Name: 마우스로부터 단리되고 배양된 성숙한 골격근에서의 인슐린- 및 수축-자극된 글루코스 흡수의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 학습하세요 마우스 골격근에서 인슐린 및 수축 자극에 의한 포도당 흡수 측정 방법을. 이 기술은 생리학적 개입이 포도당 대사에 미치는 영향을 정확히 평가하여 근육 생리학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 덴마크 독립 연구 협의회 (FSS8020-00288B)와 노보 노디스크 재단 (NNF160C0023046)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 또한 덴마크 당뇨병 아카데미의 Rasmus Kjøbsted에 대한 연구 보조금에 의해 지원되었으며, Novo Nordisk Foundation, 보조금 번호 NNF17SA0031406이 자금을 지원합니다. 저자는 Karina Olsen, Betina Bolmgren, Irene Bech Nielsen (영양학과, 운동 및 스포츠학과, 과학 학부, 코펜하겐 대학)에게 숙련 된 기술 지원에 감사드립니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

골격근에서 포도당 흡수의 온전한 조절은 전반적인 건강을 보존하는 데 중요합니다1. 따라서 근육 포도당 섭취에 대한 조사는 종종 다양한 건강 변화 개입을 평가할 때 일차 판독 수단으로 작용합니다. 여기에서는 인슐린 및 전기적으로 유도된 수축에 반응하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육에서의 글루코스 흡수를 측정하기 위한 생체외 방법을 기술한다. 이 방법은 빠르고 신뢰할 수 있으며 혈액에서 발견 할 수있는 호르몬 및 기질의 잠재적으로 혼란스러운 영향으로부터 분리 된 근육 포도당 흡수율의 정확한 조사를 허용하는 인큐베이션 된 근육의 주변 환경을 정확하게 제어 할 수 있습니다. 이 방법은 많은 연구에서 수년 동안 사용되어 왔으며 근육 연구 공동체에서 널리 채택되었습니다.
생체외 인큐베이션 모델은 일반적으로 골격근에서의 글루코스 흡수보다는 글루코스 수송 능력을 평가하는 방법이 고려되었다. 인큐베이션된 근육에서의 글루코스 수송 능력...

골격근은 인슐린과 운동에 반응하여 세포 외 공간에서 다량의 포도당을 추출 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이것은 전신 포도당 항상성을 유지하는 데 도움이되며 높은 에너지 수요의시기에 포도당 공급을 확보합니다. 골격근 글루코스 흡수의 온전한 조절이 전반적인 건강 및 신체 성능(1,2)에 중요한 것으로 밝혀졌기 때문에, 다양한 조건 동안 근육 글루코스 흡수의 측정은 많은 주목을 받고 있다. 인간 및 동물에서, 고인슐린성-유혈당 클램프는 생체내 인슐린 민감성을 평가하기 위한 황금 표준 기술로서 3,4 이용되어 왔다. 경구 포도당 내성 검사에서 얻은 결과와는 달리, 고인슐린성 유글리세믹 클램프 기술은 췌장으로부터의 온전한 위장 기능 또는 인슐린 분비를 요구하지 않으며, 따라서 인슐린 반응이 위장 장 및/또는 췌장 기능의 변화를 나타내는 피험자들 사이에서 비교될 수 있게 한다. 인간의 운동 중 생체 내 근육 포도당 흡수의 측정은 1960 년대5 이후 자주 수행되었습니다. 먼저 동맥 균형 기술(6)의 사용에 의해 그리고 나중에 양전자 방출 단층촬영(PET) 이미징을 사용하여 양전자 방출 글루코스 유사체 예컨대 18F-플루오로데옥시글루코스7을 방출한다. 설치류에서, 생체 내에서 운동-자극된 근육 글루코스 흡수는 전형적으로 방사성 또는 안정한 동위원소-표지된 글루코스 유사체 8,9,10의 사용에 의해 수행된다.
생체 내에서 근육 글루코스 흡수를 측정하기 위한 상보적인 방법은 설치류로부터 작은 근육을 분리 및 배양하고, 이어서 방사성 또는 안정한 동위원소 표지된 글루코스 유사체11,12,13을 사용하여 글루코스 흡수를 측정하는 것이다. 이 방법은 성숙한 골격근에서 포도당 흡수율의 정확하고 신뢰할 수있는 정량화를 허용하며 다양한 인슐린 농도의 존재 및 전기 자극에 의해 유발 된 수축 중에 수행 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 격리되고 배양된 골격근에서의 글루코스 흡수의 측정은 다양한 개입(예를 들어, 영양, 신체 활동, 감염, 치료제)을 겪은 마우스의 근육 대사 표현형을 조사할 때 관련성이 있다. 분리된 골격근 모델은 또한 글루코스 흡수에 영향을 미치거나 인슐린 감수성(12,14)을 변형시킬 수 있는 약리학적 화합물 검사에 적합한 도구이다. 이러한 방식으로, 근육 글루코스 대사를 조절하도록 설계된 화합물의 효능은 전임상 동물 모델에서 후속 생체내 시험 전에 고도로 조절된 환경에서 시험되고 평가될 수 있다.
일부 조건하에서, 대사 생존력은 단리되고 인큐베이션된 골격근 모델 시스템에서 도전을 제기할 수 있다. 실제로, 인큐베이션 된 근육에서 순환계의 부족은 기질 (예 : 산소 및 영양소)의 전달이 근육 섬유와 주변 환경 사이의 단순한 확산에 완전히 의존한다는 것을 수반합니다. 이와 관련하여, 인큐베이션된 근육이 작고 얇고, 따라서, 인큐베이션(15) 동안 산소 확산에 대한 장벽을 덜 나타내는 것이 중요하다. 특히 몇 시간 동안 장기간 배양하는 동안, 저산소 상태는 불충분 한 산소 공급으로 인해 근육 에너지 고갈을 초래할 수 있습니다(15). 인큐베이션된 래트 근육에서의 대사 생존력의 다양한 마커가 래트 근육 생존력을 유지하는 데 도움이 되는 중요한 변수의 확인과 함께 이전에 보고되었지만(15), 작은 인큐베이션된 마우스 근육에서의 대사 생존력에 대한 포괄적인 평가는 여전히 보증된다. 따라서, 현재, 글리코겐 함량은 주로 배양된 마우스 골격근16,17에서 대사 생존력의 마커로서 사용되어 왔다.
여기서 우리는 방사성표지된 [3H]2-데옥시-D-글루코스 및 [14C]만니톨을 세포외 마커로서 사용하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육에서 기저, 인슐린- 및 수축-자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위한 상세한 프로토콜을 기술한다. 본 연구에서, 글루코스 흡수는 10분 기간 동안 측정되었고, 이 방법은 단일 수축 프로토콜뿐만 아니라 서브 최대화 및 최대 효과적인 인슐린 농도의 사용과 함께 제시된다. 그러나, 본원에 기재된 프로토콜은 인큐베이션 시간, 인슐린-투여량, 및 전기 자극 프로토콜과 관련하여 용이하게 변형될 수 있다. 또한, 우리는 인큐베이션된 발바닥 및 EDL 마우스 근육에서 대사 생존력의 다양한 마커의 철저한 특성화를 제공한다. 결과는 인큐베이션 버퍼에 글루코스 보충이 1시간 동안 인큐베이션된 근육의 대사 생존력을 보존하는데 필수적이라는 것을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>[14C]D-만니톨</td><td>미국 방사성 표지 화학 물질, Inc.</td><td>ARC 0127</td><td></td></tr><tr><td>[3H]2-데옥시-D-글루코스&nbsp;</td><td>미국 방사선 표지 화학 물질, Inc.</td><td>ART 0103A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma</td><td>D8375</td><td></td></tr><tr><td>4-0 USP 비멸균 수술용 나일론 봉합</td>사 <td>Harvard Apparatus</td><td>51-7698</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td><td>DAKO</td><td>P0397</td> ACC 단백질 Akt2 항체 Cell Signaling 3063 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMPK&alpha를 검출하는 데 사용됩니다. 2 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19131</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>benzamidine</td><td>Sigma</td><td>B6505</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1020831000</td><td></td></tr><tr><td>Calibration kit (force)</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>300041</td><td></td></tr><tr><td>화학발광</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merck</td><td>1084180100</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 프로그램</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 소프트웨어 버전 7.1</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜브</td><td>Visking</td><td>DTV.12000.09 크기 No.9</td><td></td></tr><tr><td>디지털 이미징 시스템</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 EDS</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>전기 펄스 자극기</td><td>Digitimer</td><td>D330 MultiStim 시스템</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H7637</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Novo Nordisk</td><td>Actrapid, 100 IE/mL</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873025</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1058860500</td><td></td></tr><tr><td>근육 스트립 근그래프 시스템</td><td>덴마크어 Myo Technology A/S</td><td>모델 820MS</td><td></td></tr><tr><td>Na-오르토바나데이트</td><td>시그마</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Na-피로인산</td>염 <td>시그마</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Na-피루브산</td><td>시그마</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>머크</td><td>106041000</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>시그마</td><td>S1504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>27778260</td><td></td></tr><tr><td>pACC Ser212 항체</td><td>세포 신호</td><td>3661</td><td></td></tr><tr><td>pAkt Thr308 항체</td><td>세포 신호</td><td>9275</td><td></td></tr><tr><td>pAMPK Thr172 항체</td><td>세포 신호</td><td>2531</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐플루오라이드</td><td>시그마</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>백금 전극</td><td>덴마크어 Myo 기술 A/S</td><td>300145</td><td></td></tr><tr><td>pTBC1D4 Ser588 항체</td><td>세포 신호</td><td>8730</td><td></td></tr><tr><td>신틸레이션 카운터</td><td>Perkin Elmer</td><td>Tri-Carb-2910TR</td><td></td></tr><tr><td>신틸레이션 플루이드&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>통계 분석 소프트웨어</td><td>Systat</td><td>SigmaPlot 버전 14</td><td></td></tr><tr><td>TBC1D4 항체</td><td>Abcam</td><td>ab189890</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Reference A+ System</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스로부터 단리되고 배양된 성숙한 골격근에서의 인슐린- 및 수축-자극된 글루코스 흡수의 측정

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

골격근은 인슐린 반응 조직이며 일반적으로 식사 후 혈액으로 들어가는 포도당의 대부분을 차지합니다. 또한, 골격근은 휴식 조건에 비해 운동 중에 혈액에서 포도당의 추출을 최대 50 배까지 증가시킬 수 있다고보고되었습니다. 운동 및 인슐린 자극 동안 근육 포도당 흡수의 증가는 글루코스 수송체 4 (GLUT4)의 세포 내 구획에서 근육 세포 표면 막으로의 전좌뿐만 아니라 헥소키나제 II에 의한 글루코스-6-포스페이트로의 글루코스의 인산화에 의존한다. m. soleus 및 m . extensor digitorum longus (EDL)와 같은 마우스 근육의 분리 및 인큐베이션은 성숙한 골격근의 포도당 흡수에 대한 인슐린 및 전기적으로 유도 된 수축 (운동을위한 모델)의 효과를 연구하기에 적절한 생체 외 모델입니다. 따라서, 생체외 모델은 근육 인슐린 감수성의 평가를 허용하고, 수축 동안 근육력 생산을 일치시켜 근육 글루코스 흡수의 측정 동안 근섬유의 균일한 모집을 보장하는 것을 가능하게 한다. 더욱이, 기술된 모델은 근육 인슐린 감수성에 영향을 미칠 수 있거나 골격근 글루코스 흡수의 조절 복잡성을 묘사하려고 할 때 도움이 될 수 있는 약리학적 화합물 시험에 적합하다.
여기서 우리는 방사성표지된 [3H]2-데옥시-D-글루코오스 및 [14C]만니톨을 세포외 마커로서 사용하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육 제제에서 인슐린 및 수축-자극된 글루코스 흡수를 측정하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 설명하고 제공한다. 이것은 온전한 동물 모델에서 방해 할 수있는 혼란스러운 요인이없는 성숙한 골격근에서의 포도당 흡수의 정확한 평가를 가능하게합니다. 또한, 우리는 인큐베이션 마우스 골격근의 대사 생존력에 대한 정보를 제공하여 적용된 방법이 근육 에너지 대사를 연구 할 때 특정 조건 하에서주의 사항을 가지고 있음을 시사합니다.

도 2에 나타난 바와 같이 기저 글루코스 흡수율은 암컷 마우스로부터 분리된 단독과 EDL 근육 사이에서 유사하였다. 이것은 또한12,13,19,20 이전에 여러 번보고되었습니다. 포도당 흡수는 최하위 유효 인슐린 농도 (100 μU / mL)에 반응하여 단독 및 EDL 근육에서 각각 12 및 9 μmol / g 단백질 / h에 도달하는 ~ 0.8 및 ~ 0.6 배 증가했습니다. 이 증가는 근육이 최대한의 효과적인 인슐린 농도 (10 mU / mL)로 자극되었을 때 훨씬 더 높았습니다 (단독 및 EDL 근육에서 각각 33 및 19 μmol / g 단백질 / h에 도달하는 ~ 4 배와 ~ 2 배...

근육 포도당 흡수의 온전한 조절은 전신 포도당 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 전신 포도당 대사에 대한 다양한 생리적 개입의 영향을 묘사 할 때 단리되고 배양 된 성숙한 골격근에서 인슐린 및 수축 자극 포도당 흡수에 대한 평가를 제시합니다.

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

생체외 모델은 다양한 생리학적 개입 및 약리학적 화합물 및 근육 글루코스 흡수의 영향을 평가하기 위한 유용한 방법이다. 이 기술은 손상되지 않은 동물 모델에서 방해 할 수있는 교란 요인이없는 격리 된 마우스 골격근에서의 포도당 흡수의 정확한 평가를 가능하게합니다. 실험을 시작하기 전에 통합 근육 스트립 생체 사진 시스템을 켜고 챔버를 섭씨 30도까지 따뜻하게하십시오.데이터 수집 소프트웨어를 열고 강제 트랜스듀서를 보정하여 데이터 세트 간의 비교 가능성을 보장합니다. 미리 가온된 섭씨 30도 기저 배양 배지 네 밀리리터를 각 인큐베이션 챔버에 넣고 배지가 95% 산소와 5% 이산화탄소로 지속적으로 산소화되는지 확인합니다. 마우스를 해부 트레이의 경향이있는 위치에 놓고 페달 반사에 대한 반응이 부족한지 확인하십시오.그런 다음 바늘로 앞발 하나를 고정하십시오. 가위를 사용하여 아킬레스 힘줄과 무릎 관절이 모두 보일 때까지 다리 아래에서 피부를 제거하십시오. 발바닥 근육의 해부를 위해, 16 센티미터의 비 흡수성 수술 나일론 봉합사로 준비된 단일 직경 봉합사 루프를 아킬레스 힘줄에 부착하고 아킬레스 힘줄에 원위 방향으로 핀 포셉을 고정하십시오.발바닥과 위장관 근육을 발바닥에서 풀어 내도록 자르고 조심스럽게 쥐를 가로 질러 오줌 포셉을 밀어 발바닥 근육을 노출시킵니다. 오줌 포셉을 아래로 고정하고 발바닥 근육의 근위 힘줄 주위에 두 번째 봉합사 루프를 놓습니다. 근위 힘줄을 자르고 위장관 근육이없는 두 개의 부착 봉합사 루프를 포함하여 발바닥을 해부하십시오.수집 할 때 루프를 사용하여 인큐베이션 챔버 중 하나의 각 후크에 발바닥 근육을 신속하게 부착하십시오. 포셉을 사용하여 경골 전방 근육을 덮고있는 근막을 제거하십시오. 경골 전방 또는 EDL 근육의 원위 힘줄은 맑은 흰색이어야하며 눈에 띄며 서로 분리되어야합니다.경골 전방 근육의 증류 힘줄을 자르고 근육을 해부하십시오. 포셉을 사용하여 EDL 근육을 주변 조직으로부터 부드럽게 해방시켜 힘줄을 자르지 않고 근육을 그대로 둡니다. 개별 봉합사 루프를 증류 및 근위 EDL 힘줄 주위에 놓습니다.루프가 배치되면 봉합사 루프가 부착 된 EDL 근육을 방출하기 위해 힘줄을 자르고 루프를 두 번째 인큐베이션 챔버의 후크에 빠르게 부착하십시오. 그런 다음 각 근육의 휴식 긴장을 약 다섯 밀리 뉴턴으로 조정하고 실험을 시작하기 전에 근육이 적어도 10 분 동안 배지에서 평형을 이루도록하십시오. 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위해, 챔버 내의 기초 인큐베이션 배지를 인슐린이 없는 인큐베이션 배지, 서브최대로 효과적인 인슐린 농도, 또는 20분 동안 최대한으로 효과적인 인슐린 농도로 대체한다.자극 기간이 끝날 때, 인큐베이션 배지를 10분 동안 동일한 농도의 인슐린을 함유하는 글루코스 흡수 인큐베이션 배지로 교체한다. 글루코스 흡수 인큐베이션이 끝나면 인큐베이션 챔버에서 근육을 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 기저 배양 배지에서 샘플을 세척하십시오. 세척 후 여과지에서 근육을 빠르게 건조시키고 액체 질소에서 봉합사 루프없이 조직을 동결시킵니다.그 다음 100 마이크로리터의 글루코스 흡수 배양 배지를 각 챔버로부터 수집하여 20도 섭씨 저장 및 근육 글루코스 흡수 분석을 위해 저장한다. 수축 자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위해, 백금 전극을 인큐베이션 챔버 내의 근육의 중앙 및 양쪽에 배치하고, 기초 인큐베이션 배지를 글루코스 흡수 인큐베이션 배지로 교체한 직후에 근육 수축을 개시한다. 각 인큐베이션된 근육으로부터의 강제 생산을 기록한다.10분 후, 입증된 바와 같이 근육을 부드럽게 수집하고 동결시키고, 입증된 바와 같이 근육 글루코스 흡수 분석을 위해 각 챔버로부터 글루코스 흡수 인큐베이션 배지의 100 마이크로리터 분취량을 저장한다. 동일한 근육 샘플 세트에서 웨스턴 블롯팅 분석에 의한 근세포 신호전달을 결정하기 위해, 400 마이크로리터의 얼음 냉 균질화 완충액에서 각각의 동결된 근육 샘플을 균질화하고, 샘플 말단을 섭씨 4도에서 한 시간 동안 끝까지 회전시킨다. 그런 다음 원심화에 의해 라이케이트를 수집하고 표준 웨스턴 블롯 분석 프로토콜에 따라 각 샘플 팔레트 내에서 관심있는 단백질의 양을 측정합니다.각 샘플에서 글루코스 흡수를 측정하기 위해, 각 샘플로부터 150 마이크로리터의 상청액과 상응하는 인큐베이션 챔버로부터 25 마이크로리터의 글루코스 흡수 인큐베이션 배지를 첨가하여 바이알당 3밀리리터의 액체 섬광 유체를 포함하는 액체 섬광 계수용 바이알을 분리한다. 그런 다음 바이알을 액체 섬광 계수기에 적재하고 제조업체의 지침에 따라 두 개의 데옥시 글루코스와 만니톨의 방사능을 측정하십시오. 이 대표적인 분석에서, 기저 글루코스 흡수율은 암컷 마우스로부터 분리된 발바닥과 EDL 근육 사이에서 유사하였다.포도당 흡수는 밑바닥과 EDL 근육에서 증가하여 최하위 및 최대 효과적인 인슐린 농도에 반응합니다. 더욱이, 아극적 및 최대 인슐린 자극된 글루코스 흡수는 모두 발바닥 근육에서 유의하게 더 높았다. 대조적으로, 수축 유도된 글루코스 흡수는 발바닥 근육에 비해 EDL에서 유의하게 더 높았다.여기서, 10분 자극 기간 동안 발바닥 및 EDL 근육에서 생성되는 최대 근력이 관찰될 수 있다. 예상한 바와 같이, EDL 근육은 자극 기간의 초기 부분 동안 더 많은 힘을 생성했고, 자극 기간 후반에 빠른 감소가 뒤따랐다. 서브맥스 및 최대 인슐린 농도는 Akt 트레오닌 308 및 TBC1D4 세린 588의 인산화의 증가를 유도한 반면, 수축은 AMPK 알파 트레오닌 172 및 ACC 세린 212의 인산화의 증가를 유도하였다.인슐린이나 수축은 전체 단백질 함량의 변화를 가져 오지 않았습니다. 격리 된 마우스 근육에서 포도당 흡수를 측정하기 전에 발바닥과 EDL 근육의 해부를 철저히 연습하는 것이 중요합니다. 근육 글루코스 흡수의 평가에 이어서, 남아있는 근육 단백질 용해물은 글루코스 흡수율의 관찰된 변화를 해명할 수 있는 추가적인 생화학적 분석에 사용될 수 있다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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