Name: 동결 및 비행 행동을 연구하는 새로운 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 학습하세요 쥐의 동결 및 비행 행동 전환을 연구하는 고전적 조건화 패러다임을 통해 방어 행동 메커니즘을 밝히고 PTSD 및 공황 장애 치료법 개발에 기여하는 방법을 알아보세요.

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이 작품은 루이지애나 리젠트 지원 기금 (LEQSF (LEQSF 2018-21)-RD-A-17)과 국립 보건원의 국립 정신 건강 연구소를 통해 리젠트 위원회에 의해 지원되었다 R01MH122561. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

다음 단계/절차는 툴레인 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 후 제도적 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 마우스 의 준비
<ol><li>3-5 개월 사이 세 남성 및 여성 성인 마우스를 사용 하 여. 본 연구에서는 잭슨 연구소에서 얻은 남성 C57BL/6J 마우스를 사용했지만 평판 좋은 공급업체로부터 마우스 변형을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>실험 전에 적어도 1 주일, 연구 결과 를 통해 12:12 h 빛/어두운 주기에 개별적으로 모든 마우스를 집. 생쥐에게 음식과 물에 대한 광고 리비툼 액세스를 제공합니다.</li>
	<li>라이트 사이클 동안 모든 행동 실험을 수행합니다. 개별 코호트 내에서 하루 중 동시에 모든 세션을 수행합니다. 예를 들어 1일째 에 오전 9시에 실험을 시작하는 경우 실험이 완료될 때까지 해당 시점부터 계속 시작합니다.</li>
</ol>2. 연구 자료 준비
<ol><li>연구 컨텍스트<ol>
<li>실험을 수행하려면 두 가지 컨텍스트를 선택합니다.</li>
		<li>맑은 플렉시글라스(직경 30cm)로 구성된 원통형 챔버를 문맥 A로 사용하고, 매끄러운 플렉시글라스 바닥을 사용한다. 챔버의 높이는 탈출을 방지하기에 충분해야한다 (적어도 30cm 높이).</li>
		<li>Context B의 경우 교대로 전류 발자국을 전달하는 데 사용되는 전기 그리드 바닥이 있는 직사각형 인클로저(25cm x 30cm)를 사용합니다. 이 챔버의 높이는 매우 중요하며 적어도 35cm 높이여야합니다. 또는 투명 한 지붕을 사용 하 여 (이 자료를 통해 비디오를 녹화할 수 있는지 확인). 참고: 쉽게 세척할 수 있는 매끄러운 벽면이 있는 챔버를 사용합니다.</li>
		<li>다른 클리닝 솔루션을 사용하여 컨텍스트를 청소합니다. 예를 들어, 깨끗한 컨텍스트 A와 1% 아세트산 과 컨텍스트 B 와 70% 에탄올. 첫 번째 세션을 시작하기 전에, 개별 마우스 를 테스트하는 것과 그 날의 세션이 완료된 후 컨텍스트를 청소합니다. 이것은 이전 마우스에서 후각 단서를 제거하는 것이 중요합니다. 철저한 청소는 또한 컨디셔닝 세션을 손상시킬 충격 그리드에 소변 스케일링을 방지하는 데 도움이됩니다. 참고: 세척 솔루션은 후각 큐 역할을 하므로 특정 컨텍스트에 동일한 세척 액체를 사용합니다.</li>
		<li>각 학습 세션 동안 컨텍스트 A 또는 컨텍스트 B를 사운드 감쇠 상자에 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오디오 생성기<ol>
<li>75dB에서 청각 자극을 전달하기 위해 컨텍스트 위에 오버헤드 스피커를 마운트합니다.</li>
		<li>프로그래밍 가능한 오디오 생성기를 사용하여 미리 정의된 일정에 청각 자극을 생성합니다. 7.5 kHz 의 순수 톤은 부비동 파형이있는 소리이며 백색 잡음은 1-20,000 Hz에 이르는 다른 주파수에서 동일한 강도를 갖는 임의신호입니다.</li>
		<li>TTL 펄스를 사용하여 청각 자극및 충격 신호를 시간적 정밀도로 전달합니다. 참고: 실험을 시작하기 전에 dB 미터를 사용하여 각 챔버의 장착된 스피커의 사운드 강도 출력을 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쇼커: 충격기를 0.9 mA AC 충격을 전달하는 데 사용되는 전기 그리드 바닥과 연결합니다. 컴퓨터 프로그램의 빈도, 발병 및 충격 지속 시간을 정의합니다. 각 SCS의 끝에 각 충격 자극을 1s의 지속 시간 동안 전달하여 컨디셔닝 세션당 총 5개의 SCS 충격 페어링을 제공합니다.</li>
</ol>3. 컴퓨터 프로그램 준비 및 비디오 추적
<ol><li>소프트웨어 프로그램에서 코딩을 사용하여 동작 프로토콜을 생성합니다.</li>
	<li>프로그램에서 직렬 복합 자극 SCS를 정의합니다. 이 자극은 10 s 순수 한 톤의 연속 프리젠 테이션입니다 (각 핍은 7.5 kHz의 주파수와 1 Hz의 속도로 500 ms에 대해 제시됩니다) 및 10 s 백색 잡음 (1 Hz에서 500 ms 주사위).</li>
	<li>각 시험 에 따라 제시 된 시험 간 간격 (ITI)을 정의, 의사 무작위로.</li>
	<li>연구 하는 동안, 후속 분석을 위해 비디오에 모든 마우스 동작을 기록 합니다. 참고: 상용 공포 컨디셔닝 박스는 상단에 장착된 카메라를 통해 동작을 기록하도록 설정되지 않을 수 있습니다. 녹화된 비디오가 동물이 이동하는 수평 이동, 속도 및 총 거리를 계산하는 데 사용되기 때문에 매우 중요합니다.</li>
	<li>소프트웨어 추적을 설정하기 위해 각 관련 컨텍스트에 테스트 마우스를 배치하고, 윤곽 추적 감도를 조정하고, 무게 중심을 정의합니다. 이렇게 하면 상대 위치에 대한 신뢰할 수 있는 데이터를 수집할 수 있습니다. 또한 피사체에 액세스할 수 있는 전체 컨텍스트 영역을 정의합니다. 참고: 서로 다른 컨텍스트의 밝기 변경으로 등고선 크기가 변경되어 윤곽 크기를 변경하기 때문에 두 컨텍스트모두에 대한 등고선 크기를 조정하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>챔버의 알려진 크기와 속도(cm/s)를 계산하는 데 사용할 수 있는 카메라의 픽셀 치수를 사용하여 교정 계수를 결정합니다.</li>
	<li>데이터 수집 컴퓨터의 타임스탬프 이벤트를 실시간 발생과 동기화합니다.</li>
</ol>4. 행동 실험
<ol><li>컴퓨터, 공포 컨디셔닝 박스 컨트롤러, 충격기, 비디오 및 타임스탬프 녹화 소프트웨어 : 모든 장비를 켭니다. 악기가 적절한 순서로 켜져 있는지 확인합니다.</li>
	<li>톤, 백색 잡음 및 충격 전달을 포함한 모든 기능을 확인하고 데이터 수집을 위한 시스템을 설정합니다.</li>
	<li>저장실에서 컨디셔닝 룸으로 동물을 운반합니다. 적어도 10 분 동안 거기에 적응할 수 있습니다.</li>
	<li>홈 케이지에서 동물을 꺼내 서 부드럽게 각 컨텍스트에 배치 한 다음 즉시 컴퓨터 프로그램을 활성화합니다. 참고: 공포 컨디셔닝 시스템과 데이터 수집(타임스탬프, 마우스 추적 및 비디오 녹화) 소프트웨어의 초기화는 TTL 펄스 매개 활성화를 사용하여 동기화할 수 있습니다.</li>
	<li>사전 컨디셔닝/사전 노출<ol>
<li>1일째에 피사체를 컨텍스트 A(중립 컨텍스트)에 배치합니다. 3분(기준기간)에 대해 챔버에 적응한 다음 총 지속시간 20s(그림1A-1B)의SCS 4시험에 노출되도록 한다.</li>
		<li>90s 평균 의사 무작위 ITI (범위 80-100 s)를 유지합니다. 각 사전 노출 세션의 총 지속 시간은 590s입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공포 컨디셔닝<ol>
<li>2일과 3일에는 피사체를 컨텍스트 B에 넣습니다. 3분 기준 기간에 따라 피사체를 1s, 0.9 mA AC 풋쇼크로 공동 종료하는 SCS의 5개의 페어링을 노출합니다.</li>
		<li>120s 평균 의사 무작위 ITI(범위 90-150 s)를 유지합니다. 각 컨디셔닝 세션은 총 820s(그림1A)에대해 지속됩니다.</li>
		<li>실험의 목표에 따라, 4일째에 대상 마우스를 리콜 테스트(단계 4.7 참조) 또는 멸종을 두려워하기 위해(단계 4.8 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>공포 회수(컨텍스트 의존성 테스트)<ol>
<li>4일째되는 날에는 피사체를 컨텍스트 A에 넣습니다. 3분 기준 기이 가후, 590초 이상 풋쇼크 없이 SCS의 4번의 시험으로 제시한다.</li>
		<li>90s 평균 의사 무작위 ITI (범위 80-100 s)를 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공포 멸종<ol>
<li>4일째되는 날에는 피사체를 컨텍스트 B로 배치합니다. 3분 기준 기간에 따라 1910년 이상 풋쇼크 없이 SCS의 16번의 시험을 제시한다.</li>
		<li>90s 평균 의사 무작위 ITI (범위 60-120 s)를 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물을 홈 케이지로 돌려보내 모든 동물에 대한 절차를 반복하십시오.</li>
</ol>5. 행동의 정량화
<ol><li>실험에 대한 관찰자 블라인드가 자동 동결 검출기 임계값을 사용하여 동결 동작에 대한 녹화된 비디오를 점수로 작성한 다음 픽셀 변경의 프레임별 분석이 수행됩니다. 참고: 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 2개의 카메라 시스템을 사용하여 자동으로 동결을 계산할 수도 있습니다. 관찰자가 동결 동작을 수동으로 득점할 수도 있습니다.</li>
	<li>최소 1s에 대해 호흡에 필요한 운동을 제외하고 동결을 신체 운동의 완전한 중단으로 정의합니다.</li>
	<li>4개의 발이 바닥을 떠날 때 점수가 점프하여 수직 및/또는 수평 이동이 발생합니다.</li>
	<li>표시된 파일을 동결, 점프 및 이벤트 마커로 내보냅니다.</li>
	<li>정의된 기간(예: 각 평가판에 대해 SCS 이전, 톤 및 백색 잡음 의 10s 지속 시간)에서 관련 이벤트(동결 및 점프)를 추출합니다.</li>
	<li>스프레드시트 파일에서 추출된 시작 중지 지속 시간을 사용하여 각 평가판 기간에서 종료 시간부터 시작 시간을 빼서 동결 기간(들)을 계산합니다.</li>
	<li>모든 시험에서 동결 기간을 합산하여 이 데이터 평가판을 낮으로 표현합니다. 참고: 연구의 목적에 따라 학습 세션의 시험/기간에서 비행 또는 동결 행동을 채점하고 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>특정 평가판 기간의 총 점프 수를 합산합니다.</li>
	<li>마우스 의 무게 중심의 프레임 X-Y 축 이동에 의해 프레임에서 마우스 추적 좌표에 의해 생성 된 파일을 추출하고 마우스 (cm / s)의 속도를 계산합니다. 참고: 속도 데이터는 cm/s 또는 픽셀/s 형식으로 표시될 수 있습니다. 해당 테스트 컨텍스트에 대해 비디오에 정의된 인치 또는 cm/픽셀 값을 사용하여 픽셀/s 단위를 cm/s로 변환합니다(섹션 3.6 참조).</li>
	<li>동물의 프레임 이동에 의한 프레임 에 대한 속도 데이터를 추출한 후, 비디오의 프레임 속도(바람직하게는 30프레임/s)에 기초하여, 특정 프레임 번호 브래킷에서 동물의 평균 속도를 계산합니다(시작 및 끝 프레임 번호를 얻기 위해 s에서 시작 및 종료 시간을 30으로 곱함).</li>
	<li>각 SCS의 평균 속도를 10s pre-SCS(기준선, BL)의 평균 속도로 나눈 다음 각 이스케이프 점프(speedCS/speedBL + 점프#)에 대해 1점을 추가하여 비행 점수를 계산합니다. 따라서 비행 점수 1은 SCS 이전 기간의 비행 동작에 변화가 없음을 나타냅니다.</li>
	<li>선택적으로, 사육 및 그루밍과 같은 다른 동작에 대해 수동으로 비디오를 점수 매기기.</li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>통계 분석 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의를 위해 데이터를 분석합니다. 모든 시험의 경우 통계적 유의성의 정의는 P&05입니다.</li>
	<li>샤피로-윌크 정상 테스트(α=0.05)를 사용하여 일반 분포에 대한 데이터를 확인합니다.</li>
	<li>큐의 효과를 테스트하려면 적절한 파라메트릭(페어링 된 t-test) 또는 비 파라메트릭 (Wilcoxon 서명 순위 테스트) 테스트를 사용하여 쌍 방향으로 비교를 수행합니다.</li>
	<li>요인의 2 방향 상호 작용을 평가하기 (큐 X 평가판), 후 Hoc 테스트 다음 2 방향 ANOVA를 수행 (예를 들어, 본페로니의 다중 비교 테스트 / 투키의 테스트).</li>
</ol>

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</ol>

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설명된 사운드 및 충격 매개 변수는 이 프로토콜의 중요한 요소입니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 충격 진폭과 음압 수준을 테스트하는 것이 중요합니다. 공포 컨디셔닝 연구는 일반적으로 70-80 dB 음압 수준과 0.1-1 mA 충격 강도18을사용합니다. 따라서, 설명된 매개변수는 전통적인 공포 컨디셔닝 패러다임의 범위 내에 있다. 이전 CS 전용(footshock 없음) 대조실험에서, 우리는 마우스에서 비행 또는 동결 반응을 관찰하지 않았으며, 설명된15와같이 제시될 때 청각 자극이 역경전이 역경하지 않음을 나타낸다. 80dB 이상의 백색 잡음의 dB 레벨을 증가시켜 선천적 혐오를 유발할 수 있다. 그러나, 75dB에서 제시된 노이즈 자극은마우스(19)에서억제된 행동 활동의 형태로 응을 유도하지 않는다.
SCS를 구성하는 청각 자극을 신중하게 선택해야...

두려움은 즉각적인 위협1,2에대한 진화적으로 보존된 적응 반응입니다. 유기체는 위협에 대한 타고난 방어 반응을 가지고 있지만, 배운 협회는 위험3의자극 예측에 적절한 방어 응답을 유도하는 것이 중요합니다. 방어 반응을 제어하는 뇌 회로의 이장애는 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 공황 장애4,특정 공포증5,6과같은 다중 쇠약해지는 불안 장애와 관련된 적응반응에 기여할 가능성이 높다. 불안 장애에 대 한 미국에서 보급 률은 성인에 대 한 19.1% 그리고 31.9%청소년에 7,8. 이 질병의 부담은 개별의 일상생활에 극단적으로 높고 그들의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칩니다.
지난 수십 년 동안, 파블로비안 공포 컨디셔닝은 공포 관련 학습 및 메모리9,10,11의근본적인 신경 메커니즘에 대한 엄청난 통찰력을 얻기 위한 강력한 모델 시스템으로 사용되었습니다. 파블로비안 공포 컨디셔닝은 조건부 자극(청각 자극과 같은 CS)과 역경무성 자극(미국; 예를 들어, 전기발자국)을결합하는 것을 수반한다. 동결은 표준 파블로비안 컨디셔닝 패러다임에서 호출되고 측정되는 지배적인 행동이므로 탈출/비행 응답과 같은 능동적인 형태의 방어 행동의 신경 제어 메커니즘은 크게 미개척 상태로 유지됩니다. 이전 연구에 따르면 비행과 같은 다양한 형태의 방어 행동이 위협 강도, 근접성 및 컨텍스트13,14에따라 제거됩니다. 뇌가 방어 행동의 다른 유형을 제어하는 방법을 연구하는 것은 크게 공포와 불안 장애에 난독증 신경 과정의 이해에 기여할 수 있습니다.
이러한 중요한 필요성을 해결하기 위해15번을동결하는 것 외에도 비행과 탈출 점프를 유도하는 수정된 파블로비안 컨디셔닝 패러다임을 개발했습니다. 이 패러다임에서, 마우스는 백색 잡음 다음에 순수한 음색으로 구성된 연속 화합물 자극 (SCS)로 조절됩니다. 강한 전기 발자국과 SCS를 페어링의 이틀 후, 마우스는 백색 잡음 동안 톤 구성 요소 및 비행에 대한 응답으로 동결을 나타낸다. 조건부 동결 및 비행 동작 사이의 동작 스위치는 빠르고 일관적입니다. 흥미롭게도, 마우스는 백색 잡음 CS가 이전에 전달된 풋쇼크(컨디셔닝 컨텍스트)와 동일한 컨텍스트로 제시되지만 중립적인 맥락에서는 비행 동작을 나타낸다. 대신, 동결 응답이 중립적 인 맥락에서 지배, 톤에 비해 백색 잡음에 대한 응답으로 동결의 상당히 큰 수준. 이는 방어 반응 강도를 조절하는 컨텍스트의 역할과 전통적인 위협 컨디셔닝 패러다임16,17에서발견되는 공포 관련 학습 및 메모리에 있는 상황별 정보의 규제 역할과 일치합니다. 이 모델을 사용하면 컨텍스트별 방식으로 여러 방어 동작을 직접, 피사체 내에서 비교할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>중립 컨텍스트</td><td></td><td></td><td>플렉시글라스 실린더 30 X 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>공포 조절 상자</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>VFC-008</td><td>25 X 30 X 35cm 치수</td></tr><tr><td>오디오 생성기&nbsp;</td><td>메드 어소시에이츠, Inc.</td><td>ANL-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>쇼커</td><td>메드 어소시에이츠 Inc.</td><td>ENV-414S</td><td>스테인레스 스틸 그리드</td></tr><tr><td>스피커</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>ENV-224AM</td><td>순수한 톤과 백색 소음에 적합&nbsp;</td></tr><tr><td>C57/BL6J 마우스</td><td>잭슨 연구소, 미국</td><td>664</td><td>숙성 3-5</td></tr>개월 <tr><td>Cineplex 소프트웨어(편집기/스튜디오)</td><td>Plexon</td><td>CinePlex Studio v3.8.0</td><td>비디오 추적 및 행동 점수 분석용</td></tr><tr><td>MedPC 소프트웨어 V</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>SOF-736</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Plexon PlexonEditor</td><td></td> GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.<td>에서 점수가 매겨진 동결 데이터를 추출하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>버전 8</td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

동결 및 비행 행동을 연구하는 새로운 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

두려움과 불안 관련 행동은 유기체의 생존에 크게 기여합니다. 그러나, 인식 된 위협에 과장 된 방어 응답다양 한 불안 장애의 특성, 미국에서 정신 질환의 가장 널리 퍼 진 형태. 방어 적 행동에 대한 책임이있는 신경 생물학적 메커니즘을 발견하는 것은 새로운 치료 개입의 개발에 도움이 될 것입니다. 파블로비안 공포 컨디셔닝은 공포 관련 학습과 기억을 연구하는 데 널리 사용되는 실험실 패러다임입니다. 전통적인 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임의 주요 한계는 동결이 모니터링되는 유일한 방어 행동이라는 것입니다. 우리는 최근에 우리가 조건된 동결 및 비행 (또한 탈출이라고도 함) 개별 과목 내에서 행동을 모두 연구 할 수있는 수정 된 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임을 개발했습니다. 이 모델은 고강도 발자국과 조건부 자극과 무조건 자극 사이의 페어링 횟수를 더 많이 사용합니다. 또한, 이 조건부 비행 패러다임은 순수한 톤과 백색 잡음 청각 자극의 연속 프리젠 테이션을 조건부 자극으로 활용합니다. 이 패러다임에서 컨디셔닝에 따라, 마우스는 백색 잡음 도중 톤 자극 및 비행 반응에 응하여 동결 행동을 전시합니다. 이 컨디셔닝 모델은 생존에 필요한 행동 반응 사이의 신속하고 유연한 전환에 대한 연구에 적용 될 수 있습니다.

다이어그램(그림1A)에설명된 바와 같이 세션은 사전 노출(1일)으로 시작하여 공포 컨디셔닝(2일과 3일) 다음 소멸 또는 검색(4일)으로 시작합니다.
사전 노출(1일) 세션에서 SCS의 프리젠테이션은 마우스(그림 2A-2B)에서비행 또는 동결 반응을 유도하지 않았다. 컨디셔닝 중 행동 분석(일2 및 3일)은 SCS의 톤 성분이 SCS이전(그림 2B,2E)에서동결에 비해 현저히 향상된 동결을 것으로 나타났다. 항공편 점수는 세션 전반에 걸쳐 크게 변경되었습니다(1일차부터 3일째, n = 20일; 그림 2A). 마우스는 톤(그림 2C-2D)에비해 백색 잡음 큐에 더 높은 속도와 더 ...

방어 행동 응답은 위협 강도, 근접성 및 노출 컨텍스트에 따라 다행입니다. 이러한 요인에 기초하여, 우리는 개별 과목 내에서 조건된 동결 및 비행 행동 사이의 명확한 전환을 유도하는 고전적인 컨디셔닝 패러다임을 개발했습니다. 이 모델은 불안, 공황 및 외상 후 스트레스 장애와 관련된 병리를 이해하는 데 중요합니다.

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

이 패러다임의 전반적인 목표는 설치류의 복잡한 방어 행동을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜은 방어 적 행동 사이의 전환에 대한 조사를 용이하게하기 때문에 중요하며 위협에 대한 복잡한 적응 반응을 연구하는 데 관심이있는 연구자에게 이상적입니다. 이 프로토콜은 일시적으로 정확한 조건 자극을 사용하여 방어 응답 간의 전환을 유도하여 개별 피사체 내에서 조건된 동결 및 비행 동작을 모두 연구할 수 있습니다.방어 행동의 메커니즘을 밝히기 위해이 모델을 사용하면 PTSD 관련 기능 장애 및 공황 장애에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 새로운 치료법의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 행동 프로토콜을 설정하려면 프로그램에서 SCS를 정의하고, 10초 순수 톤 또는 10초 화이트 노이즈로 전달될 자극을 설정하고, 각 시험 시험을 무작위로 수행하도록 시험 간 간격을 정의한다. 소프트웨어 추적을 설정하려면 각 관련 컨텍스트에 테스트 마우스를 배치하고, 무게 중심을 정의하고, 등고선 크기를 조정합니다.챔버의 크기와 카메라의 픽셀 치수를 사용하여 교정 계수를 결정합니다. 그런 다음 중앙 컴퓨터의 이벤트 마커를 실시간 발생과 동기화하기 위한 TTL 펄스 코드를 생성합니다. 실험을 시작하기 전에 공포 조절 상자 컨트롤러, 충격기 및 비디오 녹화 소프트웨어를 켭니다.75데시벨에서 청각 자극을 전달하기 위해 컨텍스트 위에 오버헤드 스피커를 설치하고 미리 정의된 일정에 청각 자극을 생성하기 위해 프로그래밍 가능한 오디오 생성기를 설정합니다. 톤과 백색 잡음이 기능적임을 확인한 후, 3~5개월 된 남성 또는 암컷 마우스를 컨디셔닝 룸으로 데이터 수집 및 수송 시스템을 설정합니다. 사전 조정 시험을 시작하기 전에, 30 센티미터 직경, 30 센티미터 높은 맑은 원통형 플렉시 글라스 챔버를 클린 1% 아세트산 컨텍스트 A 챔버로 사용할 수 있습니다.사전 컨디셔닝의 경우 컨텍스트 A에 마우스를 배치하고 90초 평균 의사 무작위 시험 간 간격으로 4개의 20초 SCS 트레일에 마우스를 노출하기 전에 3분 동안 적응할 수 있도록 합니다. 10분 동안 의 적응 후, 컨텍스트 A 챔버에 마우스 한 개를 전송하고 즉시 공포 컨디셔닝 시스템 및 데이터 수집 프로그램을 활성화합니다. 공포 조절 실험을 시작하기 전에, 적어도 35센티미터 높이, 25~ 30센티미터 직사각형 인클로저를 70%에탄올이 있는 전기 그리드 바닥으로 청소하여 컨텍스트 B 챔버로 사용한다.그런 다음 쇼커를 Context B 챔버의 전기 그리드 바닥과 연결하고 적절한 컴퓨터 프로그램에서 충격의 주파수, 발병 및 지속 시간을 정의합니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 충격 강도가 충격기와 그리드 바닥에서 올바르게 전달되었는지 확인합니다. 2일과 3일에는 마우스를 컨텍스트 B 챔버에 3분 동안 배치한 후 1초, 0.9 밀리암페어 AC 풋 쇼크 및 120초 평균 인터-트라이얼 간격으로 공동 종료되는 SCS의 5쌍에 동물을 노출시한다.세션이 끝나면 마우스를 홈 케이지에 다시 넣습니다. 실험의 목표에 따라 동물을 리콜 세션으로 4일째에 3분 동안 문맥 A 챔버에 놓고 90초 이상의 평균 의사 무작위 시험 간격으로 발 충격 없이 4개의 SCS 시험으로 동물을 제시하여 동물의 공포 회수 반응을 테스트합니다. 또는, 공포 멸종을 위해 시험하기 위하여는, 4일째에, 1, 910초의 기간 동안 90초 평균 의사 무작위 시험 간격으로 발 충격 없이 SCS의 16의 시험에 동물을 복종하기 전에 3 분 동안 문맥 B 챔버에 마우스를 놓습니다.실험이 끝날 때 마우스의 동작을 정량화하기 위해, 자동 동결 검출기 임계값을 사용하여 동결 동작에 대한 기록된 비디오를 분석 점수에 관측자 블라인드가 있고 픽셀 변경에 대한 프레임별 분석이 뒤따릅니다. 최소 1초 동안 호흡에 필요한 것을 제외하고 동결을 신체 운동의 완전한 중단으로 정의합니다. 네 발이 모두 바닥을 떠날 때 점프점수가 상승하여 수직 및/또는 수평 이동이 발생합니다.전체 세그먼트를 분석한 후 표시된 파일을 동결, 점프 및 이벤트 마커로 내보내고 정의된 관심 기간의 관련 이벤트를 스프레드시트로 추출합니다. 동결 기간을 계산하려면 각 평가판 기간의 종료 시간에서 시작 시간을 뺍니다. 특정 평가판 기간의 총 점프 수를 합산합니다.마우스의 속도를 계산하려면 마우스 의 무게 중심의 프레임 XY 축 이동에서 좌표를 추적합니다. 비행 점수를 계산하려면 각 SCS의 평균 속도를 10초 전 SCS 의 평균 속도로 나누고 각 이스케이프 점프에 대해 1점을 추가합니다. 하나의 비행 점수는 이전 SCS 기간의 비행 동작에 변화가 없음을 나타냅니다.그런 다음 적절한 통계 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 통계적 유의를 위해 데이터를 분석합니다. 사전 노출 세션에서 SCS 프리젠 테이션은 마우스에서 비행 또는 동결 응답을 유도하지 않습니다. 컨디셔닝 중 행동 분석은 SCS의 톤 구성 요소가 SCS 이전 동안 동결에 비해 동결을 크게 향상시키는 것으로 나타났습니다.비행 점수는 세션 전반에 걸쳐 크게 변경되었으며, 마우스는 톤 큐에 비해 더 빠른 속도와 화이트 노이즈 큐로 더 많은 점프를 나타낸다. 마우스는 명확한 방어 행동 전환을 보여 주며, 백색 잡음 중 톤 동안 낮은 비행 점수와 높은 비행 점수를 나타내며, 반대로 동결 응답이 관찰됩니다. 멸종 훈련의 16 시험을 실시 마우스는 톤 큐에 비해 화이트 노이즈 동안 높은 측정 네 시험의 첫 번째 블록 동안 싸움 점수와 함께, 조건부 비행의 급속한 멸종을 보여줍니다.소멸 세션이 끝나면 비행 동작이 더 이상 어느 단서에 의해 유도되지 않습니다. 톤에 동결은 멸종 기간 동안 네 시험의 첫 번째 블록에 대한 화이트 노이즈에 동결보다 훨씬 높다. 16번의 멸종 시판에 걸쳐 톤으로 인한 동결이 감소하고, 백색 노이즈 매개 동결의 증가가 관찰됩니다.리콜 세션에서는 비행 점수가 하나 미만이기 때문에 중립적인 맥락에서 백색 노이즈에 노출되면 항공편이 발생하지 않습니다. 오히려 중립적인 맥락에서 백색 잡음 프레젠테이션은 톤에 의해 유도된 응답보다 높은 동결 응답을 유도합니다. 전체적으로 컨텍스트를 청소하는 것이 중요하며 실험을 시작하기 전에 충격 진폭과 음압 수준을 테스트하는 것이 중요합니다.이 패러다임은 현재 방어 행동의 복잡성을 이해하는 데 관심이있는 그룹에서 사용되며 방어 행동 선택에 대한 이해를 높이기 위해 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

에어컨, 두려움이 멸종라는 억제 과정을 통해 감소하지만, 같은 시간이나 스트레스에 노출의 흐름과 같은 조건에서 표면화 할 수 할 수 있습니다. 우리 프로토콜은 reconsolidation 창 (재 활성화 메모리의 재 저장 단계)에 멸종을 도입하여 두려움 복구를 방지 소설 방법을 제공합니다.

Reconsolidation 창 동안 멸종 교육은 두려움의 복구를 방지

출처: Childs, J. E., et al. 소멸 학습과 관련된 경로에서 가소성을 유도하는 도구로서의 미주 신경 자극. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 동결 행동을 줄이기 위해 쥐 모델에서 미주 신경 자극(VNS) 방법을 보여줍니다. 공포에 걸린 쥐는 소리 재노출 중에 VNS를 받아 동결이 감소하고 치료 잠재력이 드러납니다.

동결 행동을 줄이기 위한 쥐 모델의 미주 신경 자극

이 문서에서는 마우스에서 학습 공포와 메모리를 평가하기 위해 비디오 분석 시스템을 사용하여 상황과 큐 공포 조건화 시험을위한 프로토콜을 제시한다.

마우스에서 비디오 분석 시스템을 사용하여 콘텐츠 및 시작됨 공포 컨디셔닝 테스트

다음 실험에서 우리는 쥐의 추적 공포 조건화위한 프로토콜을 설명합니다. 연상 메모리의이 유형은 중립 자극과 무조건 자극을 분리 트레이스 기간을 포함한다.

생쥐의 공포 컨디셔닝을 추적

이 프로토콜 pentylenetetrazole와 화학 점화 하는 방법에 설명 하 고 간 질의 마우스 모델을 제공 한다. 이 프로토콜은 또한 쥐에 있는 간 질 발작 후 발작 유도 및 병 인 취약점을 조사 하 사용할 수 있습니다.

Pentylenetetrazole 유도 점화 마우스 모델

여기는 외상 후 스트레스 장애, 쥐 및 쥐에서의 전 임상 모델 스트레스 강화 된 공포 (SEFL) 학습 실험을 수행 하는 데 필요한 자세한 방법에 설명 합니다. 모델은 파블로프 두려움 컨디셔닝 및 설치류에서 향상 된 두려움의 색인 어의 측면을 활용 합니다.

스트레스 강화 된 두려움 학습, 외상 후 스트레스 장애의 강력한 설치류 모델

우리는 쥐에 있는 과잉 훈련 그리고 공포 잠양을 생성하는 확장된 공포 조정 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 25톤 쇼크 페어링(즉, 과잉 교육)과 조건부 동결 응답의 비교와 함께 단일 교육 세션을 수반하며, 문맥 및 큐 테스트 중 48h(단기) 및 6주(장기)를 훈련후 수반합니다.

쥐에 대 한 확장 된 공포 컨디셔닝 프로토콜을 사용 하 여 공포 잠복

두려운 맥락에서 비행 행동을 연구하기 위해 수정된 공포 조건화 프로토콜을 도입합니다. 이 프로토콜은 마우스가 공포 조건화에서 신호를 제시하는 동안 일관되게 비행 행동을 보이도록 합니다.

생쥐의 비행 행동을 유도하기 위한 수정된 공포 조건화

관찰적 공포 패러다임은 설치류의 대리 동결을 정서적 공감의 모델로 평가합니다. 이 절차는 관찰자 설치류를 특정 시연자에 노출시켜 혐오스러운 발 충격을 받아 공감적 동결 반응을 이끌어내는 것을 수반합니다. 관찰 공포 분석을 사용함으로써 연구자들은 정서적 공감의 기저에 있는 신경 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

생쥐의 정서적 공감 모델로서의 관찰 두려움

절차는 쥐에서 알코올 추구 행동의 갱신을 설명한다 트리거 알코올 연관된 환경 콘텍스트의 용량을 연구.

절차 흰쥐의 파블로프 에어컨 알코올 추구 행동의 상황에 의한 갱신을 준수합니다

학습하세요 쥐의 동결 및 비행 행동 전환을 연구하는 고전적 조건화 패러다임을 통해 방어 행동 메커니즘을 밝히고 PTSD 및 공황 장애 치료법 개발에 기여하는 방법을 알아보세요.

동결 및 비행 행동을 연구하는 새로운 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임

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