Name: 살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 살아있는 Pseudomonas aeruginosa에서 FLIM-FRET을 이용한 단백질 상호작용 분석 방법을. 불균형한 기여체와 수용체 비율에서도 정확한 데이터 분석이 가능하여 세포 내 분자 메커니즘 연구에 필수적인 기술입니다.

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우리는 FLIM 데이터 수집및 FLIM 설정의 기술 유지 보수 및 개발에 대한 그의 귀중한 지원에 대한 박사 루도빅 리커트를 인정합니다. 이 작품은 퐁도 라 레체르체 앙 치미 (https://icfrc.fr/)의 보조금에 의해 지원되었다. VN은 퐁디션 부어 라 레체르체 메디칼 (FRM-SPF201809006906)에 의해 투자된다. YM은 프랑스 인스티투트 대학(IUF)에 감사하며 연구에 전념할 추가 시간을 제공합니다. IJS와 JG는 스트라스부르의 약물 전달 연구소가 재정적 지원을 인정합니다.

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FLIM-FRET는 강도 기반 FRET 이미징에 비해 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 형광 수명은 형광의 본질적인 매개 변수입니다. 결과적으로, 그것은 빛 여기의 강도에 어느 쪽도 형광의 로컬 농도에 의존 하지 않습니다. 형광 수명은 또한 사진 표백에 의해 또한 제대로 영향을 받지 않습니다. 국소 단백질 농도가 세포 극구 구획 또는 지구 전체에 걸쳐 매우 이질적일 수 있는 세포에서 PPI를 입증하는 것은 특히 흥미롭습니다. FLIM-FRET는 단백질 또는 단백질 중 하나의 발현 수준이 낮기 때문에 복합체의 농도가 낮은 모든 상황에서도 흥미롭습니다.
PPI의 맥락에서, 수명 단축에 대한 책임이 있는 FRET 메커니즘과 상호 작용의 본질에 대한 정보는 평균 수명만 고려하면 추론하기 어렵습니다. 실제로, 평균 수명의 단축은 적당한 FRET와 상호 작용하는 종의 높은 비율 때문일 수 있습니다, 또는 수용인과 짧은 거리에서 상호 작용하는 기증자의 낮은 비율에 반대에. 불균형한 스토이치오...

단백질 단백질 상호 작용(PPI)은 세포1에서다양한 주요 공정을 제어한다. PPI의 역할은 단백질 조성, 친화성 기능 및 세포2의위치에 따라 다릅니다. PPI는 다른 기술을 통해 조사 할 수 있습니다3. 예를 들어, 공동 면역 강수량은 PPI를 식별하거나 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 비교적 간단하고 견고하며 저렴한 기술입니다. 그러나 상호 작용하는 단백질이 발현 수준이 낮거나 상호 작용이 특정 환경에서만 일시적이거나 관련이있을 때 PPI를 공부하는 것은 어려울 수 있습니다. P. aeruginosa에서 피버딘 통로의 상이한 효소 사이에서 발생하는 PPI를 연구하는 것은 일반 철 공동 요인 억압자의 억압이 세포4,5,6에서발현될 피버딘 통로의 모든 단백질의 발현을 허용하도록 안심할 것을 요구한다. 통로의 모든 단백질에 대한 이 일반적인 규정은 그들의 상호 작용을 승진시키기 위하여 예상되는 세포에 있는 적시 발현 결과. 크기, 자연, 발현 수준 및 이 대사 경로의 단백질 수의 기간에 있는 다양성은 재구성된 시스템에 있는 연구를 위해 어렵게 만듭니다6. 따라서 그들의 세포 환경에서 PPI를 탐구하는 것은 그들의 네이티브 맥락에서 단백질의 생물학 기능을 더 이해하기 위하여 중요합니다.
형광을 포함하는 몇몇 방법만 살아있는 세포7에서PPI를 탐구하는 것을 허용합니다. 측정할 수 있는 상이한 형광 파라미터 들 사이에서, 형광 수명(즉, 광자를 방출하기 전에 형광이 흥분한 상태로 남아 있는 평균 시간)은 살아있는 세포에서 탐구하는 가장 흥미로운 매개 변수 중 하나일 가능성이 높습니다. 형광의 형광 수명은 환경에 매우 민감하며 FLIM은 따라서 형광주변 주변의 화학적 또는 물리적 정보를 제공할 수있다 8. 여기에는 형광 "기증자"의 짧은 거리에 위치한 형광의 "수용자"가 있는 상황에서 발생할 수 있는 Förster 공명 에너지 전송(FRET)의 존재가 포함됩니다. 에너지 전달은 기증자 형광 수명(그림1A)의현저한 단축을 초래하며, 형광 평생 이미징 현미경 검사법(FLIM)을 살아있는 세포에서 직접 단백질 단백질 상호 작용을 탐구하는 강력한 접근법으로 만듭니다. FLIM은 또한 세포7,8에서상호 작용이 일어나는 위치에 대한 공간 정보를 제공할 수 있다. 이 방법은 상호 작용하는 두 파트너의 형광과 라벨링이 가능한 상황에서 PPI를 조사하는 데 매우 강력합니다.
FRET가 발생하기 위해서는 - 두 형광사이의 거리에 중요한 조건이8,9가필요합니다. 두 형광은 10 nm 이상서로 멀리해서는 안됩니다. 따라서 FLIM-FRET 실험을 설계할 때 주의를 기울여야 하며, 이는 응모의 기증자와 용인이 상호 작용하는 복합체에서 서로 가까이 위치할 수 있는 기회를 갖도록 해야 합니다. 이것은 제약으로 보일 수 있지만, FRET의 거리 의존성은 FRET를 겪고있는 두 개의 라벨 단백질이 물리적으로 상호 작용해야한다는 것을 보장하기 때문에 실제로 진정한 이점입니다(그림 1A). 공동 지역화 실험에서 PPI에 대한 명확한 답변을 얻는 데 어려움 (두 개의 공동 지역화 된 단백질이 반드시 상호 작용하지 않을 수 있음) 따라서 FLIM-FRET를 사용하는 문제가 되지 않습니다.
<img alt="FRET 다이어그램; 형광 분광법; 기증자-수용자; 여기-방출 곡선; 스펙트럼 겹침." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: FLIM-FRET 분석 원리. FLIM-FRET 다차원 이미지의 각 픽셀에는 이 특정 위치에 기록된 형광 붕괴에 대한 정보가 포함되어 있습니다(#counts 채널 t에서 감지된 광자 수). (A)FLIM 이미지의 고전적인 표현은 일반적으로 2D 이미지(왼쪽)를 인코딩한 거짓 색상 수명입니다. 기증자의 평균 형광 수명 감소 - 색상 배율의 변화에 의해 볼 수 있듯이 - FRET의 존재에서 관찰 될 수 있으며이 공간 영역에서 PPI의 존재에 대해 유익하다. (B)FRET가 발생하기 위해서는 기증자 배출 스펙트럼과 수용자 흡수 스펙트럼 사이의 중첩이 필요하다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
FRET에 대한 두 번째 요구 사항은 기증자의 방출 스펙트럼과 수용자의 흡수 스펙트럼이8 (도 1B)과겹쳐야한다는 것입니다. 기증자의 형광 여기는 수락자의 직접적인 형광 여기에 거의 기여하는 파장에 있어야합니다. 형광의 모든 조합이 가능하지 않으며 우리는 또한 FLIM-FRET 해석을 용이하게하기 위해 단일 exponential 형광 부패와 기증자를 우선적으로 사용하는 것이 좋습니다10. 형광 단백질의 몇몇 부부는 대중적인 eGFP-mCherry 부부 를 포함하여 이 요구 사항을 충족합니다(사용 가능한 형광 단백질 FRET 쌍의 팔레트에 대한 검토를 위해12,13참조).
FLIM-FRET는 FLIM 이미지의 모든 픽셀에서 FRET 기증자의 형광 수명 붕괴를 측정할 수있습니다(도 1A). 획득 및 분석에서 서로 다른 형광 수명을 결정하는 두 가지 주요 기술이 있습니다: 주파수 도메인(FD)14 및 시간 도메인(TD). TD FLIM은 보다 광범위하며 게이팅방법(15),줄무늬카메라(16) 또는 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 기술8을포함한 다양한 검출 구성과 결합된 펄스 조명을 사용하여 수행됩니다. FD 및 TD 기술 모두 형광 수명은 직접 측정되지 않지만 측정된 데이터를 분석하여 수명 또는 상호 작용의 존재를 추정해야 합니다. TCSPC 기술의 경우 가장 널리 사용되는 분석은 잔류물의 가중 합계를 최소화하는 최소 정사각형 반복 재응경을 사용하여 단일 또는 다중 지수 함수로 붕괴를 피팅하는 데 의존합니다.
마지막으로, FLIM-FRET는 단일 광자 또는 다광자 여기를 사용하여 모두 수행 할 수 있습니다. 최신 초점 평면에서 자동 형광 및 광 피해를 감소 와 같은 몇 가지 장점이 있습니다. 다광원 여기는 또한 두꺼운 3D 샘플8에서작동하는 경우 더 긴 여기 깊이를 허용한다. 반대로, 단일 광자 여기는 형광 단백질의 2광자 흡수 단면이 제한되기 때문에 일반적으로 더 효율적입니다17.
여기서, 우리는 PPI의 중요한 특징을 드러내는 기술의 질과 견고성을 보여주기 위하여 사본의 높게 다른 수로 표현된 2개의 상호 작용 단백질 (PvdA 및 PvdL)의 특정 경우에 살아있는 P. aeruginosa에 있는 PpI의 FLIM-FRET 측정을 위한 프로토콜을 제안합니다. PvdA 및 PvdL 단백질은 피오버딘 생합성에 관여합니다. PvdA는 L-ornithine N5-oxygenase이며 L-N5-formyl-N5-하이드록소니틴을 L-ornithine에서 합성하여 하이드록실화(PvdA) 및 포름(PvdF)18을합성한다. PvdL은 4개의 모듈로 구성된 비리보소말 펩티드 합성(NRPS) 효소이다. 첫 번째 모듈은 미리스틱 산의 아킬레이션을 촉매합니다. 두 번째 모듈은 L-Glu의 활성화와 그 응축을 myristic-coA로 촉매합니다. 그런 다음, 세 번째 모듈은 D-Tyr에서 isomerizedL-Tyr 아미노산을 응축시합니다. 마지막으로, 네 번째 모듈은 L-Dab(Diaminobutyric acid) 아미노산을 결합하여 액면트리페티드 L-Glu/D-Tyr/L-Dab6을형성한다. 따라서 PvdL은 피버딘 전구체의 3가지 제1 아미노산의 합성을 담당한다. PvdL과 PvdA 단백질의 상호 작용은 PvdI 및 PvdJ와 반대로, L-N5-포르몰닐-N5-하이드록소니틴에 특화된 모듈을 운반하지 않는 PvdL로서 놀랍습니다. 이러한 상호작용은 피버딘 전구체 생합성을 담당하는 모든 효소가 큰 과도 및 동적 다중 효소복합체(19,20)로배열된다는 것을 시사한다.
이 보고서에서 우리는 기본적으로 두 상호 작용 eGFP와 mCherry 라벨 단백질을 표현하는 세균균을 구성하는 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 또한 효율적인 FLIM-FRET 세포 화상 진찰을 위한 견본 준비 그리고 조건을 기술합니다. 마지막으로, 최근 개발된 도구를 포함하여 이미지 분석을 위한 단계별 자습서를 제안하여 복잡한 FLIM-FRET 데이터를 간단하게 해석할 수 있는 고급 시각화 가능성을 제공합니다. 이 보고서를 통해, 우리는 모험뿐만 아니라 대부분의 생물학자들에게 FRET-FLIM이 네이티브 셀룰러 환경에서 PPI에 대한 질문을 직접 해결할 수있는 접근 가능하고 강력한 기술이라고 확신하고 싶습니다.

<table><tbody><tr><td>525/50 nm 대역 통과 필터</td><td>F37-516, AHF, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm 단역 통과 필터</td><td>F75-680, AHF, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>황산 암모늄 (NH4) 2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA 중합 효소 5U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-coupled avalanche photo-diode</td><td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips (두께 번호 1.5, 20&times; 20mm</td><td>니텔 유리</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>고충실도 DNA 중합효소 Phusion 2U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>용해 물질 국물 (LB)</td><td>Millipore</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 (MgSO4 . 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (25&times; 75mm)</td><td>Knitel 유리</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 젤 및 PCR 클린</td>업 <td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 플라스미드</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성(K2HPO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 숙시네이트(디소듐)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPCmage, SPCM 소프트웨어</td><td>Becker & 히클</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 접종 루프</td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 1U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>TCSPC 모듈</td><td>SPC830, Becker & Hickl, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire laser</td><td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 flim-fret 측정.

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

단백질 단백질 상호 작용 (PPI)은 세포에서 다양한 주요 과정을 제어합니다. Förster 공명 에너지 전송 (FRET)와 결합된 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)은 살아있는 세포에 있는 PPI에 관하여 정확한 정보를 제공합니다. FLIM-FRET는 FLIM 이미지의 각 픽셀에서 FRET 기증자의 형광 수명 붕괴를 측정하여 PPI 및 공간 세포 조직에 대한 정량적이고 정확한 정보를 제공합니다. 우리는 PPI의 중요한 특징을 드러내는 기술의 질그리고 견고성을 보여주기 위하여 매우 다른 복사 숫자로 표현된 두 개의 상호 작용 단백질의 특정 경우에 살아있는 슈도모나스 aeruginosa에서 PPI를 감시하기 위하여 신청한 FLIM-FRET 측정을 위한 상세한 프로토콜을 여기에서 제안합니다. 이 프로토콜은 박테리아 돌연변이 구조에서 최종 분석까지 복잡한 FLIM-FRET 데이터의 간단한 해석을 위한 고급 시각화 가능성을 제공하는 PPI 특성화에 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.

상이한 세균균균에 대해 측정된 형광 수명의 경험적 누적 분포 기능(ecdf)은 도 8에도시된다. FRET가 발생하면 ecdfs는 수명이 짧을 수 있는 수명(그림8A,8B)으로이동합니다. 두 단백질의 상호 작용이 두 형광사이의 장거리 결과를 초래할 때 FRET가 발생하지않습니다(도 8C). 이러한 상황은 FLIM의 두 파트너 간의 상호 작용이 없는 것과 구별될 수 없습니다. 따라서 분자 모델이나 복잡한의 알려진 아키텍처에서 염료 간 거리를 예측할 수 없는 경우 상호 작용을 프로브할 기회를 최대화하기 위해 다양한 위치에 단백질을 표시하는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, PvdA(고음발성)와 비리보소말 펩타이드 인더니테타제 PvdL(세포당 몇 개 사본) 사이의 단백질 발현의 큰 차이로 인해 동일한 PvdA/PvdL 복합체는 유사한 F...

우리는 FLIM-FRET 측정을 사용하여 살아있는 슈도모나스 aeruginosa에서 두 개의 고도로 다르게 표현된 단백질 사이 단백질 단백질 상호 작용을 특징짓는 프로토콜을 여기에서 기술합니다. 이 프로토콜에는 박테리아 변형 구조, 박테리아 고정, 이미징 및 이미징 후 데이터 분석 루틴이 포함됩니다.

살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET는 의심하거나 예측된 단백질 단백질 상호 작용을 확인할 수 있게 하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜에서는 불균형 기증자 및 수락자 수량의 특정 한 경우 데이터를 분석하는 방법을 제시합니다. FILM-FRET는 살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용에 대한 정보를 직접 제공할 수 있다.특히 형광 단백질이 내인성 수준에서 발현될 때, 토착 세포 환경에서 개인 단백질 상호 작용을 조사하는 것이 중요합니다. P.aeruginosa성장에 의해 시작, 대장균 TOP10, 그리고 E.coli 도우미 박테리아는 하룻밤 동안 흔들리는 동안 섭씨 30도에서 항생제없이 LB의 5 밀리리터에 각각. 다음 날, 배양의 광학 밀도를 측정하고 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 P.aeruginosa, E.coli TOP10 및 E.coli 도우미의 동일한 양을 혼합합니다.9, 300회 G에서 5분 동안 튜브를 원심분리한 다음, 상류체를 버리고 LB의 50마이크로리터에서 펠릿을 재연합니다. 예열된 LB 한천에 혼합물의 반점을 접시에 넣고 섭씨 37도에서 5시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 멸균 접종 루프로 그 자리를 긁어 내고 LB의 1 밀리리터로 다시 중단하십시오. 플레이트 100 마이크로 리터 포함 LB 천에 밀리 리터 클로람페니콜 당 10 마이크로 그램과 30 밀리 리터 gentamycin 당 마이크로 그램과 E.coli TOP10 및 E.coli 도우미 박테리아를 제거하기 위해 섭씨 37도에서 이틀 배양. 한 식민지를 LB의 1밀리리터로 재차 중단하고 4시간 동안 궤도 흔들림으로 섭씨 37도에서 배양한 다음 9, 300회 G에서 3분 동안 튜브를 원심분리하고 950마이크로리터의 상퍼리터를 폐기합니다.LB의 50 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 자당과 염화 나트륨을 포함하는 LB 화분에 혼합물을 분리합니다. 하룻밤 동안 접시를 섭씨 30도에서 배양하십시오. LB 한천과 LB 한천에 분리된 식민지를 발견하여 겐타마이신 감도를 확인하기 위해 밀리리터 젠타마이신당 15밀리그램을 함유하고 있습니다.평평한 수평 표면에 현미경 유리 슬라이드를 놓고 두 개의 유리 슬라이드를 주위에 접착제 테이프로 얹어 놓습니다. 1%의 녹은 아가로즈 70개의 마이크로리터 액적 인 파이펫은 유리 슬라이드에 네 번째 슬라이드를 놓고 아가로즈 방울을 평평하게합니다. 약 1분 동안 부드럽게 누릅니다.상부 슬라이드를 벗고 아가로즈 패드의 다른 위치에서 3~4개의 지점에서 약 3개의 마이크로리터의 박테리아를 떨어뜨립니다. 아가로즈 패드를 현미경 유리 커버슬립으로 덮고 녹인 파라핀으로 고정하여 네 개의 모서리로 시작하는 유리 슬라이드에 밀봉합니다. 목표에 직면 커버 슬립과 함께 무대에 현미경 슬라이드를 배치합니다.필터 큐브 포탑을 돌려 eGFP 큐브를 선택하고 형광 램프 셔터를 열고 현미경의 안면쪽으로 형광광을 보냅니다. 현미경 손잡이를 사용하여 박테리아에 목표를 집중하십시오. 전동 스테이지를 제어하는 조이스틱을 사용하여 샘플에 관심 영역을 선택합니다.형광 방출 경로를 검출기로 다시 보낸 다음 필터 큐브 포탑을 돌려 930 나노미터 레이저용 디크로이크 큐브를 선택하고 레이저 전력을 20 밀리와트로 설정합니다. 관심 영역의 크기를 갈보 거울을 작동하는 전압을 조정하고 움직임 범위를 정의하는 30 마이크로미터로 설정합니다. 검출기를 켜고 샘플 스캔을 시작합니다.컴퓨터 인터페이스에서 스테이지를 미세하게 이동하여 이미징을 위한 시야를 선택합니다. 이는 이미지의 새로운 중심을 정의하고 이동 단계를 누르는 현미경 제어 소프트웨어에서 이미지의 십자가를 이동하여 설정에서 수행 할 수 있습니다. 취득을 위한 보기의 좋은 필드는 10 에서 30 모든 초점에 있는 움직이지 않는 박테리아를 포함해야 합니다.단일 세포 FILM-FRET 데이터를 추출하는 데 관심이 있다면 박테리아가 잘 개별화되었는지 확인하십시오. 이미징 소프트웨어를 열고 광자 수비율이 너무 높지 않아 평생 측정에 영향을 줄 수 있는 더미 효과를 피하십시오. 필요한 경우 레이저 강도를 낮추어 광자 수 속도를 낮춥시게 합니다.수집 시간을 포함하여 획득 매개 변수를 조정합니다. 시작 버튼을 누르고 획득이 완료될 때까지 기다립니다. 데이터를 분석하려면 RStudio를 열고 새 프로젝트를 만듭니다.메인 프로젝트 폴더에 새 폴더를 만들고 데이터 이름을 지정한 다음 모든 분석 요청 파일을 이 폴더로 이동합니다. 새 스크립트 파일 또는 보충 스크립트 flim_analysis.r을 엽니다. 필름 데이터 분석을 위해 전용 FlimDiagRam 패키지를 설치하고 작업 공간에서 패키지를 호출합니다.상이한 세균균에 대해 측정된 형광 수명의 경험적 누적 분포 기능은 여기에 도시된다. FRET가 발생하면 함수가 수명이 짧아지며 이동합니다. FRET는 두 단백질의 상호 작용이 상호 작용의 부재와 구별 될 수없는 두 플루로포사이의 긴 거리를 초래 할 때 발생할 수 없다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.따라서, 상호 작용을 탐구의 기회를 최대화하기 위하여 다른 위치에 단백질을 표지하는 것이 필요할 지도 모릅니다. PvdA와 PvdL 사이의 단백질 발현의 큰 차이로 인해 동일한 복합체가 유사한 FILM-FRET 데이터를 초래하지 않습니다. 불균형한 스토이치오메트리는 기록된 형광 수명 분포에서 결합된 기증자 표지 단백질과 비교하여 자유의 기여도의 차이로 이어집니다.다이어그램 플롯을 사용하여 스토이치오메트리에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. PvdA-eGFP mCherry-PvdL 돌연변이체에서는 기증자 라벨이 부착된 PvdA의 양이 mCherry-PvdL의 양보다 훨씬 높습니다. 샘플에 존재하는 모든 기증자 들 사이에서, 그들 중 몇몇만이 PvdL과 상호 작용하고 있습니다.약 2.3 나노초를 중심으로 한 단일 타우 1값은 각 PvdA-eGFP 기증자가 하나의 mCherry-PvdL 수락자로만 전송할 수 있음을 시사합니다. 라벨링이 반전되면 대부분의 eGFP-PvdL 단백질은 더 높은 알파 1값에 의해 확인된 PvdA-mCherry와 상호 작용할 것으로 예상됩니다. 타우 1값은 다중 PvdA 단백질이 단일 PvdL 단백질에 결합될 수 있음을 시사하는 더 분산되었다.FLIM 설치는 점점 더 많은 이미징 시설에서 사용할 수 있게 되고 있습니다. FILM-FRET의 이미징 샘플은 비디오 현미경 검사에서 이미징보다 더 복잡하지 않습니다.

flim-fret-measurements-protein-protein-interactions-live

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

이 비디오는 형광 단백질, 공여자 eGFP 및 수용체 mCherry로 표지된 세포질 단백질을 발현하는 살아있는 박테리아에서 단백질-단백질 상호 작용을 결정하기 위한 FLIM-FRET 이미징 기술에 대해 설명합니다. 결합된 기술은 또한 상호 작용하는 단백질의 정량화를 허용합니다.

살아있는 박테리아의 단백질-단백질 상호 작용 특성화를 위한 FLIM-FRET 이미징

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FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

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생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

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살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정.

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