신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

이 FEMI 프로토콜은 태아가 모계 염증에 노출된 후 신생아에 대한 장기적인 영향을 조사할 수 있도록 합니다. 이는 특히 괴사성 장염(NEC)의 발병과 관련이 있습니다. 이 기술은 융모양막염에서 흔히 볼 수 있는 무균 염증을 모방하며, 살아있는 박테리아가 부족하면 발달 중인 장관과 미생물 군집에 혼란스러운 영향을 미칠 수 있습니다.

이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 FEMI를 유도하기 위한 LPS 주입입니다. 적절한 LPS 용량을 사용하고 주사가 임신 중쥐에게 복강 내 외상을 일으키지 않는 것이 매우 중요합니다. LPS 스톡을 1에서 100까지 멸균 식염수로 희석하여 밀리리터당 20마이크로그램의 작업 농도로 시작합니다.

임신 일째에 임산부 댐을 주입하십시오 E15. 대조군 동물에 대해 동등한 양의 생리 식염수를 사용하여 적절한 LPS 투여량을 결정하기 위해 주입 직전에 마우스의 무게를 측정합니다. 높은 곳에서 15초 동안 LPS 솔루션을 세 번 소용돌이칩니다.

그런 다음 1ml 주사기에 넣으십시오. 스크러핑 기술을 사용하여 임신한 쥐를 제지하고 등쪽 누운 자세로 유지합니다. 30 게이지, 8mm 바늘의 약 1/4에서 절반을 30-40도 각도로 복부의 오른쪽 아래 사분면 위에 비스듬하게 삽입합니다.

음압을 보장하기 위해 주사기 플런저를 뒤로 당깁니다. 그런 다음 음압이 있는 경우 주입을 진행합니다. 약 30분 동안 생쥐를 모니터링한 다음 남은 임신 기간 동안 우리로 되돌려 보냅니다.

E20에서 질 분만을 통해 새끼를 분만하고 어미와 함께 머물면서 광고 자유 사료를 받을 수 있도록 합니다. 출생 후 14일째에 장을 수확합니다. 가위와 집게를 사용하여 복부 정중선을 따라 피부와 복막을 통해 복부 전체에 걸쳐 수직으로 절개합니다.

위에서 맹장까지 소장을 절제하고 장간막을 제거합니다. 소장의 원위 1/3을 분리하고 근위 소장, 맹장 및 결장을 버립니다. 가위를 사용하여 회장 부분을 반으로 나눕니다.

그런 다음 RNA 정량화를 위해 근위부 절반을 RNA 안정화 용액에 넣고 원위 절반을 슬라이드 준비를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 넣습니다. 파라핀이 함유된 조직을 5마이크로미터 두께의 조각으로 절단하고 유리 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드를 파라핀화한 다음 표준 절차에 따라 hematoxylin 및 eosin으로 섹션을 염색합니다.

광학 현미경을 사용하여 2명의 별도 맹검 조사관이 3점 척도로 전신 장 손상을 평가하고 융모 무결성 및 기저막과의 분리를 평가합니다. 정상 점막을 설명하기 위해 0점을 할당합니다. 경미한 손상을 설명하기 위해 1의 점수를 할당하며, 여기에는 상피하 Gruenhagen의 공간 발달, 진공 또는 얇은 판 또는 융모 끝으로 제한된 상피하 리프팅이 포함됩니다.

상피 들림 및 액포가 융모, 융모 뒤틀림 또는 점막 궤양 및 판막의 붕괴의 절반 이상으로 표시되는 심각한 손상을 설명하기 위해 2점을 할당합니다. 슬라이드를 자일렌에 10분 동안 두 번 담그십시오. 그런 다음 100% 에탄올로 헹굽니다.

슬라이드를 100% 에탄올, 90% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올에 3분 동안 담그십시오. 그런 다음 조직 샘플의 손실을 방지하기 위해 물을 멀리하도록 섹션을 향하게 하여 흐르는 물에 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 표준 커피 필터로 Alcian blue stain solution을 여과하고 15분 동안 슬라이드를 염색하는 데 사용합니다.

그런 다음 흐르는 수돗물에 2분 동안 씻습니다. 200 밀리리터의 이중 증류수에 1 밀리그램의 주기적인 산을 희석하고 슬라이드를 이 용액에 5분 동안 담그십시오. 흐르는 물에 1분 동안 세탁한 후 Schiff의 시약으로 슬라이드를 10분 동안 염색하고 5분 동안 다시 씻습니다.

그런 다음 헤마톡실린으로 1분 동안 염색하고 2분 동안 물로 씻어냅니다. 산성 알코올에 1분 동안 담근 다음 Scott의 수돗물에 1분 동안 담근 다음 흐르는 수돗물에 1분 동안 씻습니다. 슬라이드를 탈수시키려면 각 슬라이드를 70% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올에 10회 담그십시오.

슬라이드를 100% 에탄올에 10분 동안 담근 다음 매번 3분 동안 신선한 자일렌에 두 번 담급니다. 시편에 장착 매체 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 커버슬립을 놓습니다. 현미경으로 잔 세포를 세십시오.

장 조직의 각 조각에 대해 배상 세포와 500개의 상피 세포의 수를 세십시오. 그런 다음 배상세포를 100개의 상피세포당 비율로 발현합니다. Paneth 셀을 계산합니다.

각 장 조직 조각에 대해 장샘당 파네스 세포의 비율을 기록하고 각 장 조직 조각에 대해 100개의 장샘을 세십시오. 태아 15일째에 태아가 모계 염증(FEMI)에 노출되면 용량 의존적 임신 손실과 용량 의존적 조산 비율이 발생합니다. FEMI는 출생 시와 생후 8주에 심각한 장 손상을 유발합니다.

이러한 손상은 동물에게 어떠한 추가적인 자극도 주어지지 않을 때 발생하며, 이는 FEMI만으로도 갓 태어난 쥐의 장관의 정상적인 항상성을 방해한다는 것을 시사한다. 소장관의 원위 3분의 1에서 점액을 생산하는 잔 세포와 항균 펩타이드를 생산하는 파네스 세포의 수를 정량화했습니다. FEMI는 FEMI가 없는 동물에 비해 두 가지 세포 유형의 소실을 유도하여 장 상피의 정상적인 구성을 방해하는 것으로 밝혀졌습니다.

FEMI가 신생아 염증 반응에 미치는 영향을 조사하기 위해 FEMI가 있는 강아지와 없는 강아지의 혈청에서 인터루킨-1 베타, 인터루킨-10, KCGRO 및 인터루킨-6를 포함한 다양한 혈청 염증 마커를 정량화했습니다. FEMI는 P0에서 모든 사이토카인에 대한 염증 연쇄반응을 유의하게 증가시켰다. 나중의 염증성 폭포는 시점과 사이토카인에 따라 달랐다. 흥미롭게도, FEMI와 가짜 그룹에서 P7에서 P28까지 비슷한 수준의 IL6가 나타났습니다.

그러나, 2차 중재가 없었음에도 불구하고 P56에서 FEMI 그룹에서 상당히 높은 수치가 있었다. LPS의 재고에 따라 다른 효능을 가질 수 있으므로 초기 LPS 용량 곡선을 수행하는 것이 중요합니다. 우리는 신생아의 결과가 FEMI를 유도하는 데 사용되는 LPS의 용량에 따라 달라진다는 것을 발견했습니다.