Name: 시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 학습하세요 2색 단일 분자 형광 시투 혼성화를 사용하여 Escherichia coli에서 mRNA 전사와 분해 운동학을 정량 분석하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 48개 샘플을 동시에 처리하여 분자생물학 연구의 처리량을 크게 향상시킵니다.

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이 프로토콜은 하워드 휴즈 의학 연구소와 예일 대학의 미생물 과학 연구소에서 크리스틴 제이콥스-바그너 박사의 실험실에서 박사 후 연구 중 S.K.에 의해 개발되었다. 우리는 제이콥스 바그너 박사와 그녀의 실험실 구성원에게 방법 개발 중에 다양한 입력을 하고 원고를 비판적으로 읽어 준 로라 트로이어에게 감사드립니다. S.K.는 Searle 학자 프로그램의 지원을 인정합니다. K.V.는 일리노이 대학교에서 제임스 학자 프리블 연구 상을 수상했다.

<ol><li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms%3A+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li>
<li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li>
<li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li>
<li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184(1995).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128(2009).</li>
<li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li>
<li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li>
<li>Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+you+mean+by+transcription+rate%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248(2019).</li>
<li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li>
<li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li>
<li>So, L. -h, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li>
<li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142(2016).</li>
<li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li>
<li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoo%2C+C+%22Labeling+DNA+%28or+RNA%29+for+single-molecule+FRET%22">Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET</a>. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Standard+Ethanol+Precipitation+of+DNA+in+Microcentrifuge+Tubes%22">Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes</a>. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456(2006).</li>
<li>Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
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<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li>
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<li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoffitt%2C+JR+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+gene+expression+in+live+cells%2C+one+protein+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li>
<li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781(2015).</li>
<li>Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131(2019).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+procedures+using+thermodynamic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li>
<li>Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065(2016).</li>
<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기서, 대장균에서mRNA 운동학을 측정하기 위한 smFISH 프로토콜을 제시했다. 박테리아(23)를위한 이전에 발표된 smFISH 프로토콜에서, 세포는 프로토콜의 끝까지 튜브에 보관되었다, 즉, 그들은 이미징을 위한 준비가 될 때까지. 커버슬립표면(23)에형광 프로브의 최소 비특이적 결합과 같은 많은 이점이 있지만, 타임코스 실험에서 많은 샘플이 있을 때 이러한 프로토콜을 따르기가 어렵다. 첫째, 상대적으로 많은 양의 셀(>1 mL)을 샘플링하고 심지어 고정하기 전에 수확해야 합니다. 둘째, 세포 샘플은 솔루션을 교환하고 혼성화 단계 후에 세척하기 위해 여러 번 원심분리되어야 합니다. 우리의 프로토콜에서, 문화의 작은 볼륨 (&1 mL)은 샘플링 순간에 셀 상태를 신속하게 "동결"하는 데 도움이, 1.5 mL 튜브의 고정 솔루션과 직접 혼합된다. 또한, 세포는 절차 전반에 걸쳐 표면에 부착된 상태를 유지하고, 진공 여과 시스템으로 액체를 흡입하고 다중 채널 파이펫으로 한 번에 용액 방울을 적용하여 다른 솔루션을 신속하게 교환할 수 있습니다. 이러한 차이로 인해 많은 수의 샘플을 한 번에 처리해야 할 때 프로토콜이 매우 유리합니다. 우리의 프로토콜을 사용하여, 12-48 견본은 동시에 취급될 수 있고 전체 FISH 절차는 몇 가지 견본에 필요한 대략 유사한 시간의 대략 8 시간 안에 완료될 수 있습니다(그림 2). 우리는 예를 들면 대장균에 있는 lacZ의 발현을 예로 사용하더라도, 프로토콜은 아래에 설명된 고려사항과 다른 유전자 및 세균성 종에 넓게 적용됩니다.
다른 유전자에 대 한, 고려해 야 할 첫 번째 것은 smFISH 프로브. 하나는 관심있는 mRNA타일 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계할 수 있습니다(도 1A)13. 이 "타일링" 프로브 접근법에서 각 프로브는 ~20베이스 길이이며 5' 또는 3' 종단에 불소로 표시됩니다. 이 전략은 유전 적 조작이 필요하지 하기 때문에 편리합니다. 대안적으로, ~20bp 서열의 탠덤 반복, 게놈 서열에 이소(예를 들어, Caulobacter crescentus14에서 lacO 서열의 배열), 관심 유전자의 번역되지 않은 영역에 삽입될 수 있고 단일 프로브는 mRNA("배열" 접근법)에 라벨을 붙이는 데 사용된다. 그림 1B). 두 경우 모두, 다중 형광은 mRNA를 장식하여 세포 내부에 특이적으로 결합된 단일 프로브로부터 쉽게 분화될 수 있는 증폭형 형광 신호를 제공합니다.
"타일링" 또는 "배열" 접근법을 선택할지 여부는 대상 mRNA가 부족하기 때문에 프로브의 비특이적 결합이 테스트되는 샘플인 음수 제어에 따라 달라집니다. 타일링프로브(도 1A)의경우, 유전자가 전사되지 않은 유전자 또는 조건의 유전자가 없는 돌연변이 균주(예를 들어, lacZ의억압)는 프로브의 비특이적 결합을 테스트하기 위한 부정적인 대조군역할을 할 수 있다. 어레이 기반 smFISH(도1B)의경우 배열이 부족한 야생형 스트레인은 프로브에 대한 바인딩 부위를 포함하지 않기 때문에 음의 제어 역할을 할 수 있다.
최적의 혼성화 조건은 프로브 서열 및 플루오로포레 염료의 선택에 따라 달라질 수 있습니다. 혼성화 온도를 37°C로 유지하고 혼성화 용액에서 다양한 프로브 세트 및 포르마이미드 농도를 테스트하여 lacZ 프로브 세트의 혼성화 조건을 최적화했습니다. 포르마이드의 높은 농도는 비특이적 및 특이적결합(26,,35)을모두 감소시키는 경향이 있다. 하이브리드화 시간과 온도를 동일하게 유지하면서 하이브리드화와 세척 조건을 체계적으로 변경하는 것이 좋습니다. 조건이 더욱 엄격해짐에 따라, 비특이적 및 특정 결합감소(도 6). 특정 바인딩을 추가로 손상시키지 않으면서 비특이적 바인딩이 허용 가능한 임계값 이하로 떨어지기 시작하는 지점을 찾는 것이 중요합니다. 예를 들어, 프로브 없이 얻은 신호 레벨을임계값(도 6)으로사용하였다.
mRNA의 두 개의 별도 영역을 표지하는 2색 smFISH 방법은 긴 유전자로 제한됩니다. 전사 신장속도를 측정하기 위해 lacZ가 길고(3075bp)이고 그 발현이 IPTG에 의해 유도될 수 있다는 사실을 이용했습니다. 유전자가 짧을 때, 2개의 타일링 프로브 세트(5'와 3'끝 근처)를 설계하고 5'대 3'mRNA 부위의 출현 사이의 시간 지연을 해결하는 것은 어렵습니다. 이 경우, 초기 mRNAs를 smFISH에 의해 안정된 상태로 계산하고 피팅매개변수(20)로서전사 신장속도를 가진 분석 모델로 분포를 분석할 수 있다. 또한, 관심 유전자가 유도할 수 없는 경우, 하나는 시간 제로에서 리팜피신으로 세포를 치료하고 5' 및 3'mRNA 하위 영역에서 측두적인 변화를 측정할 수 있다. 5' mRNA 신호의 감소로부터 3' mRNA 신호의 감소로부터의 지연은 이전에31과같이 전사 신장속도를 계산하는 데 사용될 수 있다.
마지막으로 smFISH 프로토콜은 다양하며 다른 라벨링 구성표와 결합할 수 있습니다. 이전에는 mRNA FISH와 DNA FISH14 또는 형광 리포터-연산시스템(20)을 결합하여20DNA 궤적과 함께 DNA 궤적을 시각화했다. 단백질 제품은 mRNA FISH14,,36과함께 면역 형광을 수행함으로써 시각화될 수 있다. 또한 3차원 초해상도 현미경검사법(37)과 결합하여,38,39의모든 3차원에서 mRNA를 시각화할 수 있다.

DNA에서 mRNA 및 단백질에 유전 정보의 흐름은 세포 적합성1에대한 규제가 중요한 가장 기본적인 세포 과정 중 하나입니다. 세포내의 mRNA 수는 두 가지 동적 프로세스, 전사 및 mRNA 저하에 의해 결정됩니다. 그러나, 전사와 mRNA 분해가 단일 세포의 시간과 공간에서 규제되는 방식은 완전히 이해되지 않고 있으며, 이는 주로 생체 내에서 자신의 운동학을 정량적으로 측정하는 실험 적 방법의 부족으로 인해 완전히 이해되지 않습니다.
노던 블롯, RT-PCR, RNA 시퀀싱 및 유전자 발현 마이크로어레이와 같은 세포의 집단으로부터 추출된 총 mRNA에 기초한 방법은 mRNA 수준에서 상대적 차이를 측정할 수 있으며 전사 연신율2,,3,,4,45 또는 mRNA 분해6,,7의비율을 분석하는 데 널리 사용되어 왔다. 그러나, 그들은 세포 당 mRNA의 절대 수를 제공하지 않으며, 따라서, 그들은 전사 개시8의비율을 탐구하기에 적합하지 않습니다. 또한, mRNA는 세포의 집단으로부터 추출되기 때문에, 단일 세포 내의 mRNA의 공간 분포 및 세포 중 mRNA 카피 수의 가변성을 측정할 수 없다.
개별 세포(scRNAseq)에 대한 차세대 RNA 염기서열분석은 게놈 척도9에서세포당 mRNA수를 정량화할 수 있다. 그러나 샘플 준비 및 높은 비용으로 인해 전사 운동학을 측정하기 위해이 기술을 사용하기는 여전히 어렵습니다. 특히, 세균에 대한 scRNAseq의 적용은 낮은 mRNA 풍부10,,11로인해 기술적으로 어려웠다.
시상 혼성화(smFISH)에서의 단일 분자 형광은 형광 표지된 단일 가닥 프로브의 혼성화를 기반으로 하며, 그 서열은 관심있는 12,,13의표적 mRNA에 상보적이다. 서열 특이적 혼성화의 개념은 노던 블롯 또는 RT-PCR에서 사용되는 것과 유사하지만, 하이브리드화는 mRNA의 기본 국산화를 보존하기 위해 고정 된 세포 내의 장소에서 수행됩니다. 단일 mRNA의 신호는 많은 프로브를 사용하여 증폭되고, ~20 뉴클레오티드(nt)의 길이, mRNA의 상이한 부분으로 혼성화(도1A)13. 이 "타일링" 프로브 접근법에서 단일 mRNA를 감지하는 데 필요한 프로브 의 수는 분석할 수 있는 mRNA 의 길이에 대해 하한을 설정합니다. 대안적으로, 관심있는 mRNA는 동덤 락 연산자 서열의 비코딩 어레이에 전사적으로 융합될 수 있고, 이러한 형광라벨lacO 프로브의 다중 사본이 단일 mRNA(도1B)14에혼성화될 수 있다.
smFISH는 세포당 mRNAs수를 정상 상태로 정량화하고(즉, 합성 및 붕괴가 균형을 맞출 때) 세균세포15,,16,,17사이에서 mRNA의 평균 및 가변성을 분석하는 데 사용되어 왔다. 최근에는 대장균18,,19,20에서유전자 발현의 유도 또는 억압 직후, 비정상 상태에서 mRNA 수를 정량화하기 위해 smFISH가 적용되고있다. 절대 mRNA 카피 번호의 일시적인 변화는 전사 개시, 신장 및 종료의 속도뿐만 아니라 mRNA 분해 속도를 계산하는 데 사용되었습니다. 이 응용 프로그램의 경우, 종래의 smFISH 절차는 각각 한 번지점을 나타내는 많은 샘플이 있기 때문에 번거로울 수 있으며, 여러 버퍼 교환 단계 (즉, 원심 분리 및 세척)를 거쳐야합니다. 여기서, 우리는 견본 처리 단계가 극적으로 단순화되는 smFISH 프로토콜을 기술합니다, 이는 세포가 커버슬립의 표면에 부착하고 진공 여과시스템(14,,19)으로액체를 심음함으로써 극적으로 단순화된다. 대장균에서 락즈의 발현을 예로 들며, 전체 워크플로우(도2)는전사의 생체 역학(개시, 신장 및 종단)과 mRNA 분해, mRNA 발현 및 mRNA 국소화의 생체 내 운동학을 산출하는 영상분석(도 3)을포함하는 것으로 입증된다. 우리는 프로토콜이 다양한 박테리아 종에서 다른 mRNA의 생체 역학 및 국소화에서 프로브에 널리 적용 될 것으로 예상.

<table><tbody><tr><td><강>세균 균주</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>대장균 MG1655</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>화학물질, 펩타이드 및 기타</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>34851</td><td>UPLC 완충액 B</td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>피셔 케미컬</td><td>A661-500</td><td>M9 매체 만들기</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>B2518</td><td>프로브 혼성화</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>아크로스 유기물</td><td>349610250</td><td>M9 매체</td></tr><tr><td>카사 미노 산</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>M9 매체</td></tr><tr><td>Cy3B NHS 에스테르</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>PA63101</td><td>FISH 프로브</td></tr><tr><td>Cy5 NHS 에스테르</td><td>GE 헬스케어 라이프 FISH</td><td></td><td>프로브 용 과학 PA15101 형광단</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td>프로브 혼성화</td></tr><tr><td>포도당 피</td><td>셔 화학</td><td>D16</td><td>lacZ</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>형광단</td></tr><tr><td>E. coli tRNA를 용해하기 위해</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>프로브 혼성화</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>DNA 정제, 용해 및 세척 커버슬립에 사용</td></tr><tr><td>FISH 프로브</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Sequences are published in ref#16</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Ladd Research Industries</td><td>20295</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bio</td><td>AB00600</td><td>프로브 혼성화, 사전 혼성화 및 세척</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Americanbio</td><td>AB00751-01000</td><td>M9 매체</td></tr><tr><td>만들기 위해 이소프로필티오-&베타;-갈락토시드 (IPTG)</td><td>인비트로겐</td><td></td><td>15529019 lacZ 유도</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염</td><td>피셔 케미컬</td><td>M65-500</td><td>M9 매체</td></tr><tr><td>만들기 위해 2-니트로페닐 &베타;-D-푸코피라노시드 (ONPF)</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td>sc-216258</td><td>lacZ 억제</td></tr><tr><td>Picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>1300 1000</td><td>실란트</td></tr><tr><td>폴리 -L- 라이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>커버 슬립 표면을 처리하기 위해</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>인산 칼륨 monobasic</td><td>만들기 위해 Fisher BioReagents</td><td>BP362-500</td><td>PBS 및 M9 매체를 만들기 위해</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>전사 개시를 중지하려면</td></tr><tr><td>식염수-구연산나트륨 완충액(SSC)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763</td><td>프로브 혼성화, 사전 혼성화 및 세척</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP328-500</td><td>형광단-프로브 접합</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>DNA 정제용, PBS 및 M9 매체</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>PBS 및 M9 매체</td></tr><tr><td>인산나트륨 단일염기</td>성 <td>Fisher BioReagents</td><td>BP329-500</td><td>인산나트륨 완충액을 만들기 위해</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>Invitrogen</td><td>8899</td><td>커버슬립용 소수성 마커</td></tr><tr><td>TetraSpek 미세구</td><td>Invitrogen</td><td>T7280</td><td>제어 다중 채널 등록</td></tr><tr><td>티아민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>M9 매체를 만들려면</td></tr><tr><td>트리에틸암모늄 아세테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90358</td><td>UPLC 완충액 A</td></tr><tr><td>바나딜 리보뉴클레오시드 복합체(VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94742</td><td>프로브 혼성화 및 사전 혼성화</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 </td><td>column, Waters,</td><td>Acquity, BEH C18, column</td><td></td></tr><tr><td>, 조리대 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr>, <tr><td>조리대 인큐베이터</td>, <td>Eppendorf</td><td>Thermomixer F1.5</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (Oven)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030514</td><td>중력 대류</td></tr><tr><td>정수 시스템</td><td>, Millipore</td><td>Milli-Q Reference</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>빌딩</td><td></td><td>커버슬립 및 유리 슬라이드 블로우 건조용</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC 시스템</td><td></td></tr><tr><td>진공 및 흡입기</td><td>빌딩</td><td></td><td>아스피레이터는 측면 암이 있는 여과 플라스크로 만들어집니다.</td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td>Centrivap; UPLC에서 수집한 샘플을 건조합니다.</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Genie-2 SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>수조 쉐이커</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 3100</td><td>시간 경과 실험에 중요</td></tr><tr><td>수조 초음파 처리기</td><td>VWR</td><td>97043-960</td><td>커버슬립 및 유리 슬라이드 청소</td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>DNA lobind 튜브</td></tr><tr><td>1000-uL 피펫 팁 박스</td><td>Denville Scientific</td><td>P1126</td><td>모든 팁을 사용한 후 빈 상자</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>SPI</td><td>01240-AB</td><td>커버슬립과 유리 슬라이드를 청소하기 위해</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-230</td><td>24x60 No1</td></tr><tr><td>필터링 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P1121,P1122,P1126</td><td>SHARP&reg; 정밀 배리어 팁</td></tr><tr><td>집게</td><td>SPI</td><td>K35a</td><td>깨끗한 커버 슬립 및 유리 슬라이드 처리</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td>Microflex</td><td>MK-296-M</td><td></td></tr><tr><td>멀티 채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td>세척 단계에서 사용</td></tr> <tr><td></td><td>Pipette Gilson</td><td>P1000, P200, P20</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장 탱크</td><td>MTC Bio</td><td>P8025-1S</td><td>세척 단계에서 사용</td></tr> 주<tr><td>사기 필터 (0.22 um)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>타이머</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td> 소프트웨어 및 알고리즘 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013 이상</td><td>https://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>MicrobeTracker 또는 Oufti</td><td></td><td></td><td>https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker</td></tr><tr><td colspan="4">https://oufti.org/</td></tr> <tr><td>Stellaris Probe Designer</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>하마마츠 포토닉스</td><td>Orca-II-ER</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 필터 세트</td><td>Chroma</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 필터 세트</td><td>Chroma</td><td>49006</td><td></td></tr><tr><td>에피 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td>위상차 및 에피 형광용</td></tr><tr><td>형광 여기 소스</td><td>Lumencor</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td></td><td>현미경 설정을 제어하는 소프트웨어</td></tr><tr><td>위상차 100x 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td>Plan Apochromat (NA 1.45)</td><td></td></tr><tr><td>Probe sequence</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lacZ1</td><td></td><td>GTGAATCCGTAATCATGGTC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ2</td><td></td><td>TCACGACGTTGTAAAACGAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ3</td><td></td><td>ATTAAGTTGGGTAACGCCAG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ4</td><td></td><td>TATTACGCCAGCTGGCGAA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ5</td><td></td><td>ATTCAGGCTGCGCAACTGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ6</td><td></td><td>AAACCAGGCAAAGCGCCATT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ7</td><td></td><td>AGTATCGGCCTCAGGAAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ8</td><td></td><td>AACCGTGCATCTGCCAGTTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ9</td><td></td><td>TAGGTCACGTTGGTGTAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ10</td><td></td><td>AATGTGAGCGAGTAACAACC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ11</td><td></td><td>GTAGCCAGCTTTCATCAACA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ12</td><td></td><td>AATAATTCGCGTCTGGCCTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ13</td><td></td><td>AGATGAAACGCCGAGTTAAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ14</td><td></td><td>AATTCAGACGGCAAACGACT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ15</td><td></td><td>TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ16</td><td></td><td>ATCTTCCAGATAACTGCCGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ17</td><td></td><td>AACGAGACGTCACGGAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ18</td><td></td><td>GCTGATTTGTGTAGTCGGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ19</td><td></td><td>TTAAAGCGAGTGGCAACATG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ20</td><td></td><td>AACTGTTACCCGTAGGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ21</td><td></td><td>ATAATTTCACCGCCGAAAGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ22</td><td></td><td>TTTCGACGTTCAGACGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ23</td><td></td><td>ATAGAGATTCGGGATTTCGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ24</td><td></td><td>TTCTGCTTCAATCAGCGTGC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ25</td><td></td><td>ACCATTTTCAATCCGCACCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ26</td><td></td><td>TTAACGCCTCGAATCAGCAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ27</td><td></td><td>ATGCAGAGGATGATGCTCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ28</td><td></td><td>TCTGCTCATCCATGACCTGA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ29</td><td></td><td>TTCATCAGCAGGATATCCTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ30</td><td></td><td>CACGGCGTTAAAGTTGTTCT,</td><td></td></tr><tr><td>lacZ31</td><td></td>, <td>TGGTTCGGATAATGCGAACA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ32</td><td></td>, <td>TTCATCCACCACATACAGGC</td><td></td></tr>, <tr><td>lacZ33</td><td></td>, <td>TGCCGTGGGTTTTTCAATATTG,</td><td></td></tr><tr><td>lacZ34</td><td></td>, <td>ATCGGTCAGACGATTCATTG</td><td></td></tr>, <tr><td>lacZ35</td><td></td>, <td>TGATCACACTCGGGTGATTA</td><td></td></tr>, <tr><td>lacZ36</td><td></td>, <td>ATACAGCGCGTCGTGATTAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ37</td><td></td><td>GATCGACAGATTTGATCCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ38</td><td></td><td>AAATAATATCGGTGGCCGTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ39</td><td></td><td>TTTGATGGACCATTTCGGCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ40</td><td></td><td>TATTCGCAAAGGATCAGCGG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ41</td><td></td><td>AAGACTGTTACCCATCGCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ42</td><td></td><td>TGCCAGTATTTAGCGAAACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ43</td><td></td><td>AAACGGGGATACTGACGAAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ44</td><td></td><td>TAATCAGCGACTGATCCACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ45</td><td></td><td>GGGTTGCCGTTTTCATA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ46</td><td></td><td>TCGGCGTATCGCCAAAATCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ47</td><td></td><td>TTCATACAGAACTGGCGATC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ48</td><td></td><td>TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ49</td><td></td><td>ACGGAACTGGAAAAACTGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ50</td><td></td><td>TATTCGCTGGTCACTTCGAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ51</td><td></td><td>GTTATCGCTATGACGGAACA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ52</td><td></td><td>TTTACCTTGTGGAGCGACAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ53</td><td></td><td>GTTCAGGCAGTTCAATCAAC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ54</td><td></td><td>TTGCACTACGCGTGTA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ55</td><td></td><td>AGCGTCACACTGAGGTTTTC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ56</td><td></td><td>ATTTCGCTGGTGGTCAGATG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ57</td><td></td><td>ACCCAGCTCGATGCAAAAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ58</td><td></td><td>CGGTTAAATTGCCAACGCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ59</td><td></td><td>CTGTGAAAGAAAGCCTGACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ60</td><td></td><td>GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ61</td><td></td><td>TACGCCAATGTCGTTATCCA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ62</td><td></td><td>TAAGGTTTTCCCCTGATGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ63</td><td></td><td>ATCAATCCGGTAGGTTTTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ64</td><td></td><td>GTAATCGCCATTTGACCACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ65</td><td></td><td>AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ66</td><td></td><td>ATGTCTGACAATGGCAGATC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ67</td><td></td><td>ATAATTCAATTCGCGCGTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ68</td><td></td><td>TGATGTTGAACTGGAAGTCG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ69</td><td></td><td>TCAGTTGCTGTTGACTGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ70</td><td></td><td>ATTCAGCCATGTGCCTTCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ71</td><td></td><td>AATCCCCATATGGAAACCGT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ72</td><td></td><td>AGACCAACTGGTAATGGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr></tbody></table>

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mrna 운동학을 프로빙

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광은 개별 세포에서 절대 수의 mRNA수를 계산할 수 있게 한다. 여기서, 우리는 대장균에서 전사 및 mRNA 분해의 비율을 측정하기 위해 smFISH의 응용 프로그램을 설명합니다. smFISH는 고정 된 세포를 기반으로하므로, 우리는 시간 과정 실험 중 여러 시간 지점에서 smFISH를 수행, 즉, 세포가 유전자 발현의 유도 또는 억압에 따라 동기화 된 변화를 겪고있을 때. 매 시점에서, mRNA의 하위 영역은 전사 연신 및 조기 종료를 탐사하는 것으로 관측적으로 구별된다. 이 프로토콜의 결과는 또한 세포 중 mRNA 복사 번호에 있는 mRNA 및 이질성의 세포내 국소화를 분석하는 것을 허용합니다. 이 프로토콜을 사용하면 몇 가지 샘플에 필요한 시간과 같이 많은 샘플(~50)을 8시간 이내에 처리할 수 있습니다. 우리는 세균성 세포에 있는 다른 mRNAs의 전사 그리고 저하 운동학을 공부하기 위하여 이 프로토콜을 적용하는 방법을 토론합니다.

이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH는 mRNA의 서브 셀룰러 위치로 절대 수를 측정하는 것으로 알려져 있습니다. 우리의 두 가지 색상 sMFISH 프로토콜은 전사 및 mRNA 분해의 운동학을 측정하는 추가 기능을 가지고 있습니다. 이 방법을 사용하면 추가 시간이나 노력 없이 많은 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다.예를 들어, 48개의 샘플을 산출하는 4개의 시간 과정 실험은 8시간 안에 이미징을 위해 처리될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 많은 유전자와 세균성 종에 광범위하게 적용됩니다. 실험을 위해 커버 슬립과 유리 슬라이드를 준비합니다.100% 에탄올이 들어 있는 코플린 항아리에 커버 슬립과 슬라이드를 놓고 항아리를 15~20분 동안 수조 초음파 수용체에 놓습니다. 초음파 처리의 끝에서 슬라이드를 세척하고 커버는 70 %에탄올로 항아리를 다시 채우고 초음파 를 반복하기 전에 매우 순수한 물로 3 ~ 4 번 미끄러. 모든 초음파 처리 단계가 완료되면, 질소 가스로 커버 슬립과 슬라이드를 건조.커버 슬립을 빈 1000 마이크로리터 파이펫 팁 박스에 넣고 슬라이드를 깨끗한 슬라이드 상자에 넣습니다. 이어서, 파이펫 팁 박스의 구멍을 따라 소수성 마커를 사용하여 커버 슬립에 원을 그리고 이들 각 우물에 0.1% 폴리 l 리신의 20 마이크로리터 드롭을 적용한다. 타임 코스 실험을 설정하려면 20 밀리리터에서 750 마이크로리터를 기하급수적으로 성장하는 E.coli 문화권에 1.5 밀리리터 배양 튜브를 추가하여 시간 제로로 표시합니다.그리고 즉시 튜브를 반전. 0.2~1밀리머 IPTG로 락 Z 식을 유도하고 타이머를 시작합니다. 타이머를 확인한 후, 방금 입증된 바와 같이 각 연속 실험 시점의 세포 배양을 수집합니다.실험 중 적절한 시점에서, 5밀리몰러 ONPF를 플라스크에 추가하여 락 Z 발현을 억제하고 mRNA 분해를 추적하기 위해 배양을 계속 샘플링한다. 시간 과정 샘플 수집이 끝나면 실온에서 샘플을 15 분 동안 배양한 다음 얼음에 30 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 원심분리의 끝에서 시료는 고정을 제거하고 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거합니다.DEPC PBS의 1 밀리 리터에서 박테리아를 다시 일시 중단하고 세척 당 신선한 DEPC PBS의 1 밀리 리터에 세포를 두 번 더 세척. 마지막 세척 후, 신선한 DEPC PBS의 30 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단. 세포의 투과화를 위해.먼저 에탄올 멸균 유리 커버 전표 중 하나에 개별 소수성 우물에 각 시점의 샘플을 추가합니다. 그리고 세포가 실온에서 10~30분 배양으로 커버 슬립을 부착할 수 있도록 한다. 인큐베이션이 끝나면 각 웰에 70%의 에탄올 15마이크로리터를 추가합니다.4분 후, 우물이 완전히 건조되도록 각 우물에서 에탄올을 흡입합니다. 세척 후 30 마이크로리터의 사전 혼성화 용액을 각 웰에 추가하고 섭씨 37도 오븐에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 사전 혼성화 솔루션을 약 30마이크로리터의 프로브 하이브리드화 솔루션으로 잘 교체하십시오.그리고 37섭씨 오븐에서 2시간 동안 알루미늄 호일로 챔버를 덮습니다. 인큐베이션의 끝에서 멀티 채널 파이펫을 사용하여 세척당 잘 세척용 30 마이크로리터로 우물을 3~5회 헹구는 다중 채널 파이펫을 사용합니다. 마지막 세척 후, 세척 당 신선한 DEPC PBS의 30 마이크로 리터와 함께 우물을 5 번 세척하기 전에 섭씨 37도에서 15 ~ 30 분 동안 세포를 배양.마지막 세척 후, 커버 슬립에서 액체의 모든 을 흡인. 그리고 각 우물에 신선한 DEPC PBS의 네 마이크로 리터를 추가합니다. 집게를 사용하여 커버 슬립을 에탄올 멸균 유리 슬라이드 샘플 측면에 조심스럽게 놓고 실리콘 치과 검을 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하십시오.관심 영역을 찾으려면 위상 대비 영상의 라이브 모드를 선택하고 스테이지 조이스틱을 기동하여 우물 내에서 시야를 변경합니다. 세포 밀도가 최적 영역을 위치하고 위상 대비 세포 이미지가 초점에 있도록 Z 초점을 조정한다. 그런 다음 4초 노출을 가진 C 5 이미지, 2초 노출을 가진 C 3 화상 및 우물당 약 10개의 다른 영역에 대해 0.2초 노출을 가진 위상 대비 이미지를 획득합니다.또는 C5, C3 및 위상 대비 이미지를 연속적으로 획득할 수 있는 NDI 획득. 모든 우물이 이미지화되면 적절한 셀 세분화 도구를 열고 스택을 클릭 취소합니다. 위상 대비 이미지를 로드하고 독립적인 프레임을 선택하고 컴퓨팅 위상 프로파일을 0으로 클릭합니다.셀을 식별하고 윤곽선이 계산되는 세분화 프로세스를 시작합니다. GitHub 폴더에 제공된 매개 변수를 로드하고 모든 프레임을 클릭합니다. 처리의 끝에서 메시를 시각화할 윤곽을 선택합니다.다음으로, 스팟 감지 탭 에서 스택을 확인 취소하고, 메쉬를 확인하고 문지르기를 클릭하여 두 개의 D Gaussian 피팅을 기반으로 스팟 식별 및 정량화를 시작합니다. 형광 이미지가 포함된 폴더와 셀 감지 절차에서 방금 계산된 메시 파일을 선택하고 스팟 감지 결과가 저장되는 파일 이름을 나타냅니다. 그런 다음 GitHub에 제공된 이미지 분석 워크플로를 사용하여 형광 이미지를 분석합니다.이 전체 시야에서는 세포 세분화를 위한 양호한 밀도에서 약 500개의 대장균 세포를 관찰할 수 있다. 상 대비 이미지에서 세포의 형태는 세분화 목적을 위해 살아있는 세포의 형태와 비교할 수 있어야 합니다. 세포가 과다 하게 되면, 그들의 형태는 세분화에 적합하지 않게 됩니다.유도 전에 락 Z mRNA 스팟 강도의 분포는 높은 강도와 반점의 존재로 인해 정상 또는 푸아송 분포와 잘 맞지 않습니다. 락 Z의 발현이 유도되면 5개의 프라임 락 Z mRNA의 신호가 증가하여 3개의 프라임 락 Z mRNA 신호가 증가한다. 락 Z의 발현이 5및 3개의 프라임 락 Z mRNA 신호가 모두 감소되는 경우.전사 신장속도를 얻으려면 5가지 및 3개의 주요 신호의 상승이 선에 적합합니다. mRNA 분해의 속도는 지수 기능을 가진 부패 부위를 피팅하여 얻어진다. 단일 분자 물고기는 단일 세포 기술이기 때문에 전사에서 세포 가변성을 분석할 수도 있다.또한, 5개의 프라임 및 3개의 프라임 락 Z mRNA의 공동국화의 분석은 락 Z 유전자에 RNA 중합효소의 밀도를 정량화할 수 있게 한다. 이 절차 중에 서로 다른 시간 점의 샘플이 동시에 처리됩니다. 샘플이 튜브에 있는 동안 과 커버 슬립에 있는 동안 분리된 상태로 유지하는 것이 중요합니다.이 단일 분자 단일 세포 현미경 기술을 사용 하 여. 연구원은 지금 전사와 mRNA 분해 운동학이 mRNA의 절대 숫자 또는 세포외 위치와 관련되는 방법을 탐구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데...

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

이 프로토콜은 형광을 수행하기위한 실험 절차를...

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

학습하세요 2색 단일 분자 형광 시투 혼성화를 사용하여 Escherichia coli에서 mRNA 전사와 분해 운동학을 정량 분석하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 48개 샘플을 동시에 처리하여 분자생물학 연구의 처리량을 크게 향상시킵니다.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

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