Name: 신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 모성 염증에 태아 노출(FEMI) 마우스 모형을 사용하여 급성 chorioamnionitis가 신생아 장 발달에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 이 기법은 괴사성 장염(NEC)의 기전을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 건강의 국립 연구소 (DK097335 및 T32AI007260)와 아이오와 스테드 소아과의 대학을 통해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물 절차는 아이오와 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 #8041401)에 의해 승인되었다. 모든 동물은 아이오와 대학에서 승인 된 실험실 동물 관리 (AALAC)의 평가 및 인증 협회에 보관되었습니다. 모든 마우스는 야생 형 균주 C57Bl/6J였다.
1. 임신 한 쥐에 FEMI의 설립
<ol><li>LPS 준비<ol>
<li>에샤리치아 대장균 O55:B5(재고 농도 2 mg/mL)에서 파생된 LPS를 사용하십시오.</li>
		<li>20 μg/mL의 작동 농도에 대한 멸균 식염수로 LPS 재고 농도 1:100을 희석합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모계 LPS 주입<ol>
<li>임신 일 e15에 임신 한 댐을 주입하십시오. 이 시점은 뮤린 임신을 통해 약 75%이며, 이 모델은 초리암니온염으로 인한 조산의 대부분이 발생하는 인간 임신의 초기 세 번째 삼보격과 발달적으로 유사합니다.</li>
		<li>적절한 LPS 주입을 결정하기 위해 주사 직전에 임신 한 마우스를 무게.</li>
		<li>다음 공식을 사용하여 작업 농도의 용량을 계산합니다: 5 μL x 그램 체중(gbw), 100 μg/kg의 LPS의 총 용량. 제어 동물의 경우, 주사에 대한 일반 식염수의 동등한 볼륨을 사용합니다.</li>
		<li>소용돌이 LPS 용액은 각 주입 전에 높은 15 초 동안 세 번.</li>
		<li>LPS 볼륨을 1mL 주사기로 그립니다.</li>
		<li>스크러핑 기술로 임신 한 마우스를 억제하십시오. 등대 반수 위치에 잡고 주사를 수행합니다.<ol>
<li>30\u201240° 각도에서 복부의 오른쪽 아래 사분면(방광 및 복부 혈관을 피하기 위해)을 위에 30 게이지 8mm 바늘 벨을 삽입합니다. 바늘의 길이를 약 1/4 ~ 1/2로 삽입합니다.</li>
			<li>주사기 플런저에 다시 당겨 주입하기 전에 부정적인 압력을 보장합니다. 음압이 존재하는 경우 주사를 진행합니다.</li>
			<li>주사 후, 약 30 분 동안 마우스를 모니터링 한 다음 임신의 나머지 부분에 대한 케이지로 돌아갑니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 자손의 납품 및 관리, 장 수확
<ol><li>e20에서 질 전달을 통해 일반적으로 새끼를 전달합니다. 참고: 이 모델은 그림 1에서 볼 수 있는 예상 복용량 의존 태아 손실 률을 가지고 있으며 아래 결과에서 논의 됩니다.</li>
	<li>새끼가 어머니와 함께 남아 광고 리비툼 피드를받을 수 있습니다.</li>
	<li>수확당일, 일반적으로 산후 14일(P14)은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜에 따라 자궁 경부 탈구를 통해 새끼를 안락사시합니다.</li>
	<li>가위와 집게를 사용하여 복부의 중간선 아래로 수직 절개를 하고, 피부와 복막을 통해 복부의 전체 길이를 만듭니다. 가위로 소장을 위장에서 cecum에 게 이 음 하 고 집게와 장간을 제거 합니다.</li>
	<li>소장의 1/3(인간 일루를 대표하는 부분)를 분리하고 유지하여 근위 소장, cecum 및 결장을 폐기한다.</li>
	<li>가위를 사용하여 일레움 부분을 반으로 나눕니다.</li>
	<li>이후 RNA 정량화를 위해 RNA 안정화 용액에 근위 절반을 놓는다.</li>
	<li>슬라이드 준비를 위해 10% 중립 버퍼링 포름틴에 탈반 절반을 배치합니다.</li>
</ol>3. 장 부상 득점
<ol><li>섹션 파라핀 은 5 μm 두께의 슬라이스에 조직을 내장하고 유리 슬라이드에 마운트. 참고: 우리는 파라핀 포함, 단면 및 슬라이드에 장착을 위한 히스토로지 코어로 표본을 보냅니다.</li>
	<li>표준 절차에 따라 슬라이드를 분리합니다.</li>
	<li>표준 절차에 따라 헤마톡슬린과 에신을 가진 얼룩 섹션.</li>
	<li>앞서 설명한 바와 같이 장 내 부상에 대한 3점 척도의 점수섹션은 42,43.<ol>
<li>경현미경검사를 사용하여, 지하멤브레인(43)으로부터의 고루 무결성 및 분리를 평가하는 3점 척도에서 2명의 별도 맹목적인 수사관에 의한 일반화된 장 손상을 평가한다(보충도1). 장 내 부상은 20배율 및 수치 조리개 0.50에서 가장 잘 평가됩니다.</li>
		<li>일반 점막을 설명하기 위해 점수0을 할당합니다.</li>
		<li>1의 점수를 할당하는 것은 부피 그루엔하겐의 공간, vacuolization 또는 빌리의 팁에 국한 된 피상적 인 리프팅의 개발을 포함하는 가벼운 부상을 설명합니다.</li>
		<li>심한 부상을 설명하기 위해 2의 점수를 할당, 상피 리프팅 및 바이크 올무의 절반 이상 큰 vacuolization에 의해 표시, 빌리 왜곡, 또는 점막 궤양 및 라미나 프로프리아의 붕괴.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 창과 잔 세포의 정량화
<ol><li>deparaffinization 다음, 알시안 블루/주기산 쉬프 얼룩을 가진 단계 2.8에서 조직 섹션의 얼룩 슬라이드는 이전에 설명된 바와 같이 잔과 창세포 모두를 나타내기 위하여44,45 다음 단계에 따라. 참고: 알시안 블루/주기성 산 쉬프 얼룩은 창이나 잔 세포에 만연하지 않지만, 우리의 경험에서, 맹목적인 숙련 된 조사자는 세포 표적 항체에 비해이 얼룩을 사용하여 동등한 세포 정량화를 가지고 있으며, 훨씬 적은 배경 염색46.</li>
	<li>다음과 같이 탈수 슬라이드를 분리, 얼룩 및 탈수합니다.<ol>
<li>자일렌에 있는 슬라이드를 10분 동안 두 번 잠급합니다. 주의: 자일렌은 연기 후드에 사용해야합니다.</li>
		<li>100% EtOH로 헹구는 다.</li>
		<li>3분 동안 100% EtOH로 슬라이드를 3분 동안 100% EtOH, 3분 동안 90% EtOH, 3분 동안 70% EtOH, 마지막으로 3분 동안 50%의 EtOH를 침수합니다.</li>
		<li>흐르는 수돗물 에서 5 분 동안 씻으시면 하십시오. 주의: 티슈 샘플의 손실을 방지하기 위해 흐르는 물에서 멀리 부분을 가리킵니다.</li>
		<li>표준 커피 필터로 알시안 블루 스테인 솔루션을 필터링합니다.</li>
		<li>알시안 블루 스테인에서 15분 동안 스테인슬라이드를 한 다음 흐르는 수돗물 아래에서 2분 간 세척합니다.</li>
		<li>이중 증류수 200mL에 1 mg의 주기산을 희석합니다. 이 솔루션의 슬라이드를 5분 동안 잠수합니다. 그런 다음 흐르는 수돗물 에서 1 분 동안 씻으릅니다.</li>
		<li>10 분 동안 쉬프의 시약으로 얼룩. 흐르는 수돗물 에서 5 분 동안 씻으시면 하십시오.</li>
		<li>헤마톡슬린으로 슬라이드를 1분 동안 묻은 다음 흐르는 수돗물 에서 2분 동안 세척합니다.</li>
		<li>산성 알코올 (1 mL의 염산 혼합 99 mL에서 70 % EtOH)에 1 분 동안 담급니다.</li>
		<li>스콧의 수돗물(수돗물에 NaHCO3 농도 0.1%)에 1분 동안 담근 다음 흐르는 수돗물 에서 1분 동안 세척합니다.</li>
		<li>슬라이드를 탈수합니다.<ol>
<li>각 슬라이드를 70% EtOH로 10회 찍어 90% EtOH에서 10회, EtOH100%로 10회 찍어 보세요.</li>
			<li>10분 동안 100% EtOH로 슬라이드를 잠그고, 신선한 자일렌에 두 번 잠급하여 각각 3분 동안 잠급됩니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>시편에 장착 용지 한 방울을 놓고 덮개 슬립을 위에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>잔 세포 계산<ol>
<li>가벼운 현미경 검사를 사용하여 잔 세포를 계산합니다(보충 도 2). 장 조직의 각 조각에 대 한, 잔 세포의 수를 계산 하 고 500 상피 세포 와 표현 잔 세포 비율을 100 상피 세포 당 비율로. 잔 세포는 20배율 및 수치 조리개 0.5에서 가장 잘 계산됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>창세포 계수<ol>
<li>가벼운 현미경 검사를 사용하여창세포(보충도 2)를계산합니다. 장 조직의 각 조각에 대 한, 창 자 지하실 당 창 세포의 비율로 표현. 장 조직의 각 조각당 100개의 장 내 지하실을 계산합니다. 창세포는 20x-60x 배율 및 수치 조리개 0.50-1.30으로 가장 잘 계산됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Chorioamnionitis 영향 2\u20124% 기간의 및 25\u201230% preterm 납품의8,9. 그러나, 초리오암니온염의 영향은 태아와신생아10,11,12,13,14,15,16에중요한 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 오래 전해질 수 있다. 중요한 것은, chorioamnionitis는 NEC15,1...

융경막은 포유류 임신에 필수적인 역할을 합니다. 그들은 여러 기능을 제공하는 초리온과 양상을 포함한다. 그들은 태아를 둘러싸고 보호하고, 모계와 태아 구획1사이의 파라크리니 신호를 용이하게하고, 파리오닉 멤브레인 내에서 로컬 피드백 루프를 생성하여 parturition1을시동하는 데 관여할 수 있다. 멤브레인의 현재 이해는 양막이 구조적 장벽 기능을 제공한다는 것을 나타내며, 초리온은 주로 모계 면역 계통2로부터발전하는 태아를 보호하기 위해 면역학적 완충제를 제공한다. 이 막의 염증은 chorioamnionitis로 알려져 있습니다. 역사적으로, 임상 초리오암니온염의 진단은 모계 열플러스 하나 이상의 태아 또는 모계 임상발견의존재에 따라 만들어졌으며3,4. 그러나, 이 정의는 임상적으로 유용하지만, 정밀도의 부족은 chorioamnionitis 연구를 도전하게 했습니다. 2015년, 진단을 명확히 하기 위해 유니스 케네디 슈리버 국립아동보건연구원의 전문가 패널 워크숍은 충야염염을 자궁내 염증 또는 감염 또는 둘 다(트리플 I)3로정의했다. 이러한 설명은 미생물 유도 감염이 자궁/양수 염증의 중요한 원인이지만 멸균 자궁/양수 염증5,6,7보다덜 일반적으로 발생하기 때문에 중요하다. 전반적으로, chorioamnionitis는 기간 납품의 2\u20124%와 조산 납품의 25\u201230%에서 볼 수 있듯이 중요한 공중 위생 문제점 남아 있습니다8,9.
Chorioamnionitis 태아와 신천에 중요 한 영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 잘 충진성 측량 이형성증을 포함하여 미숙아의 많은 이환의 증가 리스크와 연관된다는 것을 문헌에서 잘 문서화되었습니다10,뇌백색 물질 상해11,정맥 내 출혈12,미숙아 출혈13의망막 출혈, 및 모두 의외및 신생아14, 14의초기확인. 미숙한 장내 부상 및 수리 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 초리오암니온염은 또한 괴사장염(NEC)15,16의나중에 개발과 연관된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. NEC는 염증 및 후속 장 괴사(17)에대한 난독증 숙주 반응을 초래하는 조산 유아의 치명적인 위장 질환이다. NEC는 매년 미국에서 4,000명 이상의 유아에게 영향을 미치고 있으며, 이들 유아의 3분의 1은18세질병으로 사망합니다. NEC의 발병기는 아마도 장 미성숙의 조합을 포함, 미성숙 면역 체계의 dysregulation, 장 염증, 세균성 전좌19,장 괴사의 최종 일반적인 경로에 절정. 중요한 것은, NEC의 개시는 수시로 출생 후에 주 및 chorioamnionitis에 잠재적인 노출을, chorioamnionitis와 NEC의 후속 발달 사이 기계론링크를 불분명하게만듭니다. chorioamnionitis가 NEC의 병리 생리학에 기여할 수 있는 1개의 잠재적인 기계장치는 모계 면역 계통의 강화 조절을 통해서, 그 후에 정상 태아 발달 패턴을 방해할 수 있는 강한 태아 선동반응을생성합니다(21,22,23).
초리오암니온염의 다중 포유류 모델은 설치류 및 양24,25,26,27,28,29,30,31,32에존재한다. 그러나, 모성 염증에 대한 초암니염 유도 태아 노출(FEMI)에 이어 초기 신생아 기간을 넘어 장내 발병에 관한 몇 가지 데이터가 존재한다. FEMI와 미숙한 장의 부상의 후속 개발 사이의 관계를 탐구하기 위해, 우리는 리포 폴리사카라이드 (LPS)유도 FEMI 모델을 적응했다. 리포폴리사카라이드는 그람 음성 박테리아에 세포 외 표면의 주요 구성 요소이며 인간을 포함한 다중 진핵종의 타고난 면역 계통의 강력한자극제(33)이다. 모계 LPS 주사는 살아있는 박테리아의 혼동 효과 없이 멸균 염증 폭포를 초래하고, 조산34의유도를 위한 잘 확립된 모델일 뿐만 아니라 급성 초리암니온염 및 태아 염증 반응 증후군(FIRS)의 모델, 이는 가장 심한 형태의 초리오암니온염(24,35)이다. 또한 양모델(36)과 뮤린모델(37, 38,39,40)에서대뇌 백색 및 회색 물질 상해를 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, 우리의 지식에, 우리는 chorioamnionitis와 FEMI의이 모델을 사용하여 출생 과거 위장의 발달에 미치는 영향을 조사하고, chorioamnionitis및 NEC41의나중에 개발 사이의 가능한 기계론적 링크를 조사하기위해.

<table><tbody><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>시그마</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>알시안 블루 염색</td><td>신규 공급</td><td>1003A</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl6/J 마우스</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon 연구소</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 염색</td><td>Leica</td><td>381562</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-U 현미경</td><td>Nikon</td><td>2CE-MQVJ-1</td><td></td></tr><tr><td>주기적 산</td><td>ACROS</td><td>H5106</td><td>CAS# 10450-59-9</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermofisher</td><td>Am7021</td><td></td></tr><tr><td>Schiff의 시약</td><td>Sigma</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Secor 이미저 2400</td><td>메소 스케일 디스커버리(MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-Plex 어세이</td><td>메소 스케일 디스커버리(MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>시그마</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 murine 모형

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis는 조산의 일반적인 침전물이고 괴사 장염 (NEC)을 포함하여 미숙아의 이환의 많은 것과 연관됩니다. 그러나, 이 두 조건 사이 기계적인 링크는 아직 발견되지 않았습니다. 우리는 모성 염증 (FEMI)에 리포 폴리삭차라이드 (LPS)유도 태아 노출을 포함하는 chorioamnionitis의 뮤린 모델을 채택했습니다. FEMI의 이 모형은 또한 임상 chorioamnionitis의 많은 경우에 존재하는 멸균 모계, 태반 및 태아 선동적인 폭포를 유도합니다. 살아있는 박테리아를 이용하고 더 정확하게 chorioamnionitis의 결과로 상승 감염의 병리 생리학을 모방하는 모형이 존재하더라도, 이 방법은 미숙한 창자 및 관련 개발 microbiome의 발달에 간접적인 효력을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 LPS 유도 FEMI가 임신 손실및 조산에 있는 복용량 의존적인 증가, 뿐만 아니라 자손에 있는 일반적인 장 발달의 중단에 초래한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 우리는 FEMI가 자손에 있는 장 상해 및 혈청 사이토카인을 현저하게 증가시키는 것을 보여주었습니다, 동시에 진보와 Paneth 세포를 감소시키면서, 둘 다 장 염증에 대하여 선천적인 면역의 첫번째 줄을 제공하는. LPS 유도 FEMI의 유사한 모형은 chorioamnionitis와 중추 신경계의 후속 이상 사이 협회를 모델링하기 위하여 이용되었지만, 우리의 지식에, 이 프로토콜은 chorioamnionitis와 NEC 사이 잠재적인 링크로 chorioamnionitis 및 NEC 사이 기계적인 링크를 해명하기 위하여 시도하는 첫번째입니다.

배아 일째에 FEMI에 노출15 임신의 용량 의존손실과 조산 노동의 투여 의존율로 이어집니다(그림 1)42. 실험을 위해, 우리는 중요한 선동적인 모욕에 태아를 드러내면서 임신 손실 및 미숙아 (미숙아와 자궁 내 태아 죽음 둘 다 사이 50% 손실)를 극소화하기 위하여 100 μg/kg의 LPS 복용량을 사용하기로 결정했습니다.
이 방법을 사용하여, 우리는 다음 자손의 후속 상해에 FEMI의 효력을 검토했습니다. 일반화 된 장 상해를 측정하기 위해 3 점 조직학적 척도를 사용하여 출생 시 (P0) 및 성인기 (P56 또는 8 주)(그림 2)에서상당한 부상을 발견했습니다. 이 부상은 FEMI 이외의 동물에 대한 추가 자극이없는 경우 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 마우스는 생활의 첫번째 4 주 동안 계속 하는 상대적으로 미...

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

이 FEMI 프로토콜은 태아가 모계 염증에 노출된 후 신생아에 대한 장기적인 영향을 조사할 수 있도록 합니다. 이는 특히 괴사성 장염(NEC)의 발병과 관련이 있습니다. 이 기술은 융모양막염에서 흔히 볼 수 있는 무균 염증을 모방하며, 살아있는 박테리아가 부족하면 발달 중인 장관과 미생물 군집에 혼란스러운 영향을 미칠 수 있습니다.이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 FEMI를 유도하기 위한 LPS 주입입니다. 적절한 LPS 용량을 사용하고 주사가 임신 중쥐에게 복강 내 외상을 일으키지 않는 것이 매우 중요합니다. LPS 스톡을 1에서 100까지 멸균 식염수로 희석하여 밀리리터당 20마이크로그램의 작업 농도로 시작합니다.임신 일째에 임산부 댐을 주입하십시오 E15. 대조군 동물에 대해 동등한 양의 생리 식염수를 사용하여 적절한 LPS 투여량을 결정하기 위해 주입 직전에 마우스의 무게를 측정합니다. 높은 곳에서 15초 동안 LPS 솔루션을 세 번 소용돌이칩니다.그런 다음 1ml 주사기에 넣으십시오. 스크러핑 기술을 사용하여 임신한 쥐를 제지하고 등쪽 누운 자세로 유지합니다. 30 게이지, 8mm 바늘의 약 1/4에서 절반을 30-40도 각도로 복부의 오른쪽 아래 사분면 위에 비스듬하게 삽입합니다.음압을 보장하기 위해 주사기 플런저를 뒤로 당깁니다. 그런 다음 음압이 있는 경우 주입을 진행합니다. 약 30분 동안 생쥐를 모니터링한 다음 남은 임신 기간 동안 우리로 되돌려 보냅니다.E20에서 질 분만을 통해 새끼를 분만하고 어미와 함께 머물면서 광고 자유 사료를 받을 수 있도록 합니다. 출생 후 14일째에 장을 수확합니다. 가위와 집게를 사용하여 복부 정중선을 따라 피부와 복막을 통해 복부 전체에 걸쳐 수직으로 절개합니다.위에서 맹장까지 소장을 절제하고 장간막을 제거합니다. 소장의 원위 1/3을 분리하고 근위 소장, 맹장 및 결장을 버립니다. 가위를 사용하여 회장 부분을 반으로 나눕니다.그런 다음 RNA 정량화를 위해 근위부 절반을 RNA 안정화 용액에 넣고 원위 절반을 슬라이드 준비를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 넣습니다. 파라핀이 함유된 조직을 5마이크로미터 두께의 조각으로 절단하고 유리 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드를 파라핀화한 다음 표준 절차에 따라 hematoxylin 및 eosin으로 섹션을 염색합니다.광학 현미경을 사용하여 2명의 별도 맹검 조사관이 3점 척도로 전신 장 손상을 평가하고 융모 무결성 및 기저막과의 분리를 평가합니다. 정상 점막을 설명하기 위해 0점을 할당합니다. 경미한 손상을 설명하기 위해 1의 점수를 할당하며, 여기에는 상피하 Gruenhagen의 공간 발달, 진공 또는 얇은 판 또는 융모 끝으로 제한된 상피하 리프팅이 포함됩니다.상피 들림 및 액포가 융모, 융모 뒤틀림 또는 점막 궤양 및 판막의 붕괴의 절반 이상으로 표시되는 심각한 손상을 설명하기 위해 2점을 할당합니다. 슬라이드를 자일렌에 10분 동안 두 번 담그십시오. 그런 다음 100% 에탄올로 헹굽니다.슬라이드를 100% 에탄올, 90% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올에 3분 동안 담그십시오. 그런 다음 조직 샘플의 손실을 방지하기 위해 물을 멀리하도록 섹션을 향하게 하여 흐르는 물에 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 표준 커피 필터로 Alcian blue stain solution을 여과하고 15분 동안 슬라이드를 염색하는 데 사용합니다.그런 다음 흐르는 수돗물에 2분 동안 씻습니다. 200 밀리리터의 이중 증류수에 1 밀리그램의 주기적인 산을 희석하고 슬라이드를 이 용액에 5분 동안 담그십시오. 흐르는 물에 1분 동안 세탁한 후 Schiff의 시약으로 슬라이드를 10분 동안 염색하고 5분 동안 다시 씻습니다.그런 다음 헤마톡실린으로 1분 동안 염색하고 2분 동안 물로 씻어냅니다. 산성 알코올에 1분 동안 담근 다음 Scott의 수돗물에 1분 동안 담근 다음 흐르는 수돗물에 1분 동안 씻습니다. 슬라이드를 탈수시키려면 각 슬라이드를 70% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올에 10회 담그십시오.슬라이드를 100% 에탄올에 10분 동안 담근 다음 매번 3분 동안 신선한 자일렌에 두 번 담급니다. 시편에 장착 매체 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 커버슬립을 놓습니다. 현미경으로 잔 세포를 세십시오.장 조직의 각 조각에 대해 배상 세포와 500개의 상피 세포의 수를 세십시오. 그런 다음 배상세포를 100개의 상피세포당 비율로 발현합니다. Paneth 셀을 계산합니다.각 장 조직 조각에 대해 장샘당 파네스 세포의 비율을 기록하고 각 장 조직 조각에 대해 100개의 장샘을 세십시오. 태아 15일째에 태아가 모계 염증(FEMI)에 노출되면 용량 의존적 임신 손실과 용량 의존적 조산 비율이 발생합니다. FEMI는 출생 시와 생후 8주에 심각한 장 손상을 유발합니다.이러한 손상은 동물에게 어떠한 추가적인 자극도 주어지지 않을 때 발생하며, 이는 FEMI만으로도 갓 태어난 쥐의 장관의 정상적인 항상성을 방해한다는 것을 시사한다. 소장관의 원위 3분의 1에서 점액을 생산하는 잔 세포와 항균 펩타이드를 생산하는 파네스 세포의 수를 정량화했습니다. FEMI는 FEMI가 없는 동물에 비해 두 가지 세포 유형의 소실을 유도하여 장 상피의 정상적인 구성을 방해하는 것으로 밝혀졌습니다.FEMI가 신생아 염증 반응에 미치는 영향을 조사하기 위해 FEMI가 있는 강아지와 없는 강아지의 혈청에서 인터루킨-1 베타, 인터루킨-10, KCGRO 및 인터루킨-6를 포함한 다양한 혈청 염증 마커를 정량화했습니다. FEMI는 P0에서 모든 사이토카인에 대한 염증 연쇄반응을 유의하게 증가시켰다. 나중의 염증성 폭포는 시점과 사이토카인에 따라 달랐다. 흥미롭게도, FEMI와 가짜 그룹에서 P7에서 P28까지 비슷한 수준의 IL6가 나타났습니다.그러나, 2차 중재가 없었음에도 불구하고 P56에서 FEMI 그룹에서 상당히 높은 수치가 있었다. LPS의 재고에 따라 다른 효능을 가질 수 있으므로 초기 LPS 용량 곡선을 수행하는 것이 중요합니다. 우리는 신생아의 결과가 FEMI를 유도하는 데 사용되는 LPS의 용량에 따라 달라진다는 것을 발견했습니다.

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Medicine

의학

여기에, 절차는 대장균 K1의 문화와 신생아 쥐에 전신 감염의 설립을 설명합니다. 이것은 비 침습성 절차 맥락총에서 위장관 식민 전신 순환에 병원균의 전위, 및 중추 신경계의 침입을 허용한다.

Neuropathogenic의 비 침습 모델 대장균 신생아 쥐에 감염

여기에서는 syngeneic CD4+CD45RBhigh T cell을 T 및 B cell 결핍 수용자로 이식하여 마우스에서 결장 염증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 임상적 및 조직병리학적 특징은 인간의 염증성 장 질환을 모방합니다. 이 방법을 사용하면 결장 염증의 시작과 질병의 진행에 대한 연구를 할 수 있습니다.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

Encephalopathy of prematurity는 조산으로 인한 손상과 관련된 중추 신경계 이상을 포함합니다. 이 보고서는 융모막염을 모방한 자궁 내 일시적인 전신 저산소증-허혈 및 양수 내 지질다당류 투여(LPS)에 대한 임상적으로 관련된 쥐 모델, 그리고 감염 자극 및 태반 관류 부족이 CNS 발달에 미치는 관련 영향을 설명합니다.

미숙아의 모델링 뇌증은 흰쥐의 내부 - 양수 리포 폴리 사카 라이드와 태아 저산소증 - 허혈을 사용하여

이 연구는 gavaging 정확한 양의 신생아 쥐에 probiotics의 과정을 자세히 설명합니다. 실험 설정 포함 하도록 최적화 되었다 하지만 probiotic 주입, 관리의 방법 및 내장에 있는 박테리아의 정량화에 국한 되지 않습니다.

Gavage를 사용 하 여 신생아 쥐에 있는 Probiotic 연구

생체 발광 대장균 O1:K1:H7을 가진 신생아 마우스의 감염은 중요한 폐 염증 및 폐 병리를 가진 패혈증 감염을 초래합니다. 여기서는 전신 세균성 부담, 염증 성 프로파일링 및 폐 조직 병리학의 열거와 병행하여 세로 내 인트라비셔널 이미징을 사용하여 신생아 패혈증을 모델링하고 추가로 연구하는 절차를 설명합니다.

그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형

괴사 장염 (NEC)은 미숙아, 특히 매우 낮은 출생 체중 유아에서 자주 발생하는 가장 심각한 위장 (GI) 질병이며 사망률이 높고 불분명한 병인. NEC의 원인은 염증성 면역 규제 시스템 이상과 관련이 있을 수 있습니다. NEC 동물 모델은 NEC 질병 면역 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 동물 모델은 일반적으로 C57BL/6J 신생아 마우스를 사용; BALB/c 신생아 마우스는 거의 사용되지 않습니다. 관련 연구는 마우스가 감염될 때, Th2 세포 분화는 C57BL/6J 마우스에 비해 BALB/c 마우스에서 우세하다는 것을 보여주었습니다. 연구 결과는 NEC의 발생 그리고 발달이 T 도우미 타입 2 (Th2) 세포의 증가와 연관되고 일반적으로 감염을 동반한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 본 연구는 신생아 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC를 가진 아이들에서 관찰된 것과 유사한 임상 적 특성 및 장 병병리학적 변화를 가진 NEC 모델을 유도하였다. 추가 연구는 이 동물...

괴사 장염의 신생아 BALB/c 마우스 모델

이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마우스의 상승하는 질 감염, 조산 및 신생아 이환율 모델링

이 프로토콜은 괴사성 소장결장염(NEC)의 신생아 마우스 모델 및 신생아 쥐 소장에서 고유판 면역 세포의 후속 분리를 설명합니다.

면역 세포 프로파일링을 위한 괴사성 소장결장염 및 Lamina Propria 분리의 신생아 마우스 모델

이 논문은 초기 임신 염증이 신경발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 모체 면역 활성화(MIA) 마우스 모델을 생성하는 포괄적인 프로토콜을 제공하며, 신뢰성과 재현성을 보장하는 주요 지표를 포함합니다.

초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

배우세요 모성 염증에 태아 노출(FEMI) 마우스 모형을 사용하여 급성 chorioamnionitis가 신생아 장 발달에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 이 기법은 괴사성 장염(NEC)의 기전을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

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