력을 제한하여 심장 생리학 및 병태생리학에 대한 이해를 심화시키는 데 실험적 교착 상태를 초래합니다. 이 프로토콜은 성체 쥐 심장 세포 분리 과정을 촉진할 뿐만 아니라 단일 마우스 심장에서 심방 및 심실 심장 세포의 세포 수율과 생존력을 동시에 높이는 것을 목표로 합니다.

이 기술은 치료법 발견에 심오한 영향을 미치며, 심방세동과 같은 질병은 세포 유형별 수준에서 더 잘 특성화될 수 있어 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 이전에 미세수술 경험이 없는 개인은 완전한 격리 프로토콜을 시도하기 전에 상행 대동맥 이식 및 삽관 단계를 광범위하게 연습할 것을 권장합니다. 마취된 10주 된 C57 블랙 6J 마우스의 가슴을 복부 중앙에서 턱까지 빠르게 열기 위해 가위를 사용하여 정중선 피부를 절개하는 것으로 시작합니다.

복막에 들어가 둔기 절개로 횡격막을 제거합니다. 양쪽 측면의 흉벽을 따라 절개하여 흉곽을 잘라내고 심장과 흉벽 사이의 섬유질 연결을 잘라냅니다. 흉곽을 완전히 제거한 후 작은 집게와 가위를 사용하여 심장의 정점을 부드럽게 들어 올려 심장의 뒤쪽을 노출시킵니다.

심장을 이식하려면 상행 대동맥의 무동 동맥보다 바로 하동맥을 절개하고 즉시 심장을 얼음처럼 차가운 심장 관류 배지에 넣습니다. 남은 조직을 빠르게 절개하여 상행 대동맥을 노출시키고 미세 절개 집게와 가위를 사용하여 대동맥 주변 영역의 과도한 조직을 제거합니다. 끝이 가는 집게를 사용하여 청소된 대동맥을 2mm 정도 관류 캐뉼라에 놓고 5-0 실크 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다.

캐뉼레이션된 심장을 심장 관류 배지로 4분 동안 분당 3ml의 유속으로 세척한 후 15-17.5분 동안 소화 버퍼로 전환합니다. 관류의 마지막 몇 분 동안 8ml의 소화 완충액 흐름을 수집하고 캐뉼라에서 심장을 60mm 플라스틱 배양 접시로 옮긴 다음 여분의 조직을 제거하고 심장을 2.5ml의 소화 완충액에 담그십시오. 심방 세포를 분리하기 위해 심방을 심장에서 멀리 해부하고 심방을 750마이크로리터의 소화 완충액이 들어 있는 플라스틱 30mm 배양 접시에 넣습니다.

끝이 가는 수술용 가위를 사용하여 심방을 다지고 괴롭힌 후 근육 섬유를 흔들거나 잡아당기지 않고 미세한 집게로 조직을 더 절개합니다. 멸균 전사 피펫 팁을 사용하여 15분 동안 조직을 부드럽게 혼합하고 분리하십시오. 5분마다 Brightfield microscope의 10X 대물렌즈에서 심방 근세포 해리를 관찰합니다.

조직이 더 소화되면 세포 현탁액을 멸균 2ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기기 전에 공극 크기가 더 작은 멸균 전사 피펫 팁을 사용하여 조직을 부드럽게 혼합 및 해리하는 작업을 계속합니다. 30mm 플레이트를 섭씨 37도의 근세포 정지 버퍼 1 750마이크로리터로 헹구고 버퍼를 세포 현탁액과 결합합니다. 심방 근세포가 실온에서 10분 동안 중력과 부드러운 교반에 의해 침전되도록 합니다.

눈에 보이는 펠릿이 형성되면 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 함유한 비근세포를 심방 근세포 펠릿을 방해하지 않고 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브로 전달합니다. 비근세포 분획을 원심분리하고 10%의 태아 송아지 혈청이 보충된 10ml의 DMEM에 비근세포 펠릿을 재현탁합니다. 계수 후, 비근세포 세포를 다운스트림 분석을 위한 적절한 실험 밀도에 배치한 다음, 분리된 심방 근세포 펠릿을 라미닌 코팅된 배양 플레이트에 파종하기 위한 적절한 실험 농도로 재현탁합니다.

심실 세포 분리를 위해 심방 조직 샘플에 대해 방금 설명한 것처럼 심실 심장 조직을 다지고 생성된 세포 현탁액을 섭씨 37도 근세포 정지 버퍼 1의 2.5ml를 포함하는 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브로 이동합니다. 해부 플레이트를 섭씨 37도 근세포 정지 버퍼 2.5 2.5 ml로 헹구고 세척액을 세포 현탁액과 결합합니다. 멸균 전사 피펫을 사용하여 4분 동안 조직을 부드럽게 혼합하고 해리합니다.

배양이 끝나면 10마이크로리터의 세포 분취액을 사용하여 막대 모양의 근세포의 존재를 확인합니다. 멸균 100마이크로리터 나일론 필터를 통해 세포 현탁액을 50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 통과시키고 이전에 수집된 분해 완충액 2ml를 사용하여 멸균 나일론 필터에 남아 있는 세포를 세척합니다. 심실 근세포가 튜브 바닥에 눈에 보이는 펠릿이 형성될 때까지 부드러운 교반으로 6분 동안 중력에 의해 침전되도록 합니다.

멸균 피펫 팁을 사용하여 상층액을 함유한 비근세포를 심실 근세포 펠릿을 방해하지 않고 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브로 옮기고 비근세포 분획을 원심분리합니다. 계수를 위해 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM 10ml에 비근세포 펠릿을 재현탁하고 다운스트림 분석을 위해 적절한 농도로 세포를 플레이트화한 다음, 계수를 위해 분리된 심실 근세포를 2ml의 근세포 정지 완충액 2에 재현탁합니다. 단계적 패러다임 칼슘 재도입을 설정하려면 50마이크로리터의 10밀리몰 염화칼슘을 심실 근세포 세포 현탁액에 넣고 실온에서 4분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 50마이크로리터의 10밀리몰 염화칼슘을 세포에 추가로 첨가하고 혼합하여 실온에서 4분 동안 다시 배양합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 10밀리몰 염화칼슘으로 4분 배양 1회, 10밀리몰 염화칼슘 80마이크로리터로 4분 배양 1회를 실시합니다. 마지막 배양 후, 칼슘 처리된 심실 근세포를 계획된 다운스트림 분석에 따라 적절한 부피의 심실 근세포 도금 배지에 재현탁시키고 라미닌 코팅된 배양 플레이트에 세포를 시딩합니다.

1시간 후, 상층액을 25마이크로몰 블레비스타틴이 보충된 심실 근세포 유지 배지로 교체합니다. 심장 근육 트로포닌 T는 심장 근세포의 표지자이며 심방 및 심실 심장 근세포 배양 모두에서 강력하게 발현됩니다. 대조적으로, 심방 나트륨 이뇨 펩타이드와 미오신 경쇄 2는 각각 심방 및 심실 심장 근세포 배양에서 강력하고 특이적으로 발현됩니다.

섬유아세포 마커는 심방실과 심실실 모두에서 분리된 비근세포 배양물에서만 독점적으로 발현됩니다. T-세뇨관 마커 디히드로피리딘 및 리아노딘 수용체에 대한 성체 마우스 심실 근세포의 면역 염색은 분리 및 장기 배양 전반에 걸쳐 온전한 T-세뇨관을 보여줍니다. 육종 줄무늬 패턴은 막대 모양의 형태 및 TO-PRO-3를 사용한 핵 염색과 함께 분리된 심장 근세포의 순도 및 생존력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

예상대로 심실 심장 근세포는 크기가 커서 평균 길이가 약 150마이크로미터인 반면 심방 심장 근세포는 평균 약 75마이크로미터입니다. 또한, 면역염색 분석에서 심방 심장 근세포는 소포체 및 분비 과립에 국한된 특징인 염색 패턴에서 심방 나트륨 이뇨 펩타이드의 강력한 발현을 나타냅니다. 심방 근세포는 기저 조건에서 심방 나트륨 이뇨 펩타이드를 분비하는 반면, 분비에 대한 반응으로 분비가 증가합니다.

더욱이, 심방 심장 근세포는 심방 나트륨 이뇨 펩타이드를 분비하고 공동 분비는 전구체 상태에서 제품 펩타이드까지 호르몬의 일부만 처리합니다. 피할 수 있는 가장 흔한 실수는 제물을 바치기 전에 동물을 침착하게 하지 않는 것, 관류 시스템에서 기포를 배출하지 않는 것, 외과 의사 자신이 침착함을 유지하지 않는 것 등입니다. 이 절차 후에는 전기생리학 및 칼슘 처리 매개변수 분석, 면역세포화학, 비대 반응 및 신호 연구, 시뮬레이션된 허혈 재관류 연구를 포함한 모든 일반적인 실험 절차를 수행할 수 있습니다.