유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리
2020년 6월 27일
바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.
CD8+T 세포는 비점막 및 비 림프구 조직의 중요한 예로 다른 조직에서 뚜렷한 특징을 지니고 있습니다. 신장에 거주하는 세포를 직접 특성화하여 T 세포 생물학을 완전히 이해하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 신장 거주자 CD8+T 세포를 연속적인 유동 세포 분석 수용하는 우리의 편리한 방법을 보여줄 것입니다.
이 방법은 감염 후 생성 된 이펙터 및 메모리 CD8+T 세포의 연구와 자가 면역 반응에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 절차는 닥터 Chaoyu Ma, 나의 실험실을 위한 연구 과학자에 의해 수행됩니다. PBS에서 밀리리터당 15 마이크로그램으로 비오틴 항체 를 희석하여 각 마우스에 200 마이크로리터를 투여하기에 충분하다는 것을 확인하십시오.
주입 하기 전에, 그것을 팽창 하는 5 ~ 10 분 동안 오버 헤드 열 램프와 마우스의 꼬리 정맥을 가열. 28 게이지 인슐린 주사기에 미리 희석 된 항체 믹스의 200 마이크로 리터를 끌어 와서 피스톤을 위아래로 이동하여 기포를 제거합니다. 바늘을 구부려 바늘과 주사기 사이의 150도 각도를 만들고, 바늘이 꼬리 정맥과 평행하도록 구부립니다.
설치류 제지로 마우스를 억제하고 70%에탄올로 꼬리를 살포하여 정맥을 선명하게 보이게 합니다. 비 지배적 인 손의 엄지 와 가운데 손가락으로 말단 끝에 꼬리를 잡고, 주사 사이트 아래에 검지 손가락을 배치합니다. 지배적 인 손으로 바늘을 심장의 방향을 향해 병렬로 정맥에 삽입하고 항체의 200 마이크로 리터를 천천히 주입하십시오.
바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 주입 부위를 부드럽게 압축합니다. 마우스를 안락사한 후, 가위로 신장을 해부하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기다. 추가 처리될 때까지 샘플을 얼음 위에 둡니다.
각 우물에 3밀리리터의 소화용액으로 6웰 플레이트를 준비하고 마우스당 1개의 잘 사용하여 얼음에 보관합니다. 각 샘플 튜브에 300 마이크로리터의 소화용액을 추가하고 신장 샘플을 직선 스프링 가위로 다진다. 다진 신장 샘플을 소화 용액을 사용하여 6웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.
샘플을 섭씨 37도에서 45분 동안 부드러운 흔들림으로 배양한 다음, 3밀리리터 주사기의 플런저 플랜지로 조직을 균질화하고 15밀리리터 원옥 튜브로 옮기습니다. 샘플을 500배, 섭씨 4도에서 5분간 회전합니다. 상체를 제거하고 10 %의 FCS로 RPMI의 세 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
5분 동안 500배, 섭씨 4도에서 시료를 스핀다운한 다음, 상체를 제거하고 44%밀도 그라데이션 배지 및 RPMI 믹스의 5밀리리터로 셀 펠릿을 재놓습니다. 각 튜브의 바닥에 67%밀도 그라데이션 배지 및 PBS의 3밀리리터를 포함하는 3밀리리터 파이펫의 끝을 넣고 무거운 용액이 바닥에 뚜렷한 층을 형성하도록 천천히 용액을 방출한다. 가속기와 브레이크 설정이 줄어 20분 동안 900배 g로 샘플을 돌린 다음 레이어를 방해하지 않고 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다.
림프구 층을 만지지 않고 이송 파이펫으로 상단 층을 제거하고 림프구 층을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮습니다. 튜브를 PBS 및 5%FCS로 채운 다음 튜브를 4~6회 천천히 반전시켜 섞습니다. 5분 동안 500배 G와 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리한 후, 상퍼를 제거하고 500마이크로리터의 완전한 RPMI 배지로 세포 펠릿을 재연한다.
세포는 이제 유동 세포피성 염색을 위한 준비가 되었습니다. 밀도 원심분리-매개 림프구 농축 후에도 최종 제품에서 비 림프구의 상당 부분을 보는 것이 매우 일반적이었습니다. 그러나, 살아있는 림프구에 얻은 후, CD8+T 림프구는 쉽게 식별 하기 쉬웠다.
예상대로, 외반 CD8+T 세포만이 CD69의 강화 조절 및 Ly6C의 하향 조절과 같은 조직 상주 메모리 T 세포 표현형을 효율적으로 획득하였다. 감염된 마우스와는 달리, SPF 시설에 수용된 젊은 순진한 마우스로부터 분리된 CD8+T 세포의 대다수는 CD8 알파 항체로 표지되어 따라서 내트라바스칸 구획에 속했다. 이 기술은 조밀하게 혈관화한 기관에 있는 조직 거주자 면역 세포의 조사를 크게 가속화했습니다.
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개요
본 논문은 유세포 분석을 위해 신장 거주 CD8+ T 세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 이러한 세포를 이해하는 것은 비점막 조직의 T 세포 생물학을 연구하는 데 매우 중요합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 세포 생물학
- 신경과학
배경
- CD8+ T 세포는 다양한 조직에서 뚜렷한 특성을 나타냅니다.
- 신장 거주 T 세포는 면역 반응을 이해하는 데 중요합니다.
- 이들 세포의 특성 분석은 감염 및 자가면역 질환 연구에 도움이 됩니다.
- 설명된 방법은 해당 분야의 연구자들에게 편리합니다.
연구 목적
- 신장 거주 CD8+ T 세포를 분리하기 위함입니다.
- 이들 세포의 유세포 분석을 용이하게 하기 위함입니다.
- 감염 후 T 세포의 거동에 대한 이해를 높이기 위함입니다.
사용된 방법
- PBS 내 biotin anti CD8 alpha 항체의 희석.
- 세포 분리를 위한 마우스 내 항체 투여.
- 분리된 림프구 분석을 위한 유세포 분석.
- Chaoyu Ma 박사에 의한 프로토콜 시연.
주요 결과
- 신장 거주 CD8+ T 세포의 성공적인 분리.
- 유세포 분석을 통해 이들 세포의 뚜렷한 특징을 확인.
- 작용 및 기억 T 세포 반응에 대한 통찰력 제공.
- 자가면역 반응 연구에서의 잠재적 응용 가능성.
결론
- 본 방법은 신장 T 세포를 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.
- 신장 거주 T 세포에 대한 이해는 면역학적 연구에 필수적입니다.
- 이 프로토콜은 향후 T 세포 생물학 연구에 도움이 될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
신장 상주 CD8+ T 세포의 직접적인 분리 및 특성 분석을 통해 비점막 장기에서 조직 특이적 면역 반응을 정밀하게 조사할 수 있습니다. 이러한 역량은 초기 면역학적 타겟의 리스크를 줄이고, 감염 또는 자가면역 활성화 이후의 작동 및 기억 T 세포 역학을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 방법은 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 높이며, 면역 조절 치료제의 포트폴리오 결정에 유용한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 질환 관련 신장 환경에서 조직 상주 T세포 표현형을 직접적으로 평가할 수 있습니다.
- 혈관 내 면역 집단과 상주 면역 집단을 구분하여 메커니즘적 위험 요소를 제거하는 것을 지원합니다.
- 면역 조절 전략을 위한 기능적 표적 검증을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 정량적 유세포 분석에 적합한 고농축 림프구 샘플을 준비합니다.
- 복잡한 조직으로부터의 세포 분리를 표준화하여 분석 재현성을 향상시킵니다.
- 조직 거주 면역 하위 집단에 미치는 화합물의 효과를 신뢰성 있게 평가할 수 있게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 바이오마커 발굴을 위해 면역 세포 프로파일링을 질환 관련 조직 맥락과 연계합니다.
- 발견 단계의 면역 표현형 분석부터 감염 및 자가면역 모델의 전임상 검증까지 연속성을 제공합니다.
- 전임상 면역 조절 연구에서 생물학적 모호성을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 프로토콜은 면역학 발견의 연속 과정에 통합되어, 초기 표적 검증과 후속 전임상 면역 프로파일링을 연결합니다.
- 발견 생물학: 신장 내 조직 상주 T세포의 기능 및 표현형에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 유세포 분석 기반 분석을 위해 재현 가능하고 정량적인 세포군을 제공합니다.
- 분석: 표면 마커(예: CD69, Ly6C) 측정을 통해 조건별 면역 상태를 비교할 수 있게 합니다.
- 중개 연구: 조직 특이적 면역 프로파일링을 바이오마커 정렬과 관련된 질환 모델과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다른 비림프 조직 및 면역 세포 유형에 적용 가능한 표준화된 워크플로우를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 면역 표적 선정 및 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 조직 거주 림프구 분리의 재현성과 표준화를 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 조직 거주 세포를 표적으로 하는 면역학 프로그램의 진행 여부(go/no-go) 결정에 정보를 제공합니다.
- 포트폴리오 영향: 조직 특이적 데이터에 기반하여 면역 조절 자산의 위험 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 동물 핸들링, 조직 절제 및 유세포 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 특수 시약(예: biotin anti-CD8 alpha 항체) 및 밀도 구배 매질의 사용이 필요합니다.
- 일관된 샘플 준비와 데이터 해석을 위해 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 조직별 특성에 맞게 프로토콜을 수정하면 다른 장기에도 적용할 수 있습니다.
- 비림프구 오염 가능성이 있으므로 유세포 분석 시 세심한 게이팅과 분석이 필요합니다.
