Name: C. 예르간에서 큰 Exopher 소포에서 생체 신경 골집 및 세포구 압출에서 득점에 대한 정량적 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 C. elegans를 이용한 신경세포 엑소퍼 생성 메커니즘 및 정량적 평가 방법을 통해 신경퇴행성 질환의 병리 전파 이해와 치료 전략 개발에 기여하는 세포 폐기물 제거 과정을 탐구합니다.

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R01AG047101 및 R37AG56510: 다음과 같은 NIH 보조금을 인정합니다. Driscoll 및 Grant 연구소의 구성원은 엄격한 실험과 강력한 의사 소통을 통해 설명된 프로토콜의 개발 및 미세 조정에 광범위하게 기여했습니다.

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큰 exophers의 형태로 골재 및 세포구 제거의 생체 내 분자 메커니즘의 특성은 초기 단계에 있다. 추방을 위한 화물의 지정, 셀 내의 이 화물의 편광 수집, 외출을 생성하는 결정의 조절, 압출을 중재하는 기계, 그리고 이웃 세포에서 분해 기계와의 외설의 상호 작용에 대한 질문은 모두 해결되어야 합니다. 더욱이 칼슘, 골재 및 미토콘드리아를 포함하는 생물학적 물질을 통과할 수 있는 관 연결의 생체 내 시각화는 흥미롭고 연구되지 않은 생물학입니다. 특정 세포가 다른 세포보다 생산을 추방하는 경향이 있는 이유에 대한 질문은 해결되지 않았지만 이 프로토콜에 설명된 접근법으로 유전적으로 해부되기 시작할 수 있습니다.
이 프로토콜에 자세히 설명된 것은 인근 세포 소마와 외래를 구별하는 데 주의를 기울이고, 엑시셔 생산의 피크를 포착하기 위한 분석 타이밍, 그리고 이포 수준을 조절할 수 있는 의도하지 않은 응력을 제거하기 위한 성장 조건의 엄격한 제어와 함께, exopher 생산의 재현 가능한 점수를 달성하는 접근법입니다. 큰 초기 exopher의 구별, 또는 주변 피더니에 "별이 빛나는 밤'분산은 exopher 생산의 증거로 수량 될 수있다. 즉, 기저 조건 하에서 mCherry를 표현하는 뉴런은 가장 자주 exopher를 생산하는 특정 유형의 뉴런의 5-25 %와 관련이 있습니다. 스트레스 조건의 통제된 소개는 압출을 생성하는 뉴런의 90%만큼 높은 검출에 exopher 생산을 증가시키기 위하여 적용될 수 있었습니다, modifior를 위한 유전 또는 약리학 스크린에 특히 유용.
인간 신경 퇴행성 질환에서, 큰 골재는 병리학 확산을 촉진하기 위하여 이웃 세포로 병들린 뉴런에서 전송할 수 있습니다. exopher 메커니즘은 필라 를 통해 집계 압출에 사용되는 보존 된 메커니즘을 통해 침투 할 수 있습니다. 이 과정의 효율성을 향상시키는 생체 내 분자를 정의 (더 효과적인 proteostasis 제어로 간주) 또는 여러 신경 퇴행성 질환을 퇴치하기위한 새로운 전략의 디자인에 영향을 미칠 수 있습니다 차단. 이와 같이, 여기에서 기술된 프로토콜은 고전적인 유전 돌연변이 스크린, 강화제 및 억제제를 확인하기 위하여 유전자를 체계적으로 노크하는 게놈 넓은 RNAi 스크린, 또는 이 과정의 후보 약리학 수정자를 확인하는 약 내정간섭 연구 결과를 위해 이용될 수 있었습니다. 접근 방식은 간단하지만 다소 힘들다. Exophers는 너무 커서 고배율 해부 현미경으로 볼 수 있습니다. 여전히, C. elegans 뉴런은 상대적으로 작고 그들의 세포기관 또는 그들의 막을 보고 더 높은 힘 공초점 심상을 필요로 하고 느린 프로세스입니다. 더 높은 처리량을 위한 선택권은 다중 잘 플레이트 형식으로 높은 콘텐츠 화상 진찰 접근을 관련시킬 수 있었습니다.
퇴출 점수에 표준화 된 접근 방식의 응용 프로그램은 뉴런이 구성하고 세포 이물질을 제거 할 수있는 과정의 공동 유전 해부를 기초해야한다.

골재 및 기능 장애 미토콘드리아의 신경독성 문제는 오랫동안 세포 내재된 것으로 간주되어 왔지만, 최근에는 한 뉴런에서 발생하는 잘못된 인간 질환 단백질이 이웃 세포로 확산되어 병리학1을촉진할 수 있다는 것이 분명해졌습니다. 마찬가지로, 포유류 미토콘드리아는 세포간 분해2 또는 도전된 이웃 세포3에서미토콘드리아 집단의 구출을 위해 원래 생산의 세포에서 보내질 수 있다. 다양한 크기의 소포는 일반적으로 이웃 세포 또는 유체 주변4로 세포 물질을4전송하는 것으로 관찰되었다. 일부 압출 소포는 평균 신경 소마 (평균 터치 뉴런 소마 ~ 6 μm)의 크기에 접근하고 큰 골재 및 세포기관을 수용 할 수 있습니다.
단백질 응집체및 세포기관을 운반할 수 있는 큰 소포 압출의 눈에 띄는 예는 C. elegans 터치 수용체 뉴런에서 발생하며, 이는 유해 응집경향이 있는, 분해 저항성 mCherry5를인코딩하는 높은 카피 번호 기자 구성을 시현하는 수용체 뉴런을 터치한다. exophers에게 불린 터치 뉴런에서 압출은 , ~4 μm 평균 직경, 선택적으로 mCherry 또는 그밖 응재를 포함하고, 일반적으로 접촉 수용체 뉴런을 포위하는 이웃 피질로 직접 전달됩니다. 피질계는 리소좀 기반 의 분해를 시도하지만, mCherry 골재와 같은 일부 비소화성 내용들은 피하구체에 의해 동물의 유체 채워진 의사콜롬으로 재압될 수 있으며, 이 과정에서 mCherry는 장기간 저장을 위해 coelomocytes라고 불리는5원격 청소세포에 의해 채택될 수 있다(그림1, 그림 2)
큰 압출 제거 소포는 터치 수용체 혈장 막에 둘러싸여 세포를 떠나 고집계 된 인간 질환 단백질을 포함 할 수 있습니다, 미토콘드리아, 및 리소좀. exopher 생산의 과정은 잠재적으로 독성 종의 정렬을 포함 하는 것으로 보인다 (예를 들어 집계 하기 쉬운 표현 mCherry는 수용성에서 분리, 신경 소마에 주로 남아 GFP 같은 불쾌 한 단백질). 이러한 방식으로, 위협적 개체의 지시추방은 뉴런5에의해 수행된다. 발성기 대책은 자가식 녹다운, MG132 매개 프로테아솜 억제, 또는 헌팅턴병 관련 확장 폴리글루타민 Q128 또는 알츠하이머병-병-성 단편 Aβ1-42와같은 인간 질환 단백질의 형질 발현에 의해 유도된 스트레스와 같은,5-42,엑스포퍼를 생성하는 뉴런의 수를 증가시킬 수 있다.
엑소퍼는 최근에 문서화되었기 때문에 생물학 장점 설명으로 알려져 있습니다. Exophers에서 발견 되었다, 그리고 가장 잘 공부, C. elegans 터치 수용 체 뉴런. 6개의 C. elegans 메카노감각 터치 뉴런이 있는데, 세포 체가 몸 주위에 분포되어있으며(그림 3A)라고불리며, 그들의 초구조가 독특한 15 개의 프로토필라멘트 마이크로투블러를 특징으로하기 때문에 마이크로 튜블러 세포라고 합니다. 터치 수용체 뉴런은 전방 AVM (전방 복부 마이크로 투툴 뉴런), ALMR 및 ALML (전방 측면 마이크로 투덜뉴런 오른쪽과 왼쪽), 더 중앙 PVM (후방 복부 마이크로 투덜뉴런), 후방 PLMR 및 PLML (후방 측면 미세 투불 뉴런 및 오른쪽 왼쪽)입니다. 흥미롭게도, 6개의 터치 수용체 뉴런은 동일한 공격적인 트랜스진(도3C)을표현했음에도 불구하고 다른 속도로 엑소퍼를 생성한다. 6개의 메카노감각 터치 수용체 뉴런의, ALMR 뉴런은 그밖 터치 뉴런 보다는 더 자주 exophergenesis를 겪습니다. 따라서 터치 뉴런에서 엑소퍼 번호의 양은 일반적으로 ALMR에 초점을 맞추어 확립된다.
엑소페네시스는 전형적으로 뉴런 세포질의 부종으로 시작되는 동적 과정이다(도1A-B). 세포 내용, 세포기관 또는 단백질 응집체는 뉴런 소마의 한쪽으로 수집되며, 가장 일반적으로 ALMR 뉴런의 후방 끝(투영 중성염에서 멀리 떨어져), 사전 외향 도메인(PED)을 형성한다(도1B). PED가 바깥쪽으로 투영되기 시작하면 초기 돌출이 관찰되어 인식 가능한 돌출된 싹을 형성합니다. 후기 싹은 전구 도메인의 가장 넓은 직경이 소마 엑소퍼넥(도 1C)의수축직경보다 약 1/3 더 큰 경우 정의된다. Exophers는 소마에서 거의 모든 방향으로 배출 될 수 있지만 대부분의 exophers는 세포 체에서 후방으로 빠져 기원하는 소마와 거의 동일한 초점 평면에 남아 있습니다.
싹의 목이 얇은 필라멘트로 좁아지면서 엑소퍼는 원래의 소마에서 멀리 이동할 수 있습니다. 이 필라멘트(도1D, 화살표)를통해 소마에 부착된 상태로 유지될 수 있으며 나중에 분리될 수 있다. 칼슘, 골재 및 미토콘드리아와 같은 세포 내용물을 부착된 exopher5로이 필라멘트를 통해 전송할 수 있지만, 압출된 물질의 대부분은 대규모 신진 이벤트에 의해 이출 구획에 투입된다. 엑소퍼는 눈에 보이는 연결 튜브 또는 얇은 필라멘트가 없고 엑소퍼가 송신 소마(도1E)로부터완전히 분리될 때 성숙한 것으로 간주됩니다.
C. elegans에 의해 생성된 Exophers는 신경세포를 터치하는 즉시 터치 뉴런을 둘러싸고 있는 조직인 피하와 마주치게 됩니다. 가장 일반적으로, exopher 소포는 꼬리를 향해 후면피 내에서 이동하는 것처럼 보이며, exopher 내용이 저하를 대상으로 나타나기 전에 소마에서 상당히 먼 것일 수 있습니다 (예를 들어, 거리는 소마(도 1F)에서100 μm 떨어져 있을 수 있습니다). 형광 발산 소포는 "별이 빛나는 밤"(도1G 및 도 2)이라고불리는 외관을 복용하여 피더피 내의 많은 작은 소포로 분해됩니다. "별이 빛나는 밤" 단계에서, 천시테이트 형광 물질은 원래 독방 exopher에 비해 형광의 많은 작은 지점으로 피하 싱크티움을 가로 질러 흩어져 관찰 될 수있다. 별이 빛나는 밤은 낮은 배율에서 천점을 볼 수 있으며 배율이 높을수록 피시테이트 및/또는 피서피 내에서 네트워크를 형성할 수 있습니다. 별이 빛나는 밤의 형광 신호는 전형적으로 엑소퍼및 뉴런 발현 형광(도2B-C)보다희미하다. 많은 천막 소포로 mCherry의 분산은 피하 세포의 내피 / 리소솜 네트워크와 phagosome 성숙 및 융합을 수반하는 것으로 생각된다. 일부 외신 물질은 피하 리소솜 네트워크에서 저하될 가능성이 있지만, 분해에 강한 잔류 종(예: mCherry 골집)은 피질에서 세포 이물질을 함유할 수 있는 유체 구획인 슈도콜롬으로 버려집니다. 형광 물질은 나중에 coelomocytes(도 2C)에게불린 원격 청소구 세포에 의해 취취해지며, 이는 mCherry의 농축, 저장 및 다시 저하를 시도할 수 있습니다.
,골재 압출 및 전달 현상은 C. elegans5,6,67 및 D. melanogaster8,,9와 같은 유전 모델뿐만 아니라 다중 포유류 모델에서 보고된 필라를 통해 보존된 것으로 나타난다. 엑소퍼와 같은 압출은 포유류 세포10에대해 보고되었으며, 보존된 메커니즘이 골재 및 세포세포 추방의 근간이 될 수 있음을 시사하는 관측이다. 이와 같이 Exopher 생산은 근본적이지만 이전에는 인식할 수 없는 세포 이물질 관리의 보존된 메커니즘일 수 있으며, 이는 불균형이 발생할 때 신경 퇴행성 질환에 적극적으로 기여할 수 있는 신경 프로테오스타증 및 미토콘드리아 품질 관리의 분기입니다. 파편 차별 및 분류에 관여하는 분자의 식별, 뚜렷한 아세포 로케일로의 수송, 압출, 소마와 늦은 추방을 연결하는 관 연결의 형성/가위, 그리고 이웃 세포에 의한 원격 분해를 위한 대형 압출 소포의 인식은 미래의 작업을 위해 남아 있다. 선충 및 비행 모델에 있는 연구 결과는 생리적인 맥락에서 참여 분자를 확인하기 위하여 이 모형에 의해 제안된 편견유전 접근 및 강력한 세포 생물학 공구를 사용하여, 집계 및 세포기관 수집 및 전송의 기계장치를 정의하는 데 매우 중요합니다.
exopher 생물학에서 작동 하는 메커니즘을 해독에 중요 한 첫 번째 단계 생체 내에서 재현 에 대 한 프로토콜을 정의 포함. C. elegans 모델은 신체가 투명하고 형광태그 단백질 이나 세포기관을 포함 할 때 쉽게 관찰 할 수 있기 때문에 이러한 노력에 대한 특별한 이점을 제공합니다. Exophers는 C. elegans 도파민성 뉴런 PDE 및 CEP, ASE 및 ASER 감각 뉴런, 염료 충진 증폭 뉴런5에의해 생성되는 것으로 보고되었다. 터치 수용체 뉴런에 의해 생성 된 exophers가 가장 잘 특성화되기 때문에, 여기에 초점은 exopher 분석을위한 터치 뉴런의 사용에 있습니다. 그러나 기본적인 접근 법은 모든 셀에서 exopher 생산을 측정하기 위하여 적용될 수 있습니다. C. elegans에 의해 생성 된 exophers를 감지 하고 양을 검출 하는 프로토콜 은 mCherry 단백질을 형질적으로 표현하는 수용체 뉴런을 터치, 모니터링 할 수있는 화물에 중점을 두고 점수에 시간적 제약. 이 문서는 생체 내 외신 식별, 그리고 이포 생산을 조절하는 환경 및 유전 적 조건의 양을 향한 접근 방식을 정의합니다. 프로토콜은 기준선 외향성 생산의 측정및 유전자형 에 걸친 비교를 위한 일정한 비응력 조건에 중요한 주의를 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>95B 과학용 CMOS 카메라</td><td>Photometrics Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; L 저 보유 팁</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청 피펫</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L 낮은 보유 팁</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>13% 차아염소산나트륨</td><td>Acros 유기물</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>2L 삼각 플라스크</td><td>과학 실험실 용품</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>25mL 혈청학 피펫</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 &뮤; L low retention tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 혈청학 피펫</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 cm 멸균 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>absolute ethanol</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain wild type</td><td>CGC</td><td>N2</td><td>C. elegans strain</td></tr><tr><td>calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>dibasic sodium phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli strain OP50</td><td>CGC</td><td>Op50</td><td>E coli strain</td></tr><tr><td>FBS10 표준 현미경</td><td>Meyer Instruments</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 표준 플레이트베이스, 100/100 삼안 헤드 및 플립 줌</td></tr><tr><td>유리 피펫 270mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher scientific</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>접종 스프레더</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB 배지 캡슐</td><td>MP biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI &ndash; 레이저 다이오드 조명기</td><td>89 노스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레바미솔</td><td>시그마 알드리치</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 멀티펫</td><td>에펜도르프</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>일염기성 인산칼륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>멀티트론 표준 진탕 인큐베이터</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>INFO28573 Nalgene 1 L 원심분리기 냄비</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>P10 피펫</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 피펫</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>피펫보이 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 마이크로비즈</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td><td>Sorvall 9900884</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reusable ringed cytology slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>GFP expressed in touch neurons</td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>피셔 화학 S</td><td>/ 4880 / 53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 오토 클레이브</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermofisher 과학</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마 Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 스피닝 디스크 컨 포칼 유닛</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166 [Pmec-4mCherry]</td><td>계약 Driscoll lab</td><td></td><td>mCherry는 터치 뉴런에서 발현</td></tr>됨 <tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>계약 Driscoll lab</td><td></td><td>Q128은 터치 뉴런에서 발현</td></tr>됨 <tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>계약 Driscoll lab</td><td></td><td>mitoROGFP 터치 뉴런</td></tr><tr><td>에서 발현ZB4528 bzIs166 [Pmec-4m체리]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td><td>접촉 뉴런에서 발현</td>되는 <td>드리스콜 연구소</td><td></td> 자가포식 마커</tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c. 예르간에서 큰 exopher 소포에서 생체 신경 골집 및 세포구 압출에서 득점에 대한 정량적 접근

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

잘못 접힌 단백질과 미토콘드리아 기능 장애의 독성은 종에 걸쳐 노화와 관련된 기능성 신경 감소 및 신경 퇴행성 질환을 촉진하는 중추적 인 요인입니다. 이러한 신경 독성 문제는 오랫동안 세포 내재로 간주되었지만, 상당한 증거는 이제 한 신경에서 유래된 잘못된 인간 질병 단백질이 이웃 세포에 나타날 수 있음을 뒷받침하며, 이는 인간의 신경 퇴행성 질환에 대한 병리학 확산을 촉진하기 위해 제안된 현상입니다.
C. 집계 단백질을 표현하는 성인 뉴런은 골거된 단백질, 미토콘드리아 및 리소좀을 포함할 수 있는 대형(~4 μm) 막으로 둘러싸인 소포를 돌출할 수 있습니다. 이 큰 소포는 "exophers"에게 불리고 엑소좀 (약 100 배 더 작고 다른 생물 발생이 있는)와 구별됩니다. exophers에 세포 파편을 던지는 것은 근본적이지만 이전에는 인식할 수 없는 신경 프로테오스타증 및 미토콘드리아 품질 관리의 분지인 보존된 메커니즘에 의해 발생할 수 있으며, 이는 골재가 인간 신경 퇴행성 질환에 퍼지는 과정과 관련이 있습니다.
exophers터치 뉴런 내에서 높은 복사 형질형 mCherry를 표현하는 동물에서 주로 연구되었지만, 이러한 프로토콜은 형광 태그 된 세포기관 또는 뉴런의 다양한 클래스에 관심있는 다른 단백질을 사용하여 exophergenis의 연구에서 동등하게 유용합니다.
여기에 설명된 C. elegans exophers의 물리적 특징, 탐지 전략, 식별 기준, 수량에 대한 최적의 타이밍 및 exopher 생산 수준을 조절할 수 있는 스트레스를 제어하는 동물 성장 프로토콜이 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜의 세부 사항은 실험실 전체의 퇴출물의 정량적 분석을 위한 표준을 수립하는 역할을 해야 합니다. 이 문서는 exophers가 생성되고 이웃과 먼 세포에 의해 반응되는 분자 메커니즘을 정교하게 하고자하는 실험실의 자원역할을하고자합니다.

이 프로토콜은 막 에바인딩 exophers의 형태로 C. elegans 세포에 의해 생성된 큰 골체 및/또는 세포기관 압출(~4 μm)의 검출 및 수량에 대한 접근 법을 설명합니다. 우리는 이 파편 추방 기계장치의 해부를 용이하게 하는 데 필요한 긴장, 성장 조건, 채점 기준, 타이밍 및 현미경 고려 사항을 설명합니다.

C. 예르간에서 큰 Exopher 소포에서 생체 신경 골집 및 세포구 압출에서 득점에 대한 정량적 접근

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

우리는 퇴행성 질환 병리학 확산과 관련이 있는 퇴행성 생물학이라는 과정을 통해 뉴런으로부터의 골재 및 세포간 압출의 생체 내 메커니즘을 특성화합니다. 이러한 접근은 압출 된 신경 exophers의 재현 가능한 점수를 달성하기 위해 필요하고 이웃 세포로의 신경 전달을 통해 세포 쓰레기 제거의 기계성 해부를위한 플랫폼을 보여줍니다. 뉴런이 골재를 배출하는 방법의 생체 내 메커니즘을 정의하는 것은 실제로 인간의 신경 퇴행성 조건의 치료에 도움이 새로운 전략의 디자인에 영향을 미칠 수 있습니다.기저 조건의 경우, 같은 생물학적 나이의 C.Elegans가 섭씨 20도의 일정한 온도에서 보관됩니다. 세포 내 역학및 엑소페네시스의 특성에 대한 실시간 이미징을 위해 최대 20마리의 동물을 유리 현미경 슬라이드에 아가로스 패드에 놓고 동물을 고정시하십시오. 마비된 벌레 위에 덮개 미끄러짐을 조심스럽게 놓고 슬라이드를 공초점 형광 현미경의 단계에 놓습니다.10~40배의 목표를 사용하여 브라이트필드에서 원하는 Z 평면을 식별하여 웜의 위치, 머리 꼬리 방향 및 외음부 위치를 기록하며, 이는 나중에 뉴런 및 엑시퍼 식별을 위한 랜드마크입니다. 동일한 Z 평면에 머무르고, 선택한 사이토솔릭 리포터의 경우 10~40배의 광야 형광으로 전환하고, Z축 내를 스크롤하여 동물의 깊이와 초점 평면에서형광발현을 관찰한다. 머리는 형광 신경 고리를 가질 것이고, 더 뾰족한 꼬리에는 1~ 2개의 눈에 보이는 후방 측면 터치 뉴런 소마가 포함됩니다.63x 렌즈를 사용하여 더 높은 배율은 신경 반지, 신경 과정 및 소마 바디를 확인하는 것을 도울 수 있습니다. 그것은 먼저 동물 과 측면 신경 과정의 머리에 있는 신경 반지를 식별 하는 데 도움이. 이렇게하려면 웜의 머리에서 시작하여 천천히 Z 축을 스크롤하여 신경 과정이 부착된 신경 고리의 평면을 식별합니다.신경 고리가 확인되면, 형광 보기에서 소마가 명백할 외음부를 향한 후부 방향으로 측면으로 부착 된 뉴런 과정을 따릅니다. 둥근 소마 몸 또는 신체가 집중되면 근처의 모든 뉴런을 식별하는 것이 중요합니다. 터치 뉴런 식별을 위해, 먼저 ALML, ALMR 및 AVM 소마를 찾아, 이는 가장 밝은 신호와 과정의 끝에 둥근 세포 체체에 의해 표시되어야한다.초점 중가장 신경 세포 소종이 발견되면, AVM 세포를 사용, 복부 세포, 방향을 할당하는 데 도움이. AVM 뉴런이 ALM과 동일한 평면에 있는 경우, 동물은 측면에 휴식 하 고 측면 뉴런은 ALMR. AVM 뉴런이 문제의 ALM과 동일한 평면에 있지 않으면 초점 평면에 가장 가까운 터치 뉴런은 ALML 뉴런입니다.또한 도움이 PVM 뉴런을 식별하는 것입니다, 이는 꼬리 근처에위치한 복부 터치 뉴런입니다. PVM의 초점 평면은 전방 터치 뉴런이 ALML 또는 ALMR인지 여부를 나타냅니다. 문제의 ALM이 PVM과 동일한 평면에 있는 경우 관찰된 터치 뉴런은 ALML 뉴런입니다.가장 초점 ALM이 확인되고 할당 된 후, 관심 영역 근처와 Z 비행기의 모든 에서 다른 soma 신체의 위치를 결정하는 것이 중요합니다, exophers에 대한 그들을 착각하지 않기로. 관심의 터치 뉴런이 발견되면, ALMR 또는 ALML, 큰 돌출 외출 도메인에 대한 뉴런을 검사, 싹 exopher로 간주 될 정도로 큰, 이는 적어도 1 5 분의 1 의 크기는 유래 소마의 크기. 싹이나 외향적 도메인이 관찰되지 않으면, 세포 소마를 추가로 검사하여 소마 체에서 방출되는 부착된 얇은 필라멘트를 검사합니다.부착된 exophers는 유래 소마와 유사한 Z 평면에 더 가깝게 위치하는 경향이 있습니다. 부착되지 않은 외향성 제거를 식별하려면 소마보다 종종 밝은 농축 된 추방 형광 단백질을 찾습니다. 여기에 묘사되었지만, 하나의 큰 exopher가있다.단일 소마에서 유래하는 형광 엔티티가 하나 이상 있을 수 있다. 다른 초점 비행기와 기원소마가 발견 된 먼 측면 지역에서 부착되지 않은 exophers을 찾습니다. 엑소퍼는 전형적으로 신경 과정에서 후방 방향으로 소마에서 멀리 돌출.뉴런 소마로 위치및 식별되지 않은 큰 구형 물체를 확인합니다. 엑소퍼는 일반적으로 비원 구조이지만 시간이 지남에 따라 저하되어 더 불규칙한 모양을 획득할 수 있습니다. 별이 빛나는 야간 이벤트의 존재와 여러 exopher 이벤트의 인스턴스를 검색합니다.엑소퍼에 대한 오해와 비행기 외 소마를 피하기 위해, 관찰의 시작 부분에 모든 근처의 소마, 심지어 초점이 없는 소마를 식별하는 것이 중요합니다. 연장 또는 뾰족한 소마를 관찰할 수 있지만 명확한 수축 부위가 없는 확장은 exopher로 점수를 매겨서는 안됩니다. exopher 이벤트 정량화에서 소마의 5 분의 1 크기를 달성하지 않는 작은 해결 된 싹을 거부합니다.성숙한 neurites나이가 들면서 극적으로 확장될 수 있고 형광 단백질은 그러한 구조의 단부 끝으로 이동할 수 있지만, 신경질적인 성장을 exophers로 계산하지 마십시오. 엑소셔가 아닌 형광실을 식별하려면 광야 형광 하에서 별이 빛나는 야간 성전사 로 오인 될 수있는 자동 형광을 배제하십시오. 배아 형광 신호를 제외하려면 형광과 밝은 필드 조명 사이를 전환하고 자궁 내의 계란과 신호의 연관성을 확인하십시오.이 표는 엑소셔 생산을 모니터링하는 데 사용 된 다른 터치 뉴런 표현 형광 기자의 요약을 제공합니다. 외향적으로 압출된 것으로 알려진 화물에는 Q128, 인간 헌팅턴 확장 폴리글루타민 반복의 융합, 리소좀 GFP가 리소말 관련 멤브레인 단백질로 태그된 리소좀 GFP, 매트릭스-현지화된 GFP로 태그된 미토콘드리아 등의 골재가 포함된다. 세포질 GFP는 강하게 추방되지 않으며, GFP가 약하게 exophers를 시각화하는 데 사용할 수 있지만, 소마에 우선적으로 유지됩니다.일반적으로, 기초 조건하에서 ALMR 뉴런 표현 mCherry에 의한 exopher 생산은 성인의 첫날에 시작되고 성인 의 주요 exopher 생산 기간 내에서 검사된 AlM의 약 5~25%에 구역수색됩니다. 특정 스트레스와 유전 적 혼란은 ALMR 뉴런 내에서 exopher 생산을 크게 증가시킬 수 있습니다. 관심의 뉴런과 주변 지역을 발굴하기 전에 근처의 모든 뉴런을 찾는 것이 중요합니다.exophers를 수동으로 식별하는 데 익숙해지면 고함량 이미징을 사용하여 대규모 스크리닝을 위한 향상된 처리량 방법을 사용하여 전체 게놈 분석 및 기계성 외발성 해부를 사용할 수 있습니다.

quantitative-approaches-for-scoring-vivo-neuronal-aggregate-organelle

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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반복-관련 비-ATG 의존적 번역 제품은 여러 반복 확장 기반 질병의 새로운 병원성 특징이다. 기재된 프로토콜의 목적은 모델 시스템 C. elegans에서행동 및 세포 분석술을 사용하여 이들 펩티드에 의한 독성을 평가하는 것이다.

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Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

학습하세요 C. elegans를 이용한 신경세포 엑소퍼 생성 메커니즘 및 정량적 평가 방법을 통해 신경퇴행성 질환의 병리 전파 이해와 치료 전략 개발에 기여하는 세포 폐기물 제거 과정을 탐구합니다.

C. 예르간에서 큰 Exopher 소포에서 생체 신경 골집 및 세포구 압출에서 득점에 대한 정량적 접근

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