Name: 생체 재료에 대한 세포 독성 및 세포 반응에 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 학습하세요 생체 재료의 세포 독성과 생물학적 활성을 정량적·정성적으로 평가하는 방법을. MTT 분석, 형태학적 평가, 면역세포화학을 활용하여 치과, 정형외과, 심장학 등 다양한 임상 분야에서 새로운 생체 재료를 특성화하고 안전성을 검증할 수 있습니다.

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We thank the following for support: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB는 전략 프로젝트 UIDB/04539/2020 및 UIDP/04539/2020(CIBB)을 통해 FCT(Foundation for Science and Technology)를 통해 국가 기금으로 자금을 지원받습니다. MDPC-23 세포주를 제공한 University of Michigan Dental School의 Jacques Nör에게 감사드립니다.

1. 펠렛 준비
<ol><li>PVC 플레이트에 알려진 치수의 원형 구멍을 수행하여 폴리염화비닐(PVC) 몰드를 준비합니다. 알림: PVC 몰딩은 다양한 크기로 만들 수 있습니다. 공식 A= h(2πr)+2πr2 (r: 원통의 반지름, h: 원통의 높이)를 사용하여 PVC 몰드의 접촉면을 계산합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 테스트 할 생체 재료를 준비하십시오. 참고: 페이스트/페이스트 제형 바이오 재료의 준비를 위해 적절한 양의 베이스 페이스트와 촉매를 혼합 주걱으로 수동으로 혼합합니다. 액체 및 분말 제형을 기반으로 하는 다른 재료의 경우 제조업체의 지침에 따라 또는 적절한 새 재료에 따라 수동 스패테이션 또는 진동과 기계적 혼합을 수행해야 합니다. 액체 재료의 경우 이 단계가 필요하지 않습니다. 2단계에서 프로토콜을 시작합니다.</li>
	<li>주걱으로 생체 재료를 금형에 놓고 적절한 시간 동안 고정시킵니다. 알림: 생체 재료의 경화 시간 및 경화 조건은 제조업체의 지침을 따르거나 새로운 재료에 적합해야 합니다.</li>
	<li>설정 후, PVC 몰드에서 생체 재료의 펠릿을 제거하고 용기에 넣습니다(6웰 플레이트 또는 페트리 접시 사용 가능).</li>
	<li>펠릿을 자외선 (UV) 램프 아래에 두어 각 면에 대해 20분 동안 소독합니다.</li>
</ol>2. 생체 재료의 추출물 얻기
알림: 모든 절차는 엄격한 멸균 조건에서 수행해야 합니다.
<ol><li>1.1에 설명된 공식에 따라 펠릿 표면적을 계산하여 필요한 펠릿 수를 결정합니다. 참고: 기준 값으로, 250 mm2/mL11,15의 접촉 표면적은 배지 mL당 9개의 펠릿(r 3 mm x h 1.5 mm)을 추가하여 달성됩니다.</li>
	<li>가용성 추출물(생체 재료가 풍부한 추출물)을 준비합니다.<ol><li>펠릿을 50mL 튜브에 넣고 해당 세포 배양 배지를 추가합니다. 튜브를 37°의 인큐베이터에 24시간 동안 일정한 회전으로 놓습니다. 참고: 세포 배양에 적합한 세포 배양 배지를 사용하십시오.</li>
		<li>24 시간 후 인큐베이터에서 튜브를 꺼냅니다. 이 시점에서, 추출물은 1/1 또는 100%의 농도에 상응한다.</li>
		<li>동일한 부피의 컨디셔닝 배지를 세포 배양 배지에 순차적으로 첨가하여 추출물을 희석합니다. 알림: 매체에 pH를 조정해서는 안 됩니다.<ol><li>100% 추출물 1mL에 배양액 1mL를 가하여 50% 추출물을 얻었다. 50% 추출물 1mL에 배양액 1mL를 추가하여 25% 추출물을 얻는 식입니다(그림 1). 참고: 각 화합물과 관련된 농도를 사용하십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61512/61512fig1v2.jpg"> 그림 1: 가용성 추출물의 준비 및 희석 계획. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61512/61512fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 생체 재료 추출물을 사용한 세포 배양
<ol><li>세포 현탁액을 준비하고, 실험에 필요한 세포의 수에 따라 멀티웰 플레이트와 같은 적절한 세포 용기에 플레이트한다.<ol><li>80%에서 90%의 합류점으로 원하는 세포의 플라스크로 시작합니다.</li>
		<li>세포 배양 배지를 버리고, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 트립신 EDTA (75cm2 세포 배양 플라스크에 대해 1 내지 2 mL)로 세포를 분리한다.</li>
		<li>세포 배양 배지 (75cm2 세포 배양 플라스크에 대해 2 내지 4 mL)를 첨가하고, 세포 현탁액을 튜브로 옮기고, 200 x g 에서 5 분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>펠렛을 알려진 부피의 세포 배양 배지에 현탁시킵니다. 참고: 이 프로토콜은 부착 세포 배양의 사용을 위해 설계되었습니다. 그러나 현탁 세포 배양과 함께 작동하도록 간단한 적응을 할 수 있습니다.</li>
		<li>혈구계에서 세포를 세고 세포 현탁액의 세포 농도를 계산합니다.</li>
		<li>결정된 양의 세포 현탁액을 배양액에 현탁하고 멀티웰 디쉬로 옮깁니다. 파종 밀도의 기준 값으로 5 – 20 x 105 cells/cm2를 고려하십시오. 알림: 적절한 셀 수는 셀 유형 및 셀 특성, 즉 셀 배가 시간에 따라 계산해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포가 부착될 수 있도록 세포를 24시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>이 기간이 지나면 가용성 추출물을 배양 플레이트에 투여합니다.<ol><li>세포 배양 배지를 흡인합니다.</li>
		<li>앞에서 설명한 대로 농도 순서에 따라 각 웰에 생체 재료의 추출물을 추가합니다. 새로운 세포 배양 배지를 대조군 웰에 추가합니다.</li>
		<li>플레이트를 24시간 이상 배양합니다. 참고: 음성 대조군은 배양 배지에서 유지되는 처리되지 않은 세포에 해당하는 각 분석에서 수행해야 합니다. 배양 시간은 연구 목표에 따라 선택할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 대사 활성의 평가
<ol><li>생체 재료 추출물과 함께 세포를 배양한 후 플레이트에서 배지를 흡인하고 각 웰 PBS를 세척합니다.</li>
	<li>각 웰에 PBS, pH 7.4에서 준비한 0.5mg/mL 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸 브로마이드(MTT)의 적절한 부피를 넣습니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C의 어둠 속에서 4시간 또는 하룻밤 동안 배양한다.</li>
	<li>얻어진 포르마잔 결정을 가용화하기 위해, 이소프로판올 중의 0.04 M 염산 용액의 적절한 부피를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 교반한다. 알림: 우물의 크기에 따라 MTT와 이소프로판올의 양을 조정하십시오.</li>
	<li>필요한 경우 결정이 보이지 않을 때까지 위아래로 피펫팅하여 각 웰의 내용물을 저어주고 균질화합니다.</li>
	<li>분광광도계에서 620nm 기준 필터를 사용하여 570nm 파장의 흡광도를 정량화합니다.</li>
	<li>대사 활성을 계산하기 위해, 처리된 세포의 흡광도를 대조 배양물의 흡광도로 나눕니다. 백분율 값을 얻으려면 100을 곱하십시오.</li>
</ol>5. 세포사멸 평가
알림: 이 평가를 수행하려면 조건당 최소 10개의6 개 셀을 사용해야 합니다.
<ol><li>평가 중인 조건에 따라 적절하게 식별된 원심분리기 튜브를 사용하십시오.</li>
	<li>생체 재료 추출물과 함께 세포 배양 후 배양 배지를 각 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>세포를 분리하고 세포 현탁액을 각 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 120 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 농축한다.</li>
	<li>펠릿을 PBS로 세척하십시오. PBS를 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다.</li>
	<li>PBS 1mL를 넣고 세포 펠릿을 확인된 세포분석 튜브에 옮깁니다.</li>
	<li>PBS를 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다.</li>
	<li>100 μL의 결합 완충액(0.01 M HEPES, 0.14 mM NaCl 및 0.25 mM CaCl2)16과 함께 배양하고 세포막 회복을 위해 세포를 약 15분 동안 휴지시킵니다.</li>
	<li>형광 표지 Annexin-V 2.5μL와 요오드화 프로피듐 1μL를 실온에서 어두운 곳에서 15분 동안 추가합니다.</li>
	<li>배양 후 400μL의 PBS를 추가하고 세포분석기에서 분석합니다. 정보의 분석 및 정량화를 위해서는 적절한 소프트웨어를 사용하십시오.</li>
	<li>살아있는 세포, 세포 사멸, 후기 세포 사멸 / 괴사 및 괴사의 백분율로 결과를 제시합니다.</li>
</ol>6. 형태 평가
<ol><li>멀티웰 플레이트 내부에 맞는 적절한 크기의 멸균 유리 커버슬립을 선택하십시오.</li>
	<li>멸균 핀셋을 사용하여 각 슬라이드를 우물에 넣습니다.</li>
	<li>적절한 농도의 세포 현탁액을 웰 내로 분배하고, 95% 공기 및 5%CO2를 갖는 가습된 분위기 하에 37°C의 인큐베이터에서 밤새 방치한다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 세포 배양물을 추출물에 노출시킵니다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 PBS로 세척하십시오.</li>
	<li>커버슬립을 실온에서 건조시킨 다음 커버슬립을 덮을 수 있는 충분한 양의 May-Grünwald 용액을 추가합니다. 3 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>염료를 제거하고 증류수로 1분간 세척한다.</li>
	<li>물을 제거하고 커버슬립을 덮을 수 있도록 충분한 양의 Giemsa 용액을 추가합니다. 15 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>흐르는 물에 커버슬립을 씻으십시오.</li>
	<li>커버슬립을 슬라이드로 옮깁니다.</li>
	<li>현미경으로 보십시오. 선택한 배율로 사진을 촬영합니다.</li>
</ol>7. 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 세포기능 평가
알림: 이 평가를 수행하려면 조건당 최소 2x106 개의 셀을 사용해야 합니다. 예를 들어, 알칼리성 포스파타제는 치아세포 활성 평가를 위한 관심 유전자로 제시됩니다. 관심있는 다른 유전자는 표 1에서 볼 수 있습니다.
<ol><li>위에서 설명한 대로 세포를 플레이트합니다. 참고: 도금된 세포의 농도는 연구 중인 생체 재료의 세포 유형 및 세포 독성에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>위에서 설명한 대로 가용성 추출물과 함께 배양합니다.</li>
	<li>세포를 분리하여 앞에서 설명한 바와 같이 현탁액을 얻습니다.</li>
	<li>세포를 PBS로 2회 세척하고; 이 원심분리기를 200 x g에서 실온에서 5분 동안 처리한다.</li>
	<li>펠릿을 1 mL의 RNA 정제 용액 (예를 들어, NZYol)에 현탁시키고, 강렬하게 교반하고, 연속적인 피펫팅하여 세포를 용해시킨다.</li>
	<li>샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>클로로포름 200 μL를 넣고 튜브를 손으로 15 초 동안 흔든다.</li>
	<li>실온에서 3 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>원심분리기는 12,000 x g에서 15분 동안 4°C에서 용해됩니다. 이 원심분리 동안 샘플에서 두 단계가 발생하여 RNA가 수성(상부) 상에 남게 됩니다.</li>
	<li>수성상을 새 튜브로 제거하고 500μL의 차가운 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다.</li>
	<li>시료를 실온에서 10분 동안 배양하고, 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 제거하고, 펠렛을 7,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 75% 에탄올 1 mL로 세척한다.</li>
	<li>에탄올이 증발 할 때까지 펠렛을 실온에서 건조시킨다.</li>
	<li>RNase가 없는 물에 현탁합니다.</li>
	<li>흡수 분광 광도계를 사용하여 시료의 순도를 정량화하고 측정하며, 파장 260 nm 및 280 nm에서 측정합니다. RNA 순도를 측정하고 순도 비율(A260/280)이 약 2.0인 샘플을 사용합니다.</li>
	<li>샘플을 -80 ° C에서 보관하십시오.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜17에 따라 RT-PCR을 수행합니다. 참고: 연구 목표에 따라 평가할 특정 마커를 선택합니다.</li>
</ol>8. 단백질 동정을 통한 세포 기능 평가
참고: 연구 목표에 따라 평가할 특정 단백질을 선택합니다. 예를 들어, 상아질 시알로프로테인(DSP)은 치아세포 활성 평가를 위한 관심 단백질로 제시됩니다. 관심있는 다른 단백질은 표 1에서 볼 수 있습니다.
<ol><li>커버슬립에서 세포를 배양하고 앞에서 설명한 대로 추출물에 노출시킵니다.</li>
	<li>배양된 세포를 PBS로 세척한다.</li>
	<li>실온에서 3.7 분 동안 30 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.</li>
	<li>PBS로 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>PBS에서 0.5% 트리톤으로 15분 동안 투과합니다.</li>
	<li>PBS 중의 0.3% 과산화수소로 퍼옥시다아제를 5분 동안 차단한다.</li>
	<li>PBS로 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>0.5% 소혈청알부민(BSA)으로 두 번 씻습니다.</li>
	<li>45분 동안 2% BSA로 세포 배양을 차단합니다.</li>
	<li>PBS에서 0.5% BSA로 세척하십시오.</li>
	<li>선별된 단백질에 따른 1차 항체와 함께 실온에서 60분 동안 배양한다. 참고: 이 프로토콜은 1차 항체 DSP(M20) 항체(1:100)와 2차 항체 다클론 토끼 항염소 면역글로불린/HRP(1:100)를 사용합니다.</li>
	<li>PBS에서 0.5% BSA로 5회 세척합니다.</li>
	<li>실온에서 90분 동안 2차 항체와 함께 배양합니다. 참고: PBS에서 0.5% BSA를 사용하여 항체 희석액을 만드십시오.</li>
	<li>각 세척에서 1분 동안 PBS에서 0.5% BSA로 5회 세척합니다.</li>
	<li>25분 동안 20μL chromogen/mL 기질 농도의 기질 및 발색원 혼합물과 함께 배양합니다.</li>
	<li>PBS에서 0.5% BSA로 두 번 세척합니다.</li>
	<li>헤마톡실린으로 15분 동안 카운터스테인을 사용합니다.</li>
	<li>0.037 mol/L 암모니아와 증류수로 5분 동안 세척하여 과잉 염료를 제거합니다.</li>
	<li>슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 글리세롤을 장착 매체로 사용하십시오.</li>
	<li>밤새 말리십시오.</li>
	<li>현미경으로 보십시오. 선택한 배율로 사진을 촬영합니다.</li>
</ol>9. Alizarin Red S assay를 통한 광물화 평가
<ol><li>Alizarin Red S 용액을 40 mM 농도로 준비한다18. 어둠 속에서 12 시간 동안 균질화를 위해 용액을 저어줍니다. 알림: Alizarin Red S 용액 100mL를 준비하려면 빛으로부터 보호되는 초순수에 알리자린 분말 1.44g(분자량: 360g/mol)을 가용화합니다. 이 용액의 경우 pH 값은 매우 중요하며 4.1에서 4.3 사이여야 합니다.</li>
	<li>위에서 설명한 대로 가용성 추출물로 세포 배양을 배양합니다.</li>
	<li>세포 배양물을 PBS로 세 번 세척합니다.</li>
	<li>실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.</li>
	<li>PBS로 세 번 씻으십시오.</li>
	<li>Alizarin Red Staining 용액으로 염색하여 37°C에서 20분간 암실에 두었다.</li>
	<li>염색 후, 플레이트를 PBS로 세척하여 과량의 염료를 제거한다.</li>
	<li>현미경으로 보십시오. 선택한 배율로 사진을 촬영합니다.</li>
	<li>10%(w/v) 아세트산과 20%(w/v) 메탄올로 구성된 추출 용액을 각 웰에 넣고 실온에서 40분 동안 교반합니다.</li>
	<li>분광광도계(19)로 490 nm 파장에서의 흡광도를 측정한다.</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이해 관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 조직과 접촉하는 생체 재료의 시험관 내 세포 독성 평가를 지칭하는 ISO 10993-5를 고려하여 설계되었으며, 생체 적합성을 평가하고 연구 재현성에 기여합니다21. 이것은 과학에서 점점 더 많은 관심사이며, 많은 저자들은 이미 시험관 내 연구 15,22,23,24,25,26,27,28의 실험 설계에서 이러한 권장 사항을 따르고 있습니다.
<p class="jove_conten...

생체적합성은 조직을 통합하고 국소 및 전신 손상이 없는 유리한 치료 반응을 유도하는 물질의 능력으로 정의할 수 있다 1,2,3. 생체 적합성 평가는 의료용 재료의 개발에 매우 중요합니다. 따라서 이 프로토콜은 새로운 생체 재료 개발을 목표로 하거나 기존 생체 재료에 대한 새로운 응용 프로그램을 연구하는 모든 연구자에게 체계적이고 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.
시험관 내 세포 독성 시험은 일차 세포 배양 또는 세포주를 사용하여 생체 적합성 평가의 첫 번째 단계로 널리 사용됩니다. 결과는 잠재적인 임상 적용의 첫 번째 지표를 구성합니다. 이 테스트는 생체 재료 개발에 필수적일 뿐만 아니라 EUA 및 EU 규제 기관(FDA 및 CE 인증)4,5,6,7,8의 시장 도입에 대한 현재 규정을 준수해야 합니다. 또한, 생물의학 연구의 표준화된 시험은 유사한 생체 재료 또는 장치에 대한 다양한 연구 결과의 재현성 및 비교 측면에서 상당한 이점을 제공한다9.
ISO(International Organization for Standardization) 지침은 정확하고 재현 가능한 방식으로 재료를 테스트하기 위해 여러 독립적인 상업, 규제 및 학술 실험실에서 널리 사용됩니다. ISO 10993-5는 시험관 내 세포 독성 평가를 의미하며 ISO 10993-12는 샘플링 제제10,11에 보고합니다. 생체 재료 테스트를 위해 재료 유형, 접촉 조직 및 치료 목표에 따라 선택되는 세 가지 범주가 제공됩니다 : 추출물, 직접 접촉 및 간접 접촉 8,11,12,13. 추출물은 세포 배양 배지를 생체 재료로 풍부하게 하여 얻는다. 직접 접촉 시험을 위해, 생체 재료를 세포 배양물 상에 직접 위치시키고, 간접 접촉에서, 세포와의 인큐베이션은 아가로스 겔(11)과 같은 장벽에 의해 분리되어 수행된다. 적절한 통제가 필수적이며 최소 3 개의 독립적 인 실험이 수행되어야합니다 5,8,10,11,14.
세포 독성 가능성을 결정하기 위해 임상 조건을 시뮬레이션하거나 과장하는 것이 중요합니다. 추출물 테스트의 경우 재료의 표면적;  중간 볼륨; 배지 및 물질 pH; 물질 용해도, 삼투압 및 확산 비율; 교반, 온도 및 시간과 같은 추출 조건은 배지 농축제에 영향을 미칩니다5.
이 방법론은 고체 및 액체의 여러 제약 제형의 세포 독성에 대한 정량적 및 정성적 평가를 허용합니다. 중성 적색 흡수 시험, 집락 형성 시험, MTT 검정 및 XTT 검정 5,10,14와 같은 여러 검정을 수행할 수 있습니다.
발표된 대부분의 세포독성 평가 연구는 제한된 정보를 제공하는 MTT 및 XTT와 같은 더 간단한 분석을 사용합니다. 생체적합성 평가는 세포독성의 평가뿐만 아니라 주어진 시험 물질2의 생체활성의 평가를 포함해야 한다. 정당화되고 문서화된 경우 추가 평가 기준을 사용해야 합니다. 따라서 이 프로토콜은 생체 재료 세포 독성 평가를 위한 일련의 방법을 자세히 설명하는 포괄적인 가이드를 제공하는 것을 목표로 합니다. 게다가, 다양한 세포 과정, 즉 세포 사멸의 유형, 세포 형태, 특정 단백질 합성에서의 세포 기능 및 특정 조직 생산에 대한 평가가 설명됩니다.

<table><tbody><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutas 세포 해리 시약</td></tr><tr><td>ALDH 항체</td><td>Santa Cruz 생명공학</td><td>SC166362</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>BCA 분석</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>CD133 항체</td><td>Miteny Biotec</td><td>293C3-APC</td><td>Allophycocyanin (APC)</td></tr><tr><td>CD24 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>658331</td><td>Allophycocyanin-H7 (APC-H7)</td></tr><tr><td>CD44 항체</td><td>Biolegend</td><td>103020</td><td>Pacific Blue (PB)</td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>40 &micro; M</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini</td><td>Roche</td><td>118 361 700 0</td><td></td></tr><tr><td>DAB + Chromogen</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma</td><td>D8900</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>DSP (M-20) 항체, 1: 100</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>LS-C20939</td><td></td></tr><tr><td>ECC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2923</td><td>Human endometrium adenocarcinoma cell</td></tr><tr><td>line 표피 성장 인자</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 0.01 M</td><td>Sigma</td><td>MFCD00006158</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor basic</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain, modified GS-500</td><td>Sigma</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR</td><td>HERE1080339</td><td></td></tr><tr><td>HCC1806</td><td>ATCC</td><td>CRL-2335</td><td>인간 유방 편평 세포 암종 세포주</td></tr><tr><td>인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 용액</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald Stain MG500</td><td>Sigma</td><td>MFCD00131580</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>인간 유방 선암 세포주</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>AlfaAesar</td><td>45490</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JMGS</td><td>37040005002212</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-goat 면역글로불린 / HRP, 1: 100</td><td>Dako</td><td>G-21234</td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>RL95-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1671</td><td>인간 자궁 내막 암 세포주</td></tr><tr><td>나트륨 데 옥시 콜산</td><td>JMS</td><td>EINECS 206-132-7</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이</td>트 <td>시그마</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>기질 버퍼</td><td>Dako</td><td>926605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>JMGS</td><td>20360000BP152112</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck</td><td>108603</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>시그마</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>시그마</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -actin 항체</td><td>Sigma</td><td>A5316</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 재료에 대한 세포 독성 및 세포 반응에 접근

Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials

생체 재료는 인체 조직과 직간접적으로 접촉하므로 세포 독성을 평가하는 것이 중요합니다. 이 평가는 여러 가지 방법으로 수행 할 수 있지만 사용 된 접근법간에 높은 불일치가 존재하여 재현성과 얻은 결과 간의 비교가 손상됩니다. 본 논문에서는 치과용 생체재료에 사용하는 수용성 추출물을 이용하여 생체재료 세포독성을 평가하는 프로토콜을 제안한다. 추출물 준비는 펠렛 생산에서 배양 배지에서의 추출에 이르기까지 자세히 설명되어 있습니다. 생체 재료 세포 독성 평가는 MTT 분석을 사용한 대사 활성, Sulphorhodamine B(SBR) 분석을 사용한 세포 생존율, 유세포 분석에 의한 세포 사멸 프로파일, May-Grünwald Giemsa를 사용한 세포 형태를 기반으로 합니다. 세포독성 평가에 추가하여, 세포 기능을 평가하기 위한 프로토콜은 면역세포화학 및 PCR에 의해 평가된 특정 마커의 발현을 기반으로 설명된다. 이 프로토콜은 추출물 방법론을 사용하여 재현 가능하고 강력한 방식으로 생체 재료 세포 독성 및 세포 효과 평가를 위한 포괄적인 가이드를 제공합니다.

여기서 대표적인 결과는 치과 용 생체 재료 연구를 나타냅니다. 추출물 방법론을 통해 대사 활성(그림 2), 세포 생존율, 세포 사멸 프로필 및 세포 형태(그림 3), 특정 단백질 발현(그림 4)에 대한 영향과 관련하여 치과 재료에 노출한 후 세포 독성 프로필 및 세포 기능을 얻을 수 있습니다.
MTT 분석은 간단한 방법으로 물질의 세포 독성에 대한 빠른 개요를 얻는 데 사용됩니다. 두 개 이상의 재료를 비교할 수 있습니다(그림 2). 낮은 농도 (6.25 %) 및 중간 농도 (50 %)에서도 대사 활성의 심각한 감소는 더 높은 독성을 나타냅니다 (그림 2a). 동시에, 세포 독성 물질이 적을수록 더 가볍거나 전혀 감...

이 방법론은 유세포 분석, RT-PCR, 면역세포화학, 기타 세포 및 분자 생물학 기술을 포함한 생존력 분석 및 표현형 분석을 사용하여 가용성 추출물의 제조를 통해 생체 재료 세포 독성을 평가하는 것을 목표로 합니다.

Biomaterials contact directly or indirectly with the human tissues, making it important to evaluate its cytotoxicity. This evaluation can be performed by ...

의료 응용 분야를 위한 신소재가 폭발적으로 증가함에 따라 초기 스크리닝이 체계적으로 이루어져야 하므로 이 프로토콜은 새로운 생체 재료를 개발하고 특성화하는 것을 목표로 하는 연구자에게 기본 도구가 될 수 있습니다. 이 방법론을 통해 고체 및 액체 모두의 생체 재료 및 제약 제형의 세포 독성 및 생체 활성에 대한 정량적 및 정성적 평가가 가능합니다. 세포 노출 후 몇 가지 보완 분석을 수행할 수 있습니다.생체 재료 세포 독성의 확립은 임상 실습에 적절한 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 이 지식은 임상의가 특정 환자 또는 상태에 가장 적합한 생체 재료를 선택할 수 있도록 권한을 부여할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 치과, 정형외과, 수술, 안과, 심장학 등과 같은 다양한 영역에서 새로운 생체 재료의 특성을 분석할 수 있습니다.상기 평가성능은 세포독성 외에 생체 조직에서의 생체 재료 생리활성에 대한 결론을 내릴 수 있도록 해야 한다. 실험 시작에 최대한 가깝게 주걱을 사용하여 새로 준비된 생체 재료를 PVC 몰드에 넣고 재료를 실온에서 적절한 시간 동안 설정합니다. 재료가 굳으면, 금형에서 펠릿을 제거, 적절한 크기의 용기에 넣습니다.그런 다음 자외선 램프 아래에서 펠릿을 한 면당 20분 동안 살균합니다. 펠릿에서 생체 재료를 추출하려면 멸균된 펠릿을 50밀리리터 튜브에 넣고 적절한 세포 배양 배지를 펠릿에 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 24시간 동안 두십시오.다음날, 신선한 배지를 사용하여 추출물을 적절한 관심 부피로 희석하십시오. 생체 재료 노출에 대한 반응으로 세포 형태를 평가하려면 멸균 핀셋을 사용하여 적절한 크기의 멸균 유리 커버슬립을 멀티웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 적절한 농도로 각 커버슬립에 세포를 추가하고 밤새 인큐베이터에 넣습니다.적절한 부피의 목적하는 추출물 희석액을 각 웰에 첨가하고, 적절한 배양 기간 동안 세포를 세포 배양 배양기로 되돌린다. 배양이 끝나면 각 웰에서 상청액을 흡인하여 커버 슬립이 실온에서 건조되도록합니다. 샘플이 건조되면 실온에서 3 분 동안 충분한 양의 May-Grunwald 용액으로 각 커버 슬립을 덮습니다.염료를 제거한 후, 커버슬립을 적절한 부피의 증류수로 1분 동안 세척한 후, 충분한 부피의 김사 용액에서 15분간 배양한다. 배양이 끝나면 흐르는 물에 커버 슬립을 씻고 광학 현미경으로 세포를 이미지화합니다. 입증된 바와 같이 관심 있는 생체 재료에 노출된 후 단백질 발현 평가에 의해 세포 기능을 평가하기 위해 실온에서 30분 동안 3.7% 파라포름알데히드로 세포를 고정하기 전에 PBS로 세포의 각 웰을 세척합니다.배양이 끝나면 PBS로 세포를 두 번 세척하고 PBS에서 0.5% Triton으로 세포를 15분 동안 투과시킵니다. 투과가 끝나면 PBS에서 0.3% 과산화수소로 과산화효소를 5분 동안 차단한 다음 PBS로 2회 세척합니다. 2차 세척 후 0.5%BSA로 세포를 2회 세척한 후 2%BSA로 비특이적 결합을 45분 동안 차단한다.배양이 끝나면 실온에서 60분 동안 관심 단백질에 대한 1차 항체로 세포를 배양하기 전에 0.5% BSA로 세포를 한 번 세척한 다음 신선한 0.5% BSA로 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 90분 동안 관심있는 적절한 2차 항체와 함께 세포를 배양한 다음, 0.5% BSA에서 1분 동안 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 세포를 적절한 기질 및 발색원 혼합물과 함께 기질 농도 밀리리터당 20마이크로리터의 발색원에서 25분 동안 배양합니다.배양이 끝나면 배양물을 PBS에서 0.5% BSA로 두 번 세척하고 15분 동안 헤마톡실린으로 세포를 대조염색합니다. 대조염색된 세포를 암모니아 리터당 0.037몰로 5분 동안 세척한다. 그런 다음 증류수로 5분 동안 세척하여 과도한 염료를 제거하고 글리세롤을 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 장착합니다.추출물 처리된 세포 배양액 내에서 광물화된 침전물의 형성을 평가하기 위해 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하기 전에 PBS로 각 웰을 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 적절한 양의 알리자린 레드 염색 용액으로 세포를 암흑 속에서 섭씨 37도에서 20 분 동안 염색합니다. 배양이 끝나면 과잉 염료가 완전히 제거될 때까지 PBS로 웰을 세척하고 광학 현미경으로 세포를 이미지화합니다.그 후 추출 용액을 각 웰에 첨가하여 실온에서 교반하면서 40분간 배양하고, 490 나노미터 파장의 분광광도계로 각 웰의 흡광도를 측정하였다. MTT 분석은 대사 활성에 미치는 영향으로 측정할 때 빠르고 간단한 방식으로 물질의 세포 독성에 대한 개요를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 세포 생존율 분석은 또한 세포 독성이 높은 물질이 동일한 농도에서 더 높은 비율의 세포 사멸을 유도하기 때문에 관심 물질의 세포 독성을 평가할 수 있습니다.30% 이상의 감소는 중요한 것으로 간주되며 재료를 낮은 생체 적합성의 위험이 있는 것으로 정의합니다. 또한, 더 많은 세포독성 물질은 세포 생존율의 두드러진 감소 및 후기 세포자멸사 및 괴사 세포 사멸 프로파일을 특징으로 하는 반면, 더 적은 세포독성 물질은 더 적은 세포 사멸 및 더 많은 세포자멸사 및 후기 세포사멸 프로파일을 유도한다. 형태학적 평가는 세포 형태의 변화가 세포사멸 또는 괴사 프로필을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 물질 입자의 존재를 나타낼 수 있기 때문에 세포 생존율 평가를 보완합니다.또한, 단백질 발현에 대한 관심 물질의 효과는 생존력에 대한 효과와 독립적으로 관찰될 수 있다. 예를 들어, 이 분석에서 한 물질은 단백질 발현의 증가를 유도한 반면 다른 물질은 상당한 감소를 촉진했습니다. 두 경우 모두 추출물의 농도가 단백질 발현에 직접적인 영향을 미쳤습니다.추출물 준비에서 적절한 생체 재료 표면 대 중간 부피 비율이 중요합니다. 또한 샘플은 특성을 변경하지 않는 방법을 사용하여 멸균해야 합니다. 기억해야 할 또 다른 세부 사항은 pH를 추출하는 것인데, 이는 조정 없이 등록되어야 합니다.필요한 경우 추가 제어를 수행합니다. 생체 재료 추출물은 화학 및 생화학 연구뿐만 아니라 여러 다른 분자 생물학 기술에 사용할 수 있습니다. 얻어진 결과는 미래의 생체 내 생체 적합성 테스트를위한 기초를 제공합니다.세포 독성 평가는 의료용 물질의 개발에 매우 중요합니다. 따라서 이 프로토콜은 새로운 생체 재료 또는 이미 다른 의료 분야에 존재하는 다른 생체 재료의 새로운 응용 프로그램을 평가하기 위한 체계적이고 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

치과 복합 재료의 생체 적합성 연구의 대부분의 측면은 형광 신호의 정량화와 결합 된 세포 독성 3D CLSM 시간 경과 영상은 시간이 지남에 따라 세포의 운명의 민감한 평가할 수있다. 이 방법을 활용하여 치과 복합 재료의 cytocompatibility을 평가하는 효율적인 도구가 될 수 있습니다.

치과 복합 재료의 Cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

큰 뼈 장애 복구에 대 한 설계 새로운 생체 재료의 수는 지속적으로 뼈 이식 수술과 관련 된 합병증을 극복 하 고 뼈 치유 향상을 목표로 확장 됩니다. 여기, 우리는 뼈 수리에 대 한 생체의 전 임상 생체 적합성 테스트를 위한 종합 전략을 제시.

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

우리는 생분해성 임플란트 재료의 시험관내 세포 적합성을 평가하기 위해 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양의 세 가지 방법을 소개합니다. 이러한 시험관 내 방법은 상이한 생체내 세포-임플란트 상호작용을 모방하고 다양한 생분해성 물질을 연구하는데 적용될 수 있다.

체외에서 생분해성 임플란트 재료를 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법

다음 연구는 실시간 고처리량 스크리닝 기술인 전기 전지-기질 임피던스 감지(ECIS)를 활용하여 선택된 금속-유기 프레임워크의 독성학적 프로파일을 평가합니다.

금속-유기 프레임워크 독성 프로파일의 실시간 평가를 위한 전기 전지-기질 감지

학습하세요 생체 재료의 세포 독성과 생물학적 활성을 정량적·정성적으로 평가하는 방법을. MTT 분석, 형태학적 평가, 면역세포화학을 활용하여 치과, 정형외과, 심장학 등 다양한 임상 분야에서 새로운 생체 재료를 특성화하고 안전성을 검증할 수 있습니다.

생체 재료에 대한 세포 독성 및 세포 반응에 접근

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