단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

당사의 프로토콜은 단일 입자 검사 분석을 사용하여 위치와 방향의 역학을 모니터링하고 세포막에 황금 나노로드가 확산되는 특성화합니다. 이 방법을 이용하여, 황금 나노로드의 번역 및 회전 역학을 모두 얻을 수 있고 역학을 종합적으로 분석하고 제시할 수 있다. 이 프로토콜은 복잡한 생물학적 시스템의 다른 유형의 연구에 사용될 가능성이 있다.

먼저 화염에 에탄올 담근 유리 커버슬립을 태우고 페놀 레드 없이 세포 배양 배지 2밀리리터를 함유한 35~10mm 세포 배양 접시에 커버슬립을 넣는 것으로 시작한다. 커버슬립에 관심 있는 셀 서스펜션 50마이크로리터를 넣고, 접시를 앞뒤로 그리고 좌우로 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. CTAB 코팅 금 나노로드 20 마이크로리터를 첨가하기 전에 세포가 20~40%에 도달할 때까지 약 12시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다.

부드러운 흔들림으로 나노로드를 접시 전체에 고르게 분산시키고 5분간 가습된 분위기에 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 천천히 유리 슬라이드의 홈으로 접시에서 100 마이크로 리터를 전송하고 조심스럽게 슬라이드 홈에 커버 슬립 셀 측면을 배치 한 다음 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 암필드 현미경 단계에 슬라이드를 배치하기 전에 매니큐어 건조하자. 암필드 현미경 검사법에 의한 단일 입자 추적의 경우, 오일 한 방울을 암필드 응축기에 넣고 응축기가 유리 슬라이드에 닿을 때까지 노브를 돌립니다.

60X 오일 침지 목표가 오일에 닿을 때까지 오일 한 방울을 커버 글래스 상단에 놓고 초점 손잡이를 켭니다. 광원을 켜고 초점 손잡이를 약간 돌려 이미징 평면에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 카메라 아이콘을 클릭하여 CMOS 카메라를 사용하여 샘플 산란 광 화상 타임 시리즈를 기록하고 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.

단일 장기 궤적을 추출하려면 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지, 유형 및 8비트를 클릭하여 RGB 모드에서 8비트 모드로 이미지를 변환합니다. 대비를 조정하려면 이미지를 클릭하고 조정하고 밝기 대비를 설정하고 매개 변수를 설정합니다. 대상 파티클을 선택하고 컨트롤 X를 사용하여 타임시리즈 배경을 차단합니다.

플러그인, 파티클 트래커 클래식 및 파티클 트래커를 클릭하여 파티클 감지 및 파티클 연결 창을 열고 반경을 6으로 설정하고, 차단을 0으로 설정하고, 백분위수는 링크 범위를 10으로 설정하고 변위를 10으로 설정하고 확인을 클릭하여 결과를 볼 수 있습니다. 생성된 궤적을 검사하려면 모든 궤적을 시각화합니다. 소프트웨어가 생성된 궤적과 금 나노로드의 이동 궤적이 일치하는 경우 전체 보고서를 저장하여 결과를 저장합니다.

소프트웨어 생성 궤적이 금 나노로드의 이동 궤적과 일치하지 않는 경우 파티클을 다시 클릭하여 감지된 입자를 서로 다른 링크 범위 및 백분위수 매개 변수로 다시 연결합니다. XY 좌표에 따라 각 프레임에서 금 나노로드의 중앙 픽셀 좌표를 찾으려면 xycoordination를 사용하십시오. m 기능.

3x 3픽셀 행렬을 제한하려면 빨간색 또는 녹색 채널의 9개의 산란 강도 값을 추출하고 평균 값을 계산하려면 rg추출을 사용합니다. m 기능. 그런 다음 극지각을 사용합니다.

m 함수는 이중 채널 차동 방법을 사용하여 극지 각도를 계산합니다. 테이블의 수식을 사용하여 동적 매개 변수를 계산하려면 두 분석 스크립트를 실행합니다. 궤적을 시각적으로 분석하려면 X 좌표를 X로 설정하고 Y 좌표를 Y로 조정한 다음 플롯, 산란 및 색상 맵을 클릭하고 그래프 매개 변수를 설정하고 색상 막대를 추가합니다.

평균 정사각형 변위 시간 간격 수치를 생성하려면 시간 간격을 Y.Click 플롯, 분산, 분석, 피팅, 비선형 곡선 피팅 및 열린 대화로 X 및 평균 제곱 변위로 설정하고 그래프 매개 변수를 설정합니다. 다중 입자 통계 해석의 경우 관심 있는 동적 매개 변수를 Y로 설정하고 플롯및 히스토그램을 클릭합니다. 히스토그램을 두 번 클릭하여 분할 크기 또는 분할 수를 설정하고 적용을 클릭합니다.

그런 다음 열을 추가하고 그래프 매개 변수를 설정합니다. 타임시리즈 해석의 경우 시간을 X 및 타임시리즈 매개변수로 설정하여 Y.Click 플롯, 멀티창 및 스택으로 설정합니다. 팝업 창에서 줄을 선택하고 확인합니다. 그런 다음 그래프의 매개 변수를 설정합니다.

경도 플라스모닉 최대 40 x 85 나노미터 CTAB 코팅 금 나노로드는 약 650 나노미터이고 횡단 공명은 520 나노미터이다. U87 세포막에 CTAB 코팅 금 나노로드의 산란 강도는 이 실험에서 추적된 CTAB 코팅 금 나노로드가 잘 단분산되었음을 나타내는 유리에 CTAB 코팅 금 나노로드의 폭이 좁은 전형적인 가우시안 분포를 나타낸다. 그림과 같이, 500개 이상의 CTAB 코팅금 나노로드 궤적을 암장 현미경검사에 의해 추적할 수 있으며 장거리 확산 궤적 및 제한된 확산 궤적으로 나눌 수 있다.

본 대표적인 분석에서 모든 500개의 궤적의 경화 반경은 0.5 마이크로미터의 평균 반경과 최대 변위가 작은 값으로 더 분포된 작은 값 분포를 보였다. 이 앙상블 시간 평균 평균 제곱 변위 분석에서 입증된 바와 같이, CTAB 코팅 금 나노로드는 일반적으로 약 하나의 알파로 확산된다. 그러나 모든 궤적으로부터 얻은 확산 계수와 알파의 밀도 분포는 금 나노로드의 역학이 초대형, 브라우니아 및 해류 모션을 통해 이질분포를 나타낸다는 것을 보여준다.

또한 단일 입자 통계 분석 및 시계열 파라미터 분석을 사용하여 두 가지 대표적인 장기 제한 및 이동 궤적을 특성화할 수 있습니다. 일반적으로 몇 가지 어려운 절충이 있기 때문에 단일 입자 추적 분석 판독에서 데이터의 단일 신규 해석을 요약하고 추출할 필요가 있습니다.