사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

노화는 궁극적으로 유기체 죽음의 확률을 증가 다중 세포 과정의 시간 의존 적 악화를 특징으로한다. 인구 내에서, 이 과정은 가변이고 유전및 환경 요인의 숫자는 그것에 영향을 미칠 수 있습니다. 가장 공부하고 이해 변수 중 하나는 수명에 다이어트의 역할입니다.

식이 제한은 궁극적으로 노화와 노화 관련 변화의 발병을 지연시키는 개입이다. 이것은 유기체의 수명과 건강 기간을 증가, 또는 유기체가 정상, 건강한 수명을 가지고 있는 시간의 길이. 우리의 현재 이해는 돌연변이의 축적, 텔로미어의 dysregulation, 단백질 항상성, 호흡 문제 및 반응성 산소 종의 손실과 같은 노화의 특징이라고 불리는 세포 변화의 뚜렷한 세트의 식별으로 이끌어 냈습니다.

지금 이 이해의 많은 많은 다른 모형 유기체를 사용하는 연구 결과에서 옵니다. 수명을 단축하고 연장하는 유전자를 확인한 많은 유전 적 스크린이 있었습니다. 그리고 이들은 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae에 있는 연구 결과, 이 방법론의 초점입니다, 뿐만 아니라 C.elegans 및 뮤린 시스템과 같은 더 복잡한 다세포 유기체에 있는 연구 결과 포함합니다.

이 중 에서도 신진 효모는 짧은 자연 수명과 복잡한 유전 적 관계를 해명 할 수있는 여러 가지 유전 적 접근으로 인해 노화 연구에 특히 적합하므로 노화유전학의 기능적 해부를위한 훌륭한 시스템입니다. 효모는 노화의 여러 가지 측면을 연구하는 데 활용할 수 있습니다. 그리고 우리는 세포가 살아남을 수있는 기간인 연대순 수명에 초점을 맞출 것입니다.

이 작업의 목적은 과발현 억제기 화면을 수행하기 위해 간단한 유전 적 접근 방식을 제시하는 것입니다. 우리는 비정상적으로 단축 된 연대 수명을 초래하는 유전 적 배경을 활용할 것입니다. 그리고 우리는 정상적인 수명을 회복하는 유전자를 식별하려고 시도, 구조 또는 단축 된 수명 표현형을 억제 할 수있는 유전자를 식별하기 위해 표적 접근 방식을 활용할 것입니다.

첫 번째 유전 적 배경은 효모의 자가 면역 결핍 변형입니다. 자가 먹는 것으로 느슨하게 번역되는 Autophagy는 단백질및 세포기관과 같은 세포간 제품을 리소좀에 전달하는 세포 내 분해 시스템입니다. 이것은 손상된 단백질을 제거해서 세포 항상성을 유지하는 것을 돕습니다, 뿐만 아니라 그들의 생활을 살았던 그.

우리는 ATG1 유전자의 삭제가 있는 돌연변이 긴장으로 일할 것입니다. 세포질-바쿠올 표적 통로에서 소포 형성 및 자가식에 필요한 단백질 세린/테레오닌 단백질 키나아제에 대한 ATG1 코드. ATG1 null 돌연변이체는 비정상적으로 짧은 연대순 수명을 갖는 표현형을 가지고 있습니다.

이 노화 실험실에서는 ATG1 null 돌연변이의 비정상적으로 단축된 수명 특성을 구조하거나 억제할 수 있는 유전적 요인을 설계하고 테스트합니다. 그러나, 이것은 또한 그밖 단명한 유전 배경으로 확장될 수 있습니다. 이 프로세스에 있는 첫번째 단계는 수명 연장에 연결되는 유전자를 확인하는 것입니다.

우리는 그(것)들이 과도하게 표현될 때 연대수 기간을 연장하는 유전자에 특히 집중할 것입니다. 이를 위해 효모 게놈 데이터베이스에서 액세스할 수 있는 공개적으로 사용할 수 있는 데이터를 사용할 것입니다. 우리는 여기에 갈거야.

표현형으로 검색합니다. 그리고 중간에 대해, 우리는 우리가 연대순 수명을 선택할 수 있습니다 볼 수 있습니다. 수명을 증가 유전자를 찾기 위해, 당신이 볼 수있는 것은이 특정 표현형에 연결된 유전자가 사용할 수있는 데이터의 재산이다.

오늘, 우리는 SIR2를 공부할 것입니다, 그것은 과대 표현 될 때 연장 된 연대 수명에 연결되는 히스톤 리신 deacetylase. 우리가 할 첫번째 일은 코딩 지구에 대한 DNA 순서뿐만 아니라 이 유전자의 양쪽을 좌우하는 규제 지역에 접근하는 것입니다. 우리는 우리가 모든 규제 지역을 포괄할 수 있도록 상류 및 다운스트림에 400 개의 기본 쌍을 취할 것입니다.

우리는 우리가 우리의 플라스미드 벡터로이 유전자를 복제 할 수 있도록 PCR 프라이머를 설계하기 위해이 DNA 서열을 사용합니다. 우리는 PCR을 사용하여 유전자를 증폭시키고 pRS315 벡터로 복제할 것입니다. 이를 위해 힌드III 및 SacII 제한 사이트를 통합한 제한 소화 사이트가 포함된 프라이머를 설계합니다.

당신이 볼 수 있듯이, 플라스미드는 모두 제한 사이트를 포함, 힌드 III와 SacII, 그 우리의 복제를 용이하게합니다. 증폭하려는 지역에 무료로 약 21 또는 22개의 뉴클레오티드를 포함하도록 PCR 프라이머를 설계해야 합니다. 서열 이외에, 그들 중 5개의 프라임 엔드에 적절한 제한 부위, 전방 프라이머에 힌드III, 또는 역 프라이머에 SacII를 각각 빨간색과 보라색으로 도시하고, 그 이상의 상류에, 제한 효소가 결합하고 더 높은 효율로 제한 소화 부위를 생성할 수 있도록 하는 몇 가지 뉴클레오티드를 추가한다.

YPAD와 같은 농축 된 미디어에서 포스트 로그 단계까지 야생 형 효모의 5 밀리리터 문화를 하룻밤 사이에 성장시다. 곰팡이 게놈 격리에 특정 되는 시판 되는 사용 가능한 키트를 사용 하 여 게놈 DNA를 수확. 키트는 매우 단단하고 거친 세포벽을 가지고 있기 때문에 효모에 특정하는 것이 중요합니다.

Zymolyase 처리는 세포벽을 소화하는 데 효과적이며 게놈 수율을 크게 증가시킵니다. 분광계를 사용하여 DNA의 양과 품질을 결정합니다. 복제에 적합한 앰플리션을 생성하려면 증폭 과정에서 돌연변이를 피하기 위해 고충실도 PCR 폴리머라아제를 활용해야 한다.

시판되는 다양한 고충실도 PCR 키트가 있습니다. 반응의 최적화를 용이하게 하려면 여러 버퍼링 시스템, 표준 고충실도 버퍼, 복잡한 앰플리콘의 높은 GC 콘텐츠에 최적화된 키트를 선택하는 것이 좋습니다. 우리는 우리의 게놈 DNA의 200 나노 그램을 추가할 것입니다.

버퍼의 마이크로리터 5기를 추가할 예정입니다. 앞으로 2 1/2 마이크로리터를 추가하고 역프라이머를 추가할 예정입니다. 우리는 폴리머라제 의 마이크로리터 1개, D NtP의 마이크로리터 2개를 추가할 것입니다.

그리고 마지막으로, 우리는 멸균 증류수를 가진 50 마이크로 리터에 대한 전체 반응을 QS에 갈 것입니다. 우리는 우리가 사용하는 효소에 대한 특정 프로토콜뿐만 아니라 우리가이 실험에서 설계 한 프라이머에 따라 반응을 실행합니다. PCR 반응을 정리하고 집중합니다.

선택적 미디어에서 하룻밤 동안 대장균의 5 밀리리터 문화를 성장시다. 원심분리로 문화를 펠렛하고 상체부를 폐기한다. 제공된 chaotropic 버퍼에서 세포를 5분 동안 다시 일시 중지하고 용액으로 제거합니다.

반응을 중화하고 반전으로 5~6회 혼합한다. 최대 속도로 10분 동안 시료원심분리합니다. 상체를 옮기고 실리카 기둥으로 옮기고 제공된 버퍼로 세척합니다.

흐름을 버리고 다른 적절한 버퍼로 세척을 반복하며, 그 사이에 30초 원심분리가 들어와 흐름을 각각 폐기합니다. 마지막에, 원심 분리기는 어떤 잔류 에탄올을 제거하고 20 마이크로 리터 용출 버퍼로 플라스미드를 엘테하고 분광광계에 의해 양과 품질을 결정합니다. 이제 벡터와 인서트의 제한 소화를 설정할 때입니다.

벡터 또는 삽입물, CutSmart 버퍼 5개, SacII의 마이크로리터 1개, HindIII의 마이크로리터 1개, QS 반응 을 추가하여 최종 반응 볼륨을 50 마이크로리터로 가져오는 데 추가합니다. 제한 소화를 3시간 동안 37센티미터로 배양하고, 효소를 가열하고 활성화하기 위해 20분 동안 80센티미터를 섭취합니다. 이 시점에서 다이제스트는 다음 단계로 진행하기 전에 4도에서 저장할 수 있습니다.

다음으로 소화된 게놈 조각과 방금 완성한 벡터를 사용하여 15개의 마이크로리터 리깅을 설정합니다. 먼저 6마이크로리터의 물을 추가합니다. 소화된 벡터의 마이크로리터 2개를 추가할 예정입니다.

이것은 우리의 pRS315 플라스미드입니다. 우리는 우리의 삽입의 4개의 마이크로리터, SIR2 유전자를 추가할 것입니다. 10X 버퍼의 경우 리게아제 버퍼의 마이크로리터 2개를 추가합니다.

그리고 마지막으로, 우리는 리그아제의 마이크로 리터 를 추가 할 것입니다. 우리는 하룻밤 사이에 16도에서 이것을 배양한 다음 20 분 동안 80도 섭씨에서 효소를 가열할 것입니다. 성공적으로 제작된 플라스미드를 선별하기 위해 이를 대장균으로 변환할 것입니다.

우리는 화학적으로 유능한 세포의 50 마이크로 리터를 사용할 것입니다. 우리는 얼음에 해동할 것이고, 해동하자마자 결찰 반응을 추가하려고 합니다. 따라서 삽입과 함께 15마이크로리터의 리구이를 추가할 것이며, 별도의 반응에 15마이크로리터를 추가할 것입니다.

추가되면 튜브를 혼합하기 위해 튜브를 몇 번 쓸어 넘깁니다. 그리고 우리는 얼음에 이것을 배양 할 것입니다. 얼음에 30 분 인큐베이션을 완료 한 후, 우리는 우리가 그들을 꺼내 것입니다 지점, 우리는 20 초 동안 인큐베이션및 열 충격을 42도 난방 블록에 샘플을 추가 할 거야, 우리는 복구 미디어를 추가합니다.

열 충격 후, 우리는 복구 기간을 허용할 것입니다. 우리는 우리의 샘플을 취할 것입니다 그리고 우리는 SOC 미디어의 450 마이크로 리터를 추가 합니다. 우리는 플라스미드를 집어 들고 암피실린 저항 유전자가 발현되기 시작할 수 있도록 37도 센티미터에서 이들을 배양할 것입니다.

우리는 45 분 동안 37도에서 이러한 샘플을 복구 할 수 있습니다. 그 인큐베이션 후, 우리는 일련의 희석, 1 대 10, 1- 100을 설정하고, 우리는 LB / Amp 미디어에 이것들을 접시에 올려 세포가 하룻밤 동안 자랄 수 있도록 할 것입니다. 멸균 기술을 사용하여 플레이트를 할 것입니다.

우리는 우리가 그에 따라 표시하고 우리의 선택 가능한 마커를 포함하는 적절한 접시를 취할 것입니다. 우리는 우리의 변형 된 대장균의 150 마이크로 리터를 취할 것입니다. 멸균 접종 루프를 사용하여, 우리는 부드럽게 접시의 전체에 걸쳐 세포를 확산그래서 우리는 좋은 균일 한 분포를 얻을 것이다.

모든 희석금을 도금한 후에는 이 접시를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하여 어떤 것을 재배하는지 볼 수 있습니다. 하루 가량 지나면 식민지들이 자라서 우리가 만들려고 했던 플라스미드를 담고 있는 것을 보아야 합니다. 그들은 이런 식으로 보일 것입니다.

멸균 기술을 사용하여 이전에 설명한 절차에 따라 5밀리리터 LB와 암피실린으로 변신하여 성장한 잠재적 인 변압제를 접종하십시오. 모든 잠재적 인 변압제에서 플라스미드를 분리하고 이전에 설명한 바와 같이 제한 소화를 실행합니다. 잠재적인 변압제를 빈 벡터와 비교하여 아가로즈 젤에서 반응 제품을 실행합니다.

추가 연구를 위해 적절한 크기의 인서트를 절제하는 변압제를 저장합니다. 플라스미드를 성공적으로 만들었기 때문에 ATG1 null 효모 배경으로 변환할 예정입니다. 우리는 세포의 15 마일을 취할거야 그리고 우리는 펠릿거야, 나는 이미 바로 여기에 수행 한.

그들은 펠릿 후, 그들은 성장 했다 YPAD 미디어를 제거 하 고 증류수와 세포를 세척. 그 후, 우리는 세포를 취할 거야 그리고 우리는 100 밀리머 리튬 아세테이트에서 그들을 다시 중단 할 거야. 우리는 그 200 마이크로 리터에서 그들을 다시 일시 중단 할 것입니다.

셀 펠릿을 부드럽게 위아래로 피펫으로 재보페트합니다. 변환당 이 믹스의 50 마이크로리터를 사용하여 수행될 각 변환에 대해 세포를 별도의 미세분리튜브로 분할합니다. 각 변환에 50%PEG의 240마이크로리터를 추가해야 합니다.

PEG는 매우 점성, 파이펫이며 매우 신중하게 측정합니다. PEG를 추가한 후 와 추가 구성 요소의 모든 후 파이펫팅으로 혼합합니다. 다음으로 1개의 어금니 리튬 아세테이트, 연어 정자 DNA의 5개의 마이크로리터, 또는 그밖 운반자 DNA의 36마이크로리터를 추가합니다, 그 5 분 동안 끓여서 얼음에 두어, 그리고 마지막으로 각 변환을 위한 플라스미드의 5개의 마이크로리터는 당신이 능력을 발휘할 것입니다.

혼합하기 위해 각 튜브를 철저히 소용돌이. 샘플을 섭씨 30도에서 45분 동안 배양합니다. 10 분 동안 42 센티미터에서 그들을 열 충격, 다음 멸균 물에 한 번 세포를 씻어, 마지막으로 멸균 물 200 마이크로 리터에서 그들을 다시 중단.

1-10 및 1-100개의 변형된 효모 균주의 희석제와 150마이크로리터를 SC 마이너스 루 플레이트에 올려 플라스미드를 선택한다. 세포를 균일하고 균일하게 퍼뜨리고 플레이트가 30도 섭씨에서 반전하고 배양하기 전에 건조할 수 있게 하여 48~72시간 동안 자랄 수 있습니다. 유전자를 성공적으로 복제하여 테스트하면 유기체의 연대순 수명에 미치는 영향을 테스트할 것입니다.

우리는 효모를 성장시킬 것이며, 시간의 기능으로 남아있는 실행 가능한 식민지 형성 단위의 수를 모니터링할 것입니다. SC에서 72시간 동안 먼저 효모를 성장시키면 30도에서 흔들리는 류신 액체 미디어를 뺀 값입니다. 혈전계를 사용하여 500개의 세포를 플레이트할 수 있도록 하는 데 필요한 희석을 결정합니다.

멸균 기술을 사용하여 세포를 SC 마이너스 루 플레이트에 플레이트하여 30도 에서 3 일 동안 반건조하고 배양 할 수 있게하여 자라서 식민지 성장을 기록하고 그 시점을 기록 할 수 있습니다. 접시를 만든 후, 흔들리지 않고 섭씨 30도에서 효모를 계속 배양하십시오. 처음에, 우리는 우리의 예비 데이터가 노화 표현형의 억제를 제안하는 경우에 더 빈번한 시간 점을 취하는 주간 간격으로 도금을 반복합니다.

백분율 의 생존 가능성을 결정하기 위해 분석을 위해 하루 1시간 지점으로 정상화합니다. 모든 간격으로 동일한 희석을 플레이트해야 합니다. 더 이상 식민지가 자라는 것을 볼 때까지이 과정을 계속하십시오.

Excel 스프레드시트에 정보를 입력하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 실험이 끝날 때 각 변형의 생존 가능성을 신속하게 확인할 수 있습니다.