Name: 유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 학습하세요 마우스 신장 거주 CD8+ T 세포 격리 및 유동 세포 분석 방법을. 감염 후 효과 및 기억 T 세포 반응 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 프로토콜입니다.

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이 작품은 NIH 보조금 AI125701 및 AI139721, 암 연구소 클립 프로그램 및 미국 암 학회는 N.Z에 RSG-18-222-01-LIB를 부여하여 지원됩니다. 플로우 세포측정 시설에서 카를라 고레나와 세바스찬 몬타그니노에게 감사드립니다. 플로우 세포측정 공유 자원 시설에서 생성된 데이터는 샌안토니오 텍사스 대학교 건강 과학 센터(UTHSCSA), NIH/NCI 보조금 P30 CA054174-20(UTHSCSA의 임상 및 번역 연구 센터 [CTRC] 및 UL1 TR001120(임상 및 번역 과학 상)에 의해 지원되었습니다.

이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에 설명 된 모든 절차는 IACUC UT 건강 샌 안토니오에 의해 승인되었습니다.
1. P14 T 세포의 채택 전달 C57BL/6 받는 사람 및 LCMV 감염
<ol><li>6-12 주에 P14 마우스를 사용 하십시오. 기증자 P14 TCR 형질전환 마우스의 성별이 C57BL/6 받는 쥐의 성별과 일치해야 하는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 암컷 마우스로 옮겨지는 남성 T 세포와 같은 세포는 12일 경에 순환하는 기증자 T 세포의 면역 매개 거부를 초래할 것이다14.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 마우스 CD8+ T 세포 정화 키트를 사용하여 P14 TCR 형질형 마우스의 비장 및 림프절에서 순진한 CD8+ T 세포를 정화합니다.<ol>
<li>간략하게 비장과 림프절을 해부하고 샘플을 으깨서 단일 세포 현탁액을 생성합니다.</li>
		<li>순진한 T 세포를 농축하려면, 제1 항체 인큐베이션단계(13)에서비오틴 항 CD44 항체를 첨가한다. 참고: 이 단계에서 사용되는 음의 선택 상용 키트에는 두 단계의 인큐베이션(즉, 비오틴 항체 혼합물 인큐베이션 및 스트렙타비딘 자성 비드 인큐베이션)에 대한 두 가지 주요 성분이 포함되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈혈계를 사용하여 세포를 계산하고 200 μL에 1,000 ~10,000개의 정제된 P14 T 세포를 꼬리 정맥을 통해 각 성일치 C57BL/6 수신자에게 주입한다. 참고: 상세한 꼬리 정맥 주입 프로토콜은 2단계에서 설명됩니다.</li>
	<li>다음 날, 모든 C57BL/6 수신자는 복막 경로를 통해 PBS의 200 μL에서 희석된 2 x 105 pfu LCMV 암스트롱을 받습니다.</li>
</ol>2. CD8+ T 셀의 내트라바스큘러 라벨링
참고: 연구 관심사에 따라 감염 후 다른 시간 점을 선택할 수 있습니다. 일 30 포스트 감염의 예 (단계 후 30 단계 1.4) 종종 CD8 T 세포 응답에 대한 초기 메모리 시간 지점으로 간주됩니다.
<ol><li>PBS에서 비오틴 항 CD8α 항체를 15 μg/mL로 희석시다. 각 마우스가 3μg 항체를 포함하는 PBS의 200 μL을 수신하도록 합니다. 참고: 비오틴 안티 CD8 항체는 최종 FACS 염색 패널을 설계하는 것이 더 유연할 수 있도록 여기에 사용됩니다. 형광염표지 항체는 직접 사용될 수 있다. 그러나, FACS 염색 대 정맥 라벨링에 대 한 단일 클론 항체의 다른 클론을 사용 하 여 중요 하다.</li>
	<li>마우스의 꼬리 정맥을 5-10분 동안 오버 헤드 열램프로 가열하여 정맥을 팽창시킵니다. 참고: 동물과과열을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다. 마우스가 움직이지 않으면 열을 줄이거나 열램프를 제거합니다.</li>
	<li>100 U 인슐린 주사기(28G)에 미리 희석된 안티 CD8α 항체 혼합물의 200 μL을 끌어내고 피스톤을 위아래로 이동하여 기포를 제거합니다. 바늘을 구부려 바늘과 주사기 사이에 150° 각도를 만들고, 벨위로, 그래서 바늘은 정맥과 평행할 것입니다.</li>
	<li>적절한 크기의 설치류 억제제로 마우스를 억제하고 70%에탄올로 꼬리를 스프레이하여 정맥을 명확하게 볼 수 있도록 합니다. 참고: 구속 기간은 최소한으로 유지되어야 합니다.</li>
	<li>지배적이지 않은 손의 엄지와 가운데 손가락으로 말단 끝에 꼬리를 잡습니다. 바늘이 삽입될 사이트 아래에 검지 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>주사기를 지배적인 손으로 잡고 바늘을 정맥에 넣고 심장의 방향을 향해 평행하게 삽입합니다. 참고: 올바르게 배치할 때 바늘은 정맥으로 원활하게 이동해야 합니다.</li>
	<li>꼬리 정맥을 통해 200 μL의 항 CD8α 항체를 천천히 주입하십시오. 참고: 꼬리에 바늘 위에 저항 또는 백색 영역이 보이는 경우, 바늘은 정맥 안쪽에 있지 않습니다. 꼬리 끝 부분에 가까운 초기 주입을 시작합니다. 필요한 경우, 후속 주사에 대 한 꼬리의 바닥을 향해 앞으로 이동.</li>
	<li>바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 압축을 부드럽게 적용합니다.</li>
	<li>마우스를 케이지로 되돌리고 3-5분 후에 마우스를 안락사시하십시오. 참고: 마우스는 자궁 경부 탈구 다음에 이소플루란 챔버를 통해 안락사되어야 합니다. CO2 흡입과 같은 다른 방법은 최대 5분이 소요되며 정맥 내 항체 라벨링 시간의 불필요한 변화를 유발할 수 있다.</li>
	<li>가위를 사용하여 신장을 해부하고, 신장 전체를 미세 원심 분리 튜브의 1.5 mL로 옮기고 추가 처리가 될 때까지 샘플을 얼음 위에 둡니다. 참고: 손상되지 않은 전체 신장은 후속 처리 및 소화 전에 몇 시간 동안 얼음에 안전하게 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 신장의 효소 소화
<ol><li>각 마우스에 3mL의 소화용액(RPMI/2% FCS/1 mg/ml 콜라게나아제 B)을 함유한 6개의 웰 플레이트를 준비하여 얼음 위에 보관합니다. 참고: 주식 콜라게나아제 B 용액이 농도가 높은(예: 20x)에서 -20°C 이하로 제조 및 보관할 수 있습니다. 작업 솔루션은 신선하게 준비해야 합니다. 현재 프로토콜에 사용되는 모든 솔루션/버퍼에 대한 레시피에 대한 표 1을 참조하십시오.</li>
	<li>1.5mL 마이크로센심분리기 샘플 튜브에 300 μL의 소화 용액을 추가하고 신장 샘플을 직선 스프링 가위로 다진다. 참고: 신장 조직은 직경이 1.5mm 이하의 크기로 균일한 조각으로 잘라야 합니다. 캡슐화 단계가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>다진 신장 샘플을 소화 용액을 함유한 6개의 웰 플레이트로 이송 참고: 6개의 웰 플레이트는 처리해야 할 샘플이 여러 개 있을 때만 편의를 위해 사용됩니다.</li>
	<li>37°C에서 부드러운 흔들림(약 60rpm)으로 샘플을 45분 동안 배양합니다.</li>
	<li>소화 후, 접시 내부에 직접 3mL 주사기의 플런저 플랜지로 조직을 으깨고 15mL 원문 튜브로 옮김합니다. 참고: 밀도 그라데이션 원심분리가 살아있는 림프구를 정화하기 위해 옆에서 수행되기 때문에 일반적으로 세포 스트레이너를 통한 여과는 이 단계에서 필요하지 않습니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.</li>
	<li>RPMI/10% FCS의 3mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
</ol>4. 소화된 신장에서 림프구를 풍부하게 하기 위한 밀도 그라데이션 원심분리
<ol><li>4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.</li>
	<li>상체를 제거하고 44 % Percoll / RPMI 믹스 (44 % Percoll + 56 % FBS없이 RPMI)의 5 mL로 셀 펠릿을 다시 중단하십시오.</li>
	<li>각 튜브의 바닥에 67% Percoll/PBS(67% Percoll + 33% PBS)의 3mL을 함유한 3mL 파이펫의 끝을 넣고, 무거운 용액(67% Percoll/PBS)이 바닥에 뚜렷한 층을 형성하고 광용액(Percoll/RPMI)이 상승하도록 솔루션을 천천히 방출한다. 함께 칵테일 레이어가 형성됩니다. 참고: 공급업체에서 새로 도착한 밀도 그라데이션 배지의 경우 1/10 부피의 멸균 10x PBS를 병에 넣고 잘 섞고 PBS 균형 밀도 그라데이션 배지를 100% 솔루션으로 고려하십시오.</li>
	<li>가속기와 브레이크 설정을 줄인 실온에서 20분 동안 900 x g로 샘플을 회전시. 참고: 가속기 및 브레이크 설정이 있는 원심분리기의 경우(1-9스케일(최소 1회, 최대 9회)에 가속기용 6개, 브레이크에 4를 사용하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 층을 방해하지 않고 원심분리기에서 튜브를 제거; 참고: 분홍색 색상 RPMI 층과 무색 PBS 층 사이에 명확한 림프구 층이 식별됩니다.</li>
	<li>림프구 층을 만지지 않고 이송 파이펫으로 위쪽 레이어를 제거합니다.</li>
	<li>림프구 층을 새로운 15mL 튜브로 옮기고, 튜브를 PBS/5% FCS로 채우고 튜브를 4-6x 천천히 반전시켜 충분한 혼합을 보장합니다. 참고: 이 단계는 잔류 퍼콜을 씻어내는 것이 중요합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.</li>
	<li>상체를 제거하고 완전한 RPMI 배지의 500 μL로 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 세포는 유동 세포측정 얼룩에 대한 준비가되어 있습니다.</li>
</ol>5. 유동 세포측정물 염색 및 분석
참고: T 림프구에 대한 표준 흐름 세포측정 염색 프로토콜을 따르십시오.
<ol><li>각 FACS 염색에 대해 약 1 x 106 셀을 복용하십시오. 참고: FACS 염색에 U-바닥 96 웰 플레이트를 사용합니다. 그러나 제한된 수의 샘플만 있으면 5mL FACS 튜브도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500 x g의 셀을 회전시. 상부체를 폐기합니다.</li>
	<li>2.4G2 FcR 차단제의 10 μg/mL을 포함하는 FACS 버퍼의 50 μL에서 각 샘플을 재연 (FCR과 추가 된 FACS 항체 사이의 상호 작용을 차단하는 안티 CD16/32 단일 클론 항체). 15분 동안 얼음에 배양합니다.</li>
	<li>추가 원심 분리없이, 최종 염색 부피가 100 μL / 각 샘플되도록 각 샘플에 대한 표면 염색 항체 혼합물의 50 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양. 참고: CD8α+ 내트라바스 CD8+ T 세포를 라벨로 표시하고 모든 CD8 T 세포에 라벨을 붙이는 형광 성 연쇄상 구균(2 μg/mL 또는 제조업체의 권장 사항을 따르십시오)을 포함합니다. 항체 혼합물은 FACS 버퍼에 원하는 양의 관심 있는 항체를 첨가하여 만들어집니다.</li>
	<li>PBS로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 PBS와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상수판을 폐기하십시오.</li>
	<li>희석 된 라이브 / 죽음의 염료의 100 μL / 웰에서 세포를 다시 중단합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양. 참고: 밀도 그라데이션 배지 스핀이 있더라도 효소 소화 단계는 ARTC2.2/P2RX7 신호15로인해 조직 거주자 T 세포에서 중요한 세포 사멸을 유도합니다. 라이브/데스 염료 염색은 고정 하기 전에 적극 권장 합니다. 항-ARTC2 nanobody 세포 격리 유도 세포 죽음을 방지 하기 위해 안락사 전에 마우스로 관리 될 수 있습니다.</li>
	<li>FACS 버퍼로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 FACS 버퍼와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상체를 폐기하십시오.</li>
	<li>100 μL/웰 고정 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 참고: 고정 버퍼는 PBS로 포름알데히드를 2% 포름알데히드의 최종 농도로 희석하여 신선하게 만들어집니다.</li>
	<li>FACS 버퍼로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 FACS 버퍼와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상체를 폐기하십시오.</li>
	<li>250 μL/잘 FACS 버퍼에서 셀을 다시 중단합니다. 플레이트를 밀봉하고 4°C에 보관하고 FACS 분석까지 빛으로부터 보호하십시오. 참고: FACS 분석 전에 70 μM 나일론 메시를 통해 샘플을 필터링하여 FACS 기계를 막을 수 있는 가능한 셀 클러스터를 제거합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cell+subsets%2C+migration+patterns%2C+and+tissue+residence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li>
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<li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Resident+Memory+CD8%28%2B%29+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li>
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</ol>

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조직 특정 면역은 연구의 급속한 확장 영역으로, 축적 증거는 면역 세포, 특히 림프구 인구성인 인간 또는 감염 또는 예방 접종 마우스에 거의 모든 기관에서 식별 될 수 있음을 시사한다. LCMV 마우스 감염 모델은 여러 조직에 걸쳐 TRM 생물학을 포함하는 항원 특이적 T 세포 반응, 이펙터 및 메모리 T 세포 분화를 연구하는 잘 확립된 모델이다. 여기서, 우리는 신장에 있는 CD8+ T 세포를 분석하는 프로토콜을 기술했습니다. 이 프로토콜은 TRM12에초점을 맞춘 출판물에서 크게 조정됩니다. 아마도 높은 수준의 P2RX7 발현 및 효소 소화 유도 세포사멸(15)으로인해, 전류 프로토콜로부터 림프구 수율은 즉각적인 표현성 분석에 가장 적합하다. 그러나, P2RX7 유도세포사멸을억제하는 확립된 프로토콜을 통해, 현재 의정서가 쉽게 변형될 수 있다...

조직-상주 기억(TRM)T 세포는 성인 인간 및 감염된 마우스에서 가장 풍부한 T 세포 집단 중 하나를 나타낸다. TRM 세포는 면역 방어의 첫 번째 라인을 제공하고 다양한 생리학적 및 병리학적과정에 비판적으로관여1,2,3,4,5. 순환 T 세포와 비교하여 TRM 세포는 고유한 전사 프로그램6,7,8을가진 뚜렷한 표면마커를운반한다. TRM 생물학에 대한 지식을 확장하는 것은 T 세포 기반 백신 및 면역 요법의 미래 발달에 필수적인 T 세포 반응을 이해하는 열쇠입니다.
모든 비 림프구 조직에 걸쳐 TRMs의일반적으로 공유 분자 마커 이외에, 축적 증거는 조직 특정 특징이 TRM 생물학9의중앙 구성 요소임을 시사한다. 신장은 감염 후에 TRM 세포를 포함하여 많은 면역 세포를 항구하고 비 점막 조직에서 TRM 세포 생물학을 공부하는 좋은 기회를 제공합니다. 급성 LCMV(림프구성 초뇌염 바이러스) 감염은 관면 경로를 통한 잘 확립된 조직 감염 모델로 마우스에서 항원 특이적 T 세포 반응을 연구한다. 감염은 일반적으로 야생 형 마우스에서 7-10 일 이내에 해결되고 신장10을포함한 다양한 조직에서 많은 수의 LCMV 특이적 메모리 T 세포를 남깁니다. P14 TCR(T 세포 수용체) 형질전환 마우스는 C57BL/6 마우스에서 MHC-I(클래스 I 주요 조직적합성 복합체) 분자 H2-Db에 의해 제시된 LCMV의 면역 지배적 인 에피토프 중 하나를 인식CD8+ T 세포를 운반한다. 쥐에서 친자적으로 표시된 P14 T 세포 입양 전달 및 LCMV 감염을 결합하면 CD8+ 이펙터 및 메모리 T 세포가 TRM 분화 및 항상성을 포함하여 추적됩니다.
장 내 상피 림프구(IEL) 구획 및 침샘과 같은 일부 장벽 조직에서는, 확립된 림프구 절연 절차는 마우스 LCMV모델(11)에서혈액 매개 T 세포 오염을 최소화한 TRM 세포의 높은 비율을 산출한다. 그러나 신장과 같은 비장벽 조직에서 조밀한 혈관 망에는 많은 수의 순환 CD8+ T 세포가 포함되어 있습니다. 성공적인 관류조차도 모든 순환 CD8+ T 세포를 효율적으로 제거할 수 없다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. 이러한 기술적 장애물을 극복하기 위해, 내트라바스 항체 염색은 TRM 실험실(12)에서가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나로 확립되었다. 잠시, 안락사 전에 3-5 분, 3 μg /마우스 안티 CD8 항체 (CD8+ T 세포를 레이블) 정맥으로 전달된다. 그대로 혈관 벽은 시간의 이 짧은 기간 (즉, 3-5 분) 안에 항체의 급속한 확산을 방지하고 단지 내트라바스 내 세포가 표지됩니다. 표준 림프구 절연 프로토콜에 따라, 비대 혈관 세포대 는 유동 세포 세포를 사용하여 쉽게 구별될 수 있다.
여기서, 우리는13일전에 CD45.1+ P14 T 세포 및 LCMV 감염을 받은 C57BL/6 마우스를 사용하여 신장 CD8+ T 세포의 신장CD8+ T 세포의 내트라바스 내 라벨링, 림프구 절연 및 유동 세포 측정 분석을 수행하기 위해 TRM 실험실에서 일반적으로 사용되는 표준 프로토콜을 설명할 것이다. 동일한 프로토콜은 신장에 있는 이펙터 및 메모리 T 세포를 둘 다 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-130</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원추형 튜브</td><td>Corning</td><td>431470</td><td></td></tr><tr><td>3ml 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>37C 인큐베이터</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin a-CD8a 항체(클론 53-6.7)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>송아지 혈청</td><td>GE Healthcare Life 과학</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>Collegenase B</td><td>Millipore Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>일회용 졸업 전사 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 스프링 가위</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS 5692</td><td></td></tr><tr><td>Mojosort Mouse CD8 Na&iuml; ve T 세포 분리 키트</td><td>Biolegend</td><td>480043</td><td></td></tr><tr><td>오버헤드 열 램프</td><td>Amazon</td><td>B00333PZZG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>로커</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GE HEALTHCARE 생명 과학</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>솔리드 황동 마우스 Restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SAI-MBR</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기(냉장고 포함</td>) <td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture 6-well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 cd8+ t 세포의 격리

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

조직-주민 기억 T 세포 (TRM)는면역학 연구의 급속하게 확장 분야입니다. 다양한 비 림프구 조직에서 T 세포를 격리하는 것은 TRMs를 조사하는 주요 단계 중 하나입니다. 다른 장기에 대한 림프구 절연 프로토콜에는 약간의 변화가 있습니다. 신장은 병원체 노출 또는 자가 면역 활성화 후에 특히 수많은 면역 세포 침투를 가진 필수적인 비 림프구 기관입니다. 최근 몇 년 동안, 우리 자신의 여러 실험실은 마우스와 인간 모두에서 다양한 생리 및 병리학 적 설정에서 신장 거주자 CD8+ T 세포를 특성화하기 시작했다. T 림프구의 풍부로 인해 신장은 비 점막 또는 비 장벽 조직에서 TRMs를 연구하는 매력적인 모델 기관을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 전신 바이러스성 감염 다음 마우스 신장에서 CD8+ T 세포를 격리하기 위하여 TRM집중한 실험실에서 일반적으로 이용되는 프로토콜을 설명할 것입니다. 간략하게, C57BL/6 마우스에서 급성 림프구성 초리오메닌염 바이러스(LCMV) 감염 모델을 사용하여, 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하기 위해 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하는 진래성 CD8+ T 세포 라벨링, 밀도 그라데이션 원심을 시연하여 후속 사이클분석을 위한 시료를 준비하고 있다.

여기에 설명된 프로토콜은 플로우차트(그림 1A)로요약되어 있습니다. 30 일째LCMV 감염, 우리는 CD8+ T 세포의 내트라바스큘러 라벨링을 수행했습니다. 5분 후, 동물의 두 신장은 해부되고, 다진 후 콜라게나아제 소화를 당했습니다. 림프구는 Percoll 원심분리를 통해 소화된 시료로부터 더 정제되었고 유동 세포측정에 의해 분석되었다. 도 1B에도시된 바와 같이, 밀도 원심분리-매개 림프구 농축 후에도 최종 제품에서 비 림프구의 상당 부분을 보는 것이 매우 일반적이었다. 그러나, 살아있는 림프구에 게이팅 후, CD8+ T 림프구를 쉽게 식별 할 수 있었다. 우리는 항암 CD8+ T 세포를 구별 할 수 있습니다. CD8+ T 세포에 CD8α 및 CD8β의 높은 상관발식 패턴으로 인해, CD8α-CD8β FACS 프로파일에 대각선 패턴을 나타낼...

바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

CD8+T 세포는 비점막 및 비 림프구 조직의 중요한 예로 다른 조직에서 뚜렷한 특징을 지니고 있습니다. 신장에 거주하는 세포를 직접 특성화하여 T 세포 생물학을 완전히 이해하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 신장 거주자 CD8+T 세포를 연속적인 유동 세포 분석 수용하는 우리의 편리한 방법을 보여줄 것입니다.이 방법은 감염 후 생성 된 이펙터 및 메모리 CD8+T 세포의 연구와 자가 면역 반응에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 절차는 닥터 Chaoyu Ma, 나의 실험실을 위한 연구 과학자에 의해 수행됩니다. PBS에서 밀리리터당 15 마이크로그램으로 비오틴 항체 를 희석하여 각 마우스에 200 마이크로리터를 투여하기에 충분하다는 것을 확인하십시오.주입 하기 전에, 그것을 팽창 하는 5 ~ 10 분 동안 오버 헤드 열 램프와 마우스의 꼬리 정맥을 가열. 28 게이지 인슐린 주사기에 미리 희석 된 항체 믹스의 200 마이크로 리터를 끌어 와서 피스톤을 위아래로 이동하여 기포를 제거합니다. 바늘을 구부려 바늘과 주사기 사이의 150도 각도를 만들고, 바늘이 꼬리 정맥과 평행하도록 구부립니다.설치류 제지로 마우스를 억제하고 70%에탄올로 꼬리를 살포하여 정맥을 선명하게 보이게 합니다. 비 지배적 인 손의 엄지 와 가운데 손가락으로 말단 끝에 꼬리를 잡고, 주사 사이트 아래에 검지 손가락을 배치합니다. 지배적 인 손으로 바늘을 심장의 방향을 향해 병렬로 정맥에 삽입하고 항체의 200 마이크로 리터를 천천히 주입하십시오.바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 주입 부위를 부드럽게 압축합니다. 마우스를 안락사한 후, 가위로 신장을 해부하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기다. 추가 처리될 때까지 샘플을 얼음 위에 둡니다.각 우물에 3밀리리터의 소화용액으로 6웰 플레이트를 준비하고 마우스당 1개의 잘 사용하여 얼음에 보관합니다. 각 샘플 튜브에 300 마이크로리터의 소화용액을 추가하고 신장 샘플을 직선 스프링 가위로 다진다. 다진 신장 샘플을 소화 용액을 사용하여 6웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.샘플을 섭씨 37도에서 45분 동안 부드러운 흔들림으로 배양한 다음, 3밀리리터 주사기의 플런저 플랜지로 조직을 균질화하고 15밀리리터 원옥 튜브로 옮기습니다. 샘플을 500배, 섭씨 4도에서 5분간 회전합니다. 상체를 제거하고 10 %의 FCS로 RPMI의 세 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.5분 동안

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

이 프로토콜은 영양이 풍부한 배지에서 마우스 피부의 효소 분해 후 백혈구를 분리하기 위한 구배 분리를 설명합니다.  이렇게 파생된 세포는 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 조직 해리 기계와 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 조직 소화 프로토콜에 대한 효과적이고 경제적이며 개선된 대안입니다.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

신장 면역 세포를 분리하기 위해 신뢰할 수 있고 효율적인 기술이 다운스트림 응용 프로그램에 필요합니다. 이를 위해서는 소수의 신장 면역 세포에 대한 표면 항체 라벨링이 필요합니다. 여기에서는 이 목표를 달성하는 것처럼 보이는 신장 면역 세포를 분리하는 간결한 방법을 설명합니다.

신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출

이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

학습하세요 마우스 신장 거주 CD8+ T 세포 격리 및 유동 세포 분석 방법을. 감염 후 효과 및 기억 T 세포 반응 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 프로토콜입니다.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8⁺ T 세포의 격리

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