Name: 애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 배우세요 삼투압 스트레스 신호 연구를 위한 인포프로테오믹스 방법을 Arabidopsis에서. 고효율 포스포펩티드 농축 기술로 식물 신호 전달 경로를 심층 분석하고 스트레스 반응 메커니즘을 규명합니다.

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이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램, 그랜트 XDB27040106에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>알루미늄 호일에 대조군 및 응력 처리 모종(1g)을 수확하고 액체 질소로 샘플을 동결시한다. 참고: 단백질 농도가 높은 것은 일반적으로 성숙한 식물에서 보다 2 주 오래 된 모종에서 관찰. 모종의 한 그램은 MS 분석에 충분 한 단백질 lysate의 약 10 mg을 생성 합니다. 모든 원심 분리 단계는 1단계에서 16,000 x g에서 수행됩니다.</li>
	<li>냉동 모종을 박격포와 액체 질소로 채워진 유봉을 사용하여 미세 한 분말로 갈아 냅니다.</li>
	<li>용해 버퍼 1mL 추가(100mM Tris-HCl에서 6M 구니딘-HCl, pH 8.5) 10mM Tris (2-carboxyethyl)인 포스핀 염산염(TCEP), 40mMM 2 클로로아세타미드(CAA), 프로테아제 억제제 및 인산 억제제 칵테일을 박격포에 넣고 유봉의 도움으로 혼합한다.</li>
	<li>식물용 용액을 1.5mL 튜브로 옮기고 95°C에서 5분 동안 가열합니다.</li>
	<li>튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 얼음 에 튜브를 10 초 동안 초음파 처리하고 10 초 동안 일시 중지하고 세 번 반복합니다.</li>
	<li>원심 분리는 20 분 동안 튜브를 원심 분리하고 식물의 150 μL을 1.5 mL 튜브로 lysate.</li>
	<li>튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>튜브에 100% 클로로폼의 150 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>튜브에 ddH2O의 450 μL을 추가합니다. 소용돌이와 원심분리기는 3분 동안 튜브를 분리합니다.</li>
	<li>상부 수성 층을 폐기합니다. 튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 튜브를 3분 동안 원심분리한 다음 용액을 폐기합니다.</li>
	<li>단백질 펠릿을 100% 메탄올의 600 μL로 세척합니다. 용액을 버리고 단백질 펠릿을 공기 건조시십시오.</li>
	<li>단백질 펠릿을 소화 완충제 600μL로 재차 스펜싱(12mM 나트륨 탈옥초레이트(SDC)/12m 나트륨 라우로일 사르코시나테(SLS)에서 100mM Tris-HCl, pH 8.5)로 재차한다. 서스펜션이 균질화 될 때까지 튜브를 초음파 처리합니다.</li>
	<li>BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 소화 완충액으로 농도를 4 μg/μL로 조정합니다. 용사(400 μg 단백질)의 100 μL을 새로운 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>50m 트리에틸람모늄 중탄산염(TEAB)의 292 μL과 리스-C(2.5단위/mL)의 8μL을 튜브에 추가합니다. 37°C에서 튜브를 3시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브에 8 μg 트립신과 함께 50 mM TEAB의 100 μL을 추가합니다. 튜브를 37°C에서 12시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브에 10% 트리플루오로아세산(TFA)의 25μL을 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 튜브를 소용돌이 및 원심분리합니다.</li>
	<li>상신을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 옮김합니다. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 용황을 건조시하십시오. 참고: 메탄올 1mL로 수지 활성화, 80% 아세토닐(ACN)에서 0.1% TFA의 1mL이 뒤를 이었다. 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 유기 용매를 씻어내시다. 1.16단계에서 제조된 산성 펩티드 샘플을 적재한 다음 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 컬럼을 세척한다. 염농도가 높은 시료에 더 많은 세체가 필요할 수 있습니다. 80% ACN에서 0.1% TFA의 1mL로 인포스펩티드를 엘테.</li>
</ol>2. 탠덤 매스 태그(TMT) 라벨링
<ol><li>말린 펩티드를 200mM 4-(2-하이드록스테틸)-1-파이프라진에탄술포닉산(HEPES), pH 8.5의 100 μL로 재차질한다.</li>
	<li>각 채널(0.8 mg)의 TMT 시약을 무수액 ACN의 40 μL에서 용해하십시오. TMT 시약 튜브를 5분 동안 소용돌이쳐 아래로 회전시십시오.</li>
	<li>TMT의 40 μL을 샘플 튜브로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 참고: 이 실험에서 채널 126 에서 128은 매니톨 처리없이 식물의 3 개의 생물학적 복제로 표지되었으며 채널 129 에서 131은 매니톨 치료를 가진 식물의 세 가지 생물학적 복제로 표지되었습니다.</li>
	<li>5% 하이드록실라민8μL을 넣고 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>5mL 튜브에 6개의 샘플을 섞고 10% TFA의 14 μL을 추가합니다.</li>
	<li>튜브에 0.1% TFA의 3,876 μL을 추가합니다. 소용돌이와 스핀 다운.</li>
	<li>솔루션을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 전송합니다. 증발기로 용루를 건조시다.</li>
</ol>3. IMAC 스테이지 팁 준비
<ol><li>폴리 프로필렌 프릿 디스크를 관통하는 16 G 무딘 엔드 바늘을 사용합니다. 참고: 커터를 디스크 표면에 수직으로 잡고 커터를 몇 번 굴려 디스크가 완전히 절제되었는지 확인합니다. 디스크를 페트리 접시에 담아 보관합니다. 바늘을 200 μL 파이펫 팁에 넣고 플런저를 사용하여 프릿을 팁에 밀어 넣습니다.</li>
	<li>플런저를 사용하여 프릿을 팁 끝으로 부드럽게 눌러 팁 끝을 캡합니다.<ol>
<li>더 나은 재현성을 제공하는 동일한 압력으로 팁에 frit 디스크를 배치합니다. 스테이지 팁 생산의 재현성은 원심분리기 단계의 타이밍과 기술 복제 사이의 재현성에 영향을 미치는 일정한 백압에 중요합니다.</li>
		<li>스테이지 팁이 컨디셔닝 단계에서 높은 역압을 표시하는 경우 샘플을 로드할 때 팁이 막히는 것을 방지하십시오. 디스크가 너무 단단히 제자리에 끼였을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA 스핀 컬럼을 반전시키고 1.5mL 튜브에 배치하십시오.</li>
	<li>플런저를 사용하여 Ni-NTA 구슬의 프릿을 부드럽게 누르고 구슬을 튜브에 밀어 넣습니다. 참고: 스핀 컬럼의 잠재적인 비드 손실 이나 흡착을 피하기 위해 프리를 부드럽게 밀어야 합니다.</li>
</ol>4. Hp-RP 단계 팁 준비
<ol><li>C8 디스크를 사용하여 IMAC 단계 팁에 설명된 대로 Hp-RP 단계 팁을 준비합니다. 참고: 조밀하게 포장된 frit을 초래하고 스테이지 팁의 역압이 증가할 수 있으므로 디스크에 큰 힘을 적용하지 마십시오. 모든 원심 분리 단계는 4단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다.</li>
	<li>100 μL 100% 메탄올에 C18 구슬 1 mg을 일시 중단하고 팁을 통해 구슬 용액을 전달합니다.</li>
	<li>완충 8(80% ACN/20% 200mM NH4HCO2,pH 10.0)의 20 μL을 스테이지 팁에 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 8을 통과한다.</li>
	<li>스테이지 팁에 버퍼 A(200mM NH4HCO2)의20 μL을 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 A를 전달합니다. 참고: 사용 중 원심분리기의 균형을 맞추고 Hp-RP 단계 팁이 완전히 건조되지 않도록 합니다.</li>
</ol>5. 스핀 어댑터 준비
<ol><li>날카로운 엔드 핀셋을 사용하여 1.5mL 튜브의 뚜껑 중앙에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>IMAC 스테이지 팁 또는 Hp-RP 단계 팁을 스핀 어댑터 구멍에 삽입합니다. 참고: 스테이지 팁이 스핀 어댑터 의 맨 아래에 가깝지 않은지 확인합니다.</li>
</ol>6. IMAC 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 농축
<ol><li>10 mgNi-NTA 구슬을 400 μL로 적재 버퍼(6% 아세트산(AA), pH 3.0)로 중단하고 모든 구슬 용액을 팁당 로드합니다. 원심분리로 솔루션을 팁을 전달합니다. 참고: 모든 원심분리 단계는 6.8단계 외에 6단계에서 3분 동안 200 x g로 진행됩니다.</li>
	<li>IMAC 단계 팁에서 니켈 이온을 제거하고 원심분리에 의해 팁을 통과하기 위해 50m m 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 100 μL을 적재한다.</li>
	<li>100 μL의 적재 버퍼를 단계 끝에 로드하고 원심분리로 솔루션을 통과합니다.</li>
	<li>스테이지 팁에 6% AA에 50mM FeCl3의 100 μL을 로드하고 원심분리로 팁을 통과합니다. Fe3+ 이온은 IMAC 스테이지 팁으로 킬레이트됩니다.</li>
	<li>100 μL의 적재 버퍼를 적재하여 스테이지 팁을 조건화하고 원심분리로 팁을 통해 용액을 전달합니다.</li>
	<li>단계 팁에 2.7 단계에서 준비된 시료 펩타이드와 하중 버퍼의 100 μL을 적재하고 원심분리에 의해 끝을 통해 용액을 전달한다. 참고: 새로운 튜브를 스핀 어댑터로 사용하여 시료의 흐름을 수집하고 향후 분석을 위해 동결기에서 유동을 저장합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 100 μL(4.5% AA 및 25% ACN)을 스테이지 팁에 적재하고 원심분리로 팁을 통과합니다.</li>
	<li>로딩 버퍼로 두 번째 세척을 수행합니다. 100 μL의 적재 버퍼를 스테이지 팁에 적재하고 1000 × g 원심분리기를 사용하여 3분 동안 솔루션을 팁을 통과합니다. 참고: 세척 버퍼가 스테이지 팁의 적재 버퍼로 대체되어 용출 단계 중 인포펩티드의 손실을 제거합니다. ACN의 농도가 5% 미만인지 확인하기 위해 인포펩티드 용출 전에 IMAC 단계 팁을 평형화합니다.</li>
	<li>앞면의 IMAC 스테이지 팁을 가위로 트리밍하고 다듬어진 IMAC 스테이지 팁을 Hp-RP 팁 에 배치합니다. 스테이지 팁의 두 레이어가 원심분리기의 뚜껑을 건드리지 않도록 합니다.</li>
</ol>7. Hp-RP C18 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 분획
<ol><li>용출 버퍼 100 μL(200mM 암모늄 인산염(NH4H2PO4)을트리밍된 IMAC 단계 팁에 추가하고 원심분리에 의해 단계 팁의 두 층을 통해 용액을 전달한다. 참고: 솔루션이 스테이지 팁을 통과하지 못하면 스핀 다운 속도를 높입니다. 모든 원심 분리 단계는 7단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다. 모든 Hp-RP 버퍼는 표 1에나열됩니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 IMAC 스테이지 팁을 폐기하고 20 μL의 버퍼 A를 Hp-RP 단계 팁에 추가하고 원심분리로 버퍼를 통과합니다. 참고: 모든 용출 버퍼가 IMAC 단계 팁을 통과한 후 폐기해야 합니다.</li>
	<li>버퍼 1의 20 μL을 추가하여 분수 1을 elute하고 원심분리로 새 튜브에서 용출을 수집합니다. 버퍼 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 프로세스를 반복하여 새 튜브에서 각 분수를 수집합니다. 진공 농축기로 각 분획의 최종 용출을 건조시다. 참고: 신선한 분수 버퍼를 준비합니다. 각 분수의 스핀 어댑터로 8개의 새로운 튜브를 가져 가라. 다른 스핀 어댑터에서 각 분획의 용출을 수집합니다. 인포펩타이드는 기본적인 조건하에서 안정되지 않으므로 농축기또는 산성으로 용액을 즉시 10% TFA로 건조시하십시오.</li>
</ol>8. LC-MS/MS 분석 및 데이터 분석
<ol><li>0.1%의 μL을 추가하여 0.1%의 포믹산(FA)을 추가하고 질량 분광계로 샘플을 분석합니다.</li>
	<li>각 분수에 대해 6-30% 버퍼 B(80% ACN 및 0.1% FA)로 90분 그라데이션을 실행합니다.</li>
	<li>높은 충돌 에너지 해리(HCD)를 사용하여 상위 10개의 표지된 펩타이드를 단편화한다. 데이터베이스 검색을 완료하여 인산화 사이트를 식별합니다.</li>
	<li>원시 파일을 MaxQuant 소프트웨어에 로드하고, 실험이름을 지정하고, 분수 및 PTM을 설정합니다. 참고 : MaxQuant 소프트웨어의 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/ 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>LC-MS/MS 실행 유형의 리포터 이온 MS2와 6plex TMT를 등불 라벨로 선택합니다. PIF 함수별로 필터를 활성화하고 최소 PIF를 0.75로 설정합니다.</li>
	<li>가변 변형 패널에 아세틸(단백질 N-term), 산화(M), 인(STY)을 선택한다. 카르바미도메틸(C)을 고정 수정으로 선택합니다.</li>
	<li>소화 모드를 특정로 설정하고, 트립신/P를 소화 효소로 선택하고, 두 개의 골짜기를 놓친다.</li>
	<li>PSM 거짓 발견율(FDR) 및 단백질 FDR을 0.01로 설정합니다. 수정된 펩티드에 대한 최소 점수를 40으로 설정합니다.</li>
	<li>fasta 파일 패널에 아라비도시스 탈리아나 데이터베이스를 추가하고 데이터베이스 검색을 실행합니다.</li>
	<li>검색이 완료되면 인(STY) 사이트의 txt 파일을 Perseus 소프트웨어에 로드합니다. 참고 : Perseus 소프트웨어의 자세한 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/perseus/ 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>역형 인산화 부위를 걸로 합니다. 현지화 확률 75%를 컷오프로 사용하여 비지역화된 인산화 부위를 필터링합니다.</li>
	<li>통계 분석을 위해 인산화 부위의 강도를 사용합니다.</li>
</ol>

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<li>Possemato, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+phosphoproteomic+profiling+using+titanium+dioxide+and+immunoaffinity+enrichments+reveals+complementary+phosphorylation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events.</a> Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

식물 프로테오메와 인포프로테오움의 동적 범위와 복잡성은 여전히 인포프로테오믹스 분석의 깊이에 대한 제한 요소입니다. 10,000개의 인산화부위(21,22)를식별하는 단일 실행 LC-MS/MS 분석의 능력에도 불구하고, 전체 식물 인포프로테오메의 커버리지는 여전히 제한적이다. 따라서 환경 스트레스에 대응하여 식물 신호 네트워크의 글로벌 뷰를 프로파일링하는 데 높은 감도 및 우수한 분리 효율을 제공하는 인포프로테오믹 워크플로우가 요구된다. 상용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼 계 크로마토그래피는 MS분석(23,24)에앞서 펩타이드 복잡성을 감소시키는 일반적인 방법이다. 그러나 지루한 샘플 수집 단계와 큰 용출 량은 감도 및 처리량 측면에서 HPLC 기반 방법의 주요 과제입니다. 단계 팁은 고감도 및 고처리량 작업에 ...

염도가 높고, 저온, 가뭄으로 인해 삼투압이 발생하며, 이는 식물 생산성1,2에영향을 미치는 주요 환경 요인이다. 단백질 인산화는 삼투압3,4,5에대한 식물 반응에서 신호 지각 및 트랜스포팅을 중재하는 가장 중요한 번역 후 변형 중 하나입니다. SNF1 관련 단백질 키나아제 2s(SnRK2s)는 삼투성 응력 신호6에관여한다. SnRK2 가족 구성원 10명 중 9명은 삼투압7,8에대한 대응으로 상당한 활성화를 보여준다. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-12)모든 10 SnRK2에서 돌연변이를 갖는 돌연변이는 삼투압에 과민반응을 표시하였다. snrk2-dec 돌연변이체에서는, 삼투성 스트레스-유도된 이노시톨 1,4,5-트리스포산염(IP3),abscisic acid (ABA) 생합성 및 유전자 발현의 축적이 강하게 감소되어 삼투스트레스 반응6에서SnRK2s의 중요한 역할을 강조한다. 그러나, SnRK2s 키나아제는 어떻게 이 생물학 프로세스를 통제하는지 아직도 불분명합니다. 삼투압 응력에 대한 반응으로 인포프로테오믹 변화를 프로파일링하는 것은 이 격차를 해소하고 식물의 삼투압 유발 방어 메커니즘을 묘사하는 효율적인 방법입니다.
질량 분광법(MS)은 식물 인포프로테오메9를매핑하는 강력한 기술이다. 식물 인포프로테오믹스의 특성화는 식물 프로테오메의 동적 범위와 식물 리자테4의복잡성으로 인해 여전히 과제로 남아 있다. 이러한 과제를 극복하기 위해 광합성 안료 및 이차 대사 산물과 같은 원치 않는 간섭을 제거하고 식물 인포프로테오메10의깊은 커버리지를 가능하게 하는 범용 식물 인포프로테오믹 워크플로우를 개발했습니다. 고정금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 금속 산화물 크로마토그래피(MOC)와 같은 여러 인포펩타이드 농축 방법은 MS 분석11,12,13,14,15,16이전에인포펩티드를 농축하기 위해 개발되었다. 인스포펩티드와 함께 정화하는 산성 비인펩타이드는 인포펩티드 검출을 위한 주요 간섭이다. 이전에는 IMAC 로딩 버퍼의 pH 값 및 유기산 농도를 표준화하여 비인펩티드의 결합을 제거하고, 사전 분획단계(11)를우회하여 90% 이상의 농축 특이성을 얻었다.
인포펩티드 농축 및 분획의 다단계 공정에서 시료 손실은 인포펩티드 식별의 감도 및 인포프로테오믹 커버리지의 깊이를 저해한다. 스톱 앤 고-이동-추출 팁(무대 팁)은 팁의 끝을 캡하는 작은 디스크가 포함된 파이펫 팁으로, 펩티드 분획 및 청소17을위한 크로마토그래피와 통합할 수 있다. 단계 팁 절차 중 샘플 손실을 최소화할 수 있는 경우 튜브 간의 샘플 전달을 방지하여 최소화할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 인간 인포 프로테오메(15)의깊이를 향상 노래 인광 펩타이드에서 낮은 풍부한 다중 인광 펩티드를 분리하기 위해 Ga3 +- IMAC 및 Fe3 +-IMAC에서 단계 팁을 구현했다. 또한, 높은 pH 반전상(Hp-RP) 단계 팁의 사용은 강한 양이온 교환(SCX) 및 강력한 음이온 교환(SAX)크로마토그래피(18)에비해 인간 막 프로테오메의 폭넓은 커버리지를 입증하였다. 따라서 IMAC 및 Hp-RP 단계 팁 기술을 통합하면 단순성, 높은 특이성 및 높은 처리량으로 식물 인포프로테온 커버리지를 증가시킬 수 있습니다. 우리는 이 전략이 아라비도시스 모종에서 20,000개 이상의 인산화 부위를 확인했으며, 이는 식물 인포프로테오메19의향상된 깊이를 나타내는 것으로 입증되었다.
여기에서, 우리는 애기독증에 있는 인포프로테오믹 프로파일링을 위한 단계 팁 기지를 둔 인포프로테오믹 프로토콜을 보고합니다. 이 워크플로우는 삼투압에 대응하여 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 분동을 연구하기 위해 적용되었다. 인포프로테오믹 분석은 키나아제 활성화 및 초기 삼투압 신호에 연루된 인산화 부위를 밝혀냈습니다. 야생 형 및 snrk2-dec 돌연변이 인산염 데이터의 비교 분석은 높은 식물에서 osmore 응력 신호에 중요한 역할을 하는 Raf 와 같은 키나아제 (RAF)-SnRK2 키나아제 캐스케이드의 발견을 이끌어 주었습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td>Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, 무색, 100 튜브</td></tr><tr><td>200 &micro; L 피펫 팁</td><td>Gilson</td><td>F1739311</td><td></td></tr><tr><td>2-chloroacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438080100</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모</td>늄 <td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>인산암모늄 monbasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216003</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>무딘 바늘</td><td>Hamilton</td><td>90516</td><td>Kel-F 허브 (KF), 포인트 스타일 3, 게이지 16</td></tr><tr><td>C18-AQ 비드</td><td>Dr. Maisch</td><td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore 디스크</td><td>3 M</td><td>2214</td><td>47 mm</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>에펜도르</td><td>프 22620444</td><td></td></tr><tr><td>클로로포</td>름 <td>Sigma-Aldrich</td><td>CX1058</td><td></td></tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td></td><td>Perseus 1.6.2.1</td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr> <tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formic 산성</td><td>시그마 알드리치</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>프릿</td><td>애질런트</td><td>12131024</td><td>SPE 카트리지 용 프릿</td></tr><tr><td>구아니딘 하이드로 클로</td>라이드 <td>시그마 알드리치</td><td>50933</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>시그마 알드리치</td><td>1153334000</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마 알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>철 (III) 염화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>질량 분석기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>나노 LC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Easy-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 스핀 컬럼</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine 나트륨 소금</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>플런저</td><td>Hamilton</td><td>1122-01</td><td>플런저 어셈블리 N, RN, LT, LTN 모델 1702용 (25 &mu; l)</td></tr> <tr><td>검색 엔진 소프트웨어</td><td></td><td>MaxQuant 1.5.4.1</td><td>https://www.maxquant.org</td></tr><tr><td>SEP-PAK 카트리지 50 mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SpeedVac Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD121P</td><td></td></tr><tr><td>TMT 6-plex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>트리에틸암모늄 바이카보네이트 완충액</td><td>시그마-알드리치</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

단백질 인산화는 삼투성 조건 하에서 효소 활성 및 유전자 발현의 조절에 매우 중요합니다. 질량 분광법 (MS)기반 인포 프로 테오믹스는 식물 신호 변환을 연구하는 방법을 변화시켰습니다. 그러나, 커버리지의 깊이를 달성하기 위해 많은 시작 재료와 장기간 MS 측정 시간의 요구 사항은 식물의 글로벌 인포 프로테오믹 변화에 대한 높은 처리량 연구에 대한 제한 요인이되고있다. 식물 인산염의 감도와 처리량을 개선하기 위해, 우리는 삼투압 스트레스에 대응하여 식물 인산화 의 신속하고 포괄적 인 분석을 위한 탠덤 질량 태그 (TMT) 라벨과 결합된 정지 및 이동 추출 (stage) 팁 기반 인포프로테오믹스 접근법을 개발했습니다. 단계 팁 기술의 단순성과 높은 처리량을 활용하여 전체 절차는 두 가지 팁을 사용하여 인포펩티드 농축, 분수 및 시료 세척 단계를 완료하는 데 약 1시간이 걸리며, 이는 접근 방식의 사용하기 쉽고 높은 효율을 시사합니다. 이 접근법은 심층적인 식물 인포프로테오믹스 분석(> 11,000인스포펩티드 식별)을 제공할 뿐만 아니라 인접한 분수 간의 우수한 분리 효율(&5% 중복)을 보여줍니다. 또한, 멀티플렉싱은 TMT 라벨링을 사용하여 야생형 및 snrk2 탈취 돌연변이 식물의 인포프로테오믹 변화를 정량화하고 있다. 이 접근법은 육상 식물의 초기 삼투압 신호에 대한 이해를 밝히는 삼투압 스트레스에 대한 응답으로 Raf와 같은 키나아제의 인광 이벤트를 성공적으로 밝히는 데 사용되었습니다.

이 워크플로우의 성능을 입증하기 위해 Hp-RP 단계 팁 분획과 결합된 IMAC 단계 팁을 활용하여 30분 동안 매니톨 처리 유무에 관계없이 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 변화를 측정했습니다. 각 샘플은 생물학적 삼중방식으로 수행되었으며 실험 워크플로우가 도 1로표현된다. 각 시료의 소화된 펩티드(400 μg)는 1개의 TMT-6plex 채널로 분류되었고, 풀과 탈염시켰다. 인포스펩타이드는 IMAC 단계 팁을 사용하여 더욱 농축되었고, 정제된 인포스펩타이드는 이후 Hp-RP 단계 팁에 의해 8개의 분획으로 분획되었다. 각 분획은 90분 LC 그라데이션 분석에 의해 분석되었다. 원시 파일은 아라비도시스 탈리아나 데이터베이스에 대한 검색 엔진을 사용하여 검색되었습니다.
총 11,077개의 고유 인포펩타이드가 6,852개의 국소화된 인산화 부위(클래스 I, 국소화 확률 &...

여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

이 전략은 생물적 또는 비생물적 스트레스에 대응하여 식물 인산단백질체의 전반적인 변화를 종합적으로 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술을 사용하면 사용하기 쉽고 처리량이 많은 방식으로 인단백질체학(phosphoproteomics) 분석을 심층적으로 수행할 수 있습니다. IMAC 스테이지 팁 준비의 경우 16게이지 무딘 끝 바늘을 사용하여 프로필렌 프릿 디스크를 관통하고 플런저를 사용하여 프릿을 팁에 부드럽게 누릅니다.그런 다음 반전된 니켈-NTA 스핀 컬럼을 1.5ml 튜브에 놓고 플런저를 사용하여 니켈-NTA 비드 프릿을 튜브에 부드럽게 누릅니다. 인산펩타이드 농축을 위해 IMAC 스테이지 팁을 사용하여 니켈-NTA 비드에 400마이크로리터의 로딩 버퍼를 추가하고 전체 부피의 비드 용액을 하나의 IMAC 스테이지 팁에 로드합니다. 원심분리를 통해 용액을 팁에 통과시키고 100마이크로리터의 50밀리몰 EDTA를 로드하여 원심분리를 통해 팁에서 니켈 이온을 제거합니다.원심분리를 통해 팁을 100마이크로리터의 로딩 버퍼로 처리합니다. 다음으로, 원심분리를 통해 6% 아세트산에 50밀리몰 염화철 100마이크로리터로 팁을 처리합니다. 원심분리를 통해 100마이크로리터의 로딩 버퍼로 스테이지를 컨디셔닝합니다.그런 다음 100마이크로리터의 로딩 버퍼로 원심분리하고 샘플 펩타이드를 보충합니다. 원심분리 후 세척당 100마이크로리터의 세척 버퍼로 팁을 두 번 헹구고 100마이크로리터의 로딩 버퍼로 한 번 헹굽니다. 원심분리가 끝나면 가위를 사용하여 IMAC 스테이지 팁의 전면을 자르고 트리밍된 팁을 높은 pH, 역상 팁 내부에 놓습니다.인산펩타이드 분별의 경우, 높은 pH 역상 C18 스테이지 팁을 사용하여 원심분리를 통해 100마이크로리터의 용리 완충액을 스테이지 팁의 두 층에 통과시킵니다. 스핀이 끝나면 핀셋을 사용하여 IMAC 스테이지 팁을 버리고 20마이크로리터의 버퍼 A를 높은 pH 역상 스테이지 팁에 추가합니다. 원심분리 후 수집된 분획에 20마이크로리터의 Buffer 1을 첨가하고 원심분리를 통해 새 튜브에 용출액을 수집합니다.8개의 분수가 모두 수집될 때까지 버퍼 2에서 8까지 이 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 진공 농축기에서 각 분획의 최종 용출액을 건조시킵니다. 이 대표적인 분석에서는 야생형에서 총 8개, 107개 및 7개, 248개의 인산펩티드가 확인되었으며, SnRK2는 각각 돌연변이 샘플을 제거했으며, 이는 애기장대에서 신호 전달에 대한 전반적인 관점을 설명하기 위한 심층적인 적용 범위를 제공하는 데 있어 워크플로우의 효율성을 보여줍니다.8개 분획에 걸쳐 확인된 인산펩타이드의 수를 비교한 결과, 처음 두 분획에는 인산펩타이드가 거의 존재하지 않는 것으로 나타났지만, 대부분의 인산펩티드는 마지막 6개 분획 사이에 고르게 분포되어 있었습니다. 이 접근법을 제안하면 식물 인산단백질체에서 복합 인산펩티드를 분리할 수 있는 능력을 얻을 수 있습니다. 인접한 두 분획 사이의 인산펩티드의 중복을 평가한 결과, 인산펩티드 중첩의 5% 미만이 인접한 분획에서 발생함을 나타냈습니다.만니톨 처리 후, 야생형 샘플에서 433개의 인산화 부위가 증가되었습니다. 한편, SnRK2 decuple 돌연변이 샘플에서 380개 부위가 증가했습니다. 이 중 312개의 인산물질은 야생형에서 유도를 보였으나 SnRK2 dec 돌연변이 식물에서는 그렇지 않았다.분석의 재현성을 높이기 위해 동일한 양의 압력을 사용하여 프릿 디스크를 팁에 로드하는 것이 중요합니다. 머지않아 양이온 교환 크로마토그래피는 농축된 인산펩티드를 분별하기 위한 대체 측정으로 사용되어 식물 인산단백질체의 더 넓은 적용 범위를 얻을 수 있습니다.

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