Name: 단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 학습하세요 암장 현미경과 단일 입자 추적 분석을 사용하여 세포 막에서 금 나노로드의 확산 및 회전 역학을 시각화하는 방법을. 이 프로토콜은 나노재료와 세포의 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 21425519, 91853105 및 21621003의 보조금 번호로 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양
<ol><li>태아소 혈청을 추가하여 U87 MG 세포에 대한 완전한 배지 준비(최종 농도 10%) 및 페니실린 연쇄 절제술 (최종 농도 1%) 최소 필수 매체(MEM)에. 세포 하위 문화에 플라스틱 세포 배양 접시를 사용합니다.</li>
	<li>통로 세포는 일주일에 2 ~ 3 번.<ol>
<li>배양 배지를 제거하고 덜벡코의 인산완충식염(D-PBS)으로 세포층을 헹구면 컨실루(80%~90%)가 2~3배 나 늘어서 있다.</li>
		<li>세포 배양 접시에 Trypsin-EDTA 용액의 1.0 내지 2.0 mL을 추가하고 세포가 둥글게 될 때까지 반전된 현미경으로 세포를 관찰한다(3~5분).</li>
		<li>준비된 완전한 배지의 3.0mL를 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 셀을 분산시십시오.</li>
		<li>신선한 세포 배지 (3 mL)와 새로운 배양 접시에 셀 서스펜션 (1 mL)을 추가하고 세포를 다시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가습된 대기에서 세포를 37°C 및 5% CO2로 유지한다.</li>
</ol>2. 현미경 슬라이드 준비
참고: 높은 활성을 가진 3~10세대의 U87 MG 세포는 SPT 실험에 사용된다.
<ol><li>22mm × 22mm 커버립을 이미 피라냐 용액으로 세척하여 에탄올(99.9%)에 담그고 살균하고 있습니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 에탄올 용액(2.1단계)에서 커버 슬립을 꺼내 화염에 에탄올을 연소하여 살균합니다. 모든 에탄올이 연소되면, 2mL의 세포 배지(페놀 레드 없음)로 채워진 플라스틱 세포 배양 접시(35 x 10mm)에 덮개를 놓습니다.</li>
	<li>커버슬립에 1.2.3 단계에서 셀 서스펜션의 50 μL을 추가하고 접시를 앞뒤로 그리고 좌우로 부드럽게 밀어 세포를 고르게 분배합니다. 가습된 분위기에 놓습니다.</li>
	<li>커버슬립의 U87 MG 셀이 20%-40%의 합류(~12시간)에 도달하면 CTAB-AuNR(138pM)의 20μL을 접시에 넣고 분산시니다. 가습 된 분위기에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>피라냐 용액으로 세척되는 홈글래스슬라이드(도 1)의홈에 2.4단계에서 접시로부터 배양 배지(페놀 레드 없음)의 100μL을 첨가한다.</li>
	<li>접시에서 커버 슬립을 꺼내 현미경 유리 슬라이드의 홈 상단에 반전(그림 1). 매니큐어로 밀봉하고 건조하게하고 SPT 실험을 수행하기 위해 무대에 놓습니다.</li>
</ol>3. 암장 현미경 검사법으로 단일 입자 추적 실험을 수행(그림 1).
<ol><li>기름에 침지된 암야 콘덴서(NA 1.43-1.20)에 오일 한 방울을 놓고 노브를 돌려 응축기가 유리 슬라이드에 접촉하도록 합니다.</li>
	<li>커버 글래스 위에 오일 한 방울을 넣고 초점 손잡이를 돌려 60배 오일 침수 목표(NA 0.7-1.25)가 오일을 만지도록 합니다.</li>
	<li>광원을 켜고 초점 손잡이를 약간 돌려 이미징 평면에 초점을 맞춥니다. 참고: 시야에서 배경은 검고, 셀은 밝고, CTAB-AuNRs(종횡비~2:1, 그림 2)는작은 색(빨간색, 노란색 또는 녹색) 산란반입니다.</li>
	<li>컬러 CMOS 카메라로 샘플 산란 라이트를 캡처합니다. TIFF 형식을 기록하고 내보내 이미지를 저장하려면 소프트웨어에서"카메라 아이콘"을클릭합니다.</li>
</ol>4. 데이터 수집
<ol><li>단일 장기 궤적 추출<ol>
<li>그림 3에 설명된 대로 작동하여 시계열 다크 필드 이미지를 "RGB 색상" 모드에서 "8비트" 모드로 변환합니다. 이미지 J 클릭 이미지 | | 유형 8 비트. 대비를 조정하려면 이미지를 클릭| 조정 | 밝기 | 대비.</li>
		<li>대상 파티클을 선택하고"Ctrl+X"로배경을 권투하고 삭제하여 타임시리즈 배경을 차단합니다.</li>
		<li>"플러그인 | 클릭하여 파티클 감지 및 파티클 연결 창을엽니다. 입자 추적기 클래식 | 파티클 트래커".</li>
		<li>반경을 6으로 설정하고, 0으로, 백분위수는 0.01%로 설정합니다. 참고: 파티클을 감지하려면 미리 보기를 사용하여 세 가지 매개 변수 이상으로 조정합니다. 반경이 대상 파티클보다 약간 크고 가장 작은 파티클 간 분리보다 작은지 확인합니다. 백분위수는 후보 입자인 강도 분포의 하한입니다.</li>
		<li>링크 범위를 5로 설정하고 변위를 10으로 설정합니다. 참고: 파티클을 연속 인접 프레임 간에 연결하려면 위의 두 매개 변수를 조정합니다. 변위는 파티클이 두 개의 후속 프레임 사이에서 이동할 수 있는 최대 픽셀이며, 링크 범위는 최상의 일치를 결정할 때 고려해야 할 연속 프레임 수입니다.</li>
		<li>"확인"을클릭하여 ParticleTracker 결과 창을 열어 결과를 확인합니다.</li>
		<li>"모든궤적을 시각화"를클릭하여 생성된 궤적을 검사합니다.</li>
		<li>소프트웨어생성 궤도가 AuNR의 이동 궤적과 일치하지 않는 경우 상단에 있는"입자 재링크"메뉴를 클릭하여 감지된 입자를 서로 다른 링크 범위 및 백분위수 매개변수로 다시 연결합니다.</li>
		<li>소프트웨어가 생성된 궤적과 AuNR의 이동 궤적이 일치하는 경우 결과를 저장하려면"전체 보고서 저장"을클릭합니다. 참고: 이미지 J로 단일 장기 궤적을 추출하는 예가 도 4에표시됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다중 궤적 추출 참고: 피지와 다중 궤적을 추출하는 예는 그림 5에표시됩니다. 여러 단계가 있으며 각 단계는 추적 프로세스의 단계를 구성합니다. 각 단계의 결과가 즉시 표시되므로 출력이 만족스럽지 않을 때 사용자가 다시 설정을 재조정할 수 있습니다.<ol>
<li>그림 3에 설명된 대로 작동하여 시계열 다크 필드 이미지를 "RGB 색상" 모드에서 "8비트" 모드로 변환합니다. 이미지 J 경로클릭"이미지 | | 유형 8 비트". 대비를 조정하려면"이미지 | 클릭합니다. 조정 | 밝기 | 대비".</li>
		<li>"플러그인 | 클릭하여 시작패널을 엽니다. 추적 | 트랙메이트". 클릭 "다음".</li>
		<li>드롭다운 메뉴에서"LoG 검출기"를선택하고다음"를 클릭합니다.</li>
		<li>검출기 구성 패널의 매개 변수를 조정합니다. 예상 Blob 직경을 10으로 설정하고 임계값을 0으로 설정하고"하위 픽셀 지역화 수행"을선택합니다.</li>
		<li>"다음"을클릭하여 초기 스팟 필터링 패널을 엽니다. 참고: 여러 매개 변수를 조정하여 대상 점을 더욱 최적화할 수 있습니다. 이 예제에서는 다른 매개 변수가 조정되지 않았습니다.</li>
		<li>드롭다운 메뉴에서"다음"을클릭하고"하이퍼스택 디스플레이"를선택합니다.</li>
		<li>스팟 필터링 패널을 열려면다음 "다음"을클릭합니다. 품질은 1.88, X 38.86 이상, Y를 56.54 이상으로 설정합니다.</li>
		<li>드롭다운 메뉴에서"다음"을클릭하고"간단한 LAP 트래커"를선택합니다. 세 가지 매개 변수, 즉 연결 최대 거리 = 15, 갭 클로징 최대 거리 = 15 및 갭 클로징 최대 프레임 간격 = 5를 조정하여 간단한 LAP 트래커를 구성합니다. 참고: 최대 연결 거리는 두 프레임 사이의 점의 최대 변위입니다. 간격 닫기 최대 거리는 두 세그먼트의 최대 변위입니다. 간격 을 닫는 최대 프레임 간격은 브리지할 두 점 사이의 가장 큰 프레임입니다.</li>
		<li>추적하려면 "다음"를 클릭합니다. 완료되면 계속 클릭하십시오 "다음".</li>
		<li>트랙의 스팟 수를 300 이상으로 설정하는 등 트랙의 필터를 설정합니다.</li>
		<li>마지막 저장 패널이 열릴 때까지"다음"을계속 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서"XML 파일로 트랙 내보내기"를선택한 다음"실행"을클릭하여 csv 형식으로 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>R/G 값 참고: R 및 G 채널에서 표적 AuN의 산란 강도는 MATLAB(https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle)에 작성된 코드를 사용하여 색상 암필드 이미지에서 얻어지며 추출 원리는 도 6에제시된다.<ol>
<li>x-y 좌표(ImageJ/Fiji에서 추출)에 따라 각 프레임에서 AuNR의 중앙 픽셀 좌표를 찾으려면 xy.m coordination함수를 사용합니다.</li>
		<li>RG추출.m 기능을 사용하여 3 x 3 픽셀 행렬을 제한하고 R 또는 G 채널의 9 산란 강도 값을 추출하고 평균 값(μ R 또는 G로 정의됨)을 계산합니다. 참고: 3 x 3 픽셀 행렬은 4.3.1 단계에서 얻은 픽셀 좌표를 중심으로 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>극각 참고: 극각은 AuNR의 경도와 광학 축(도 1에도시된 대로)의 각도로 AuNR의 공간(Z 축) 회전 역학을 반영할 수 있습니다.<ol>
<li>극지의 기능을 사용하여.m 이중 채널 차동방법(22)에의해 극지 각도(θ)를 계산한다. <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ10.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>5. 데이터 분석
참고: 체계적이고 견고한 데이터 분석 프레임워크는 SPT 분석 방법의 성능과 효율성을 위해 필수적입니다. MATLAB에 작성된 사용자 지정 소프트웨어가 사용됩니다(https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). 플롯을 그리는 데 그래프 및 분석 소프트웨어(재료 표참조)가 사용됩니다.
<ol><li>분석 매개 변수<ol>
<li>표 1에표시된 수식에 따라 동적 매개 변수를 계산하기 위해 csv_data_extract_dis_vel_ss.m 및 csv_data_MSD.m 스크립트를 사용합니다. 참고: 이러한 매개 변수는 AuNRs의 역학을 분석하는 데 사용되며 세 부분으로 구성됩니다. (1) 궤적 관련 매개변수: 변위, 단계 크기, 속도, 교향반(Rg),및 터닝 각도(Ta); (2) MSD 매개 변수: 확산 계수(Dt)및 비정상적인 확산 지수(α); 및 (3) 회전 관련 매개변수: 극지 각도 및 회전 용성(σ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>측정</td>
			<td colspan="2">정의</td>
			<td>물리적 의미</td>
		</tr>
<tr>
<td>변위</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ01.jpg"></td>
			<td>개체 위치 변경</td>
		</tr>
<tr>
<td>단계 크기</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ02.jpg"></td>
			<td>인접한 두 지점 사이의 거리</td>
		</tr>
<tr>
<td>속도</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ03.jpg"></td>
			<td>오브젝트 모션 속도</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rg
</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ04.jpg"></td>
			<td>특정 시간 간격으로 개체의 이동 범위</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ta
</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ05.jpg"></td>
			<td>인접한 두 점 사이의 오브젝트의 동작 방향</td>
		</tr>
<tr>
<td>Msd</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ06.jpg"></td>
			<td>특정 시간 간격의 개체의 평균 이동 거리</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dt
</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ07.jpg"></td>
			<td>물체의 확산 능력</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ07.jpg"></td>
			<td>일반 확산(α~1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>극각</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ08.jpg"></td>
			<td>개체의 3D 방향 정보</td>
		</tr>
<tr>
<td>Σ</td>
			<td colspan="2"><img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61603/61603equ09.jpg"></td>
			<td>극각 데이터 세트의 분산 정도</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 분석에 사용되는 세 가지 유형의 매개 변수입니다. 여기에는 궤적 관련 파라미터(변위, 단계 크기, 속도, Rg 및 Ta),MSD 파라미터(MSD, Dt 및 α) 및 회전 관련 매개변수(극각 및 회전 용 lability)가 포함됩니다.
<ol start="2"><li>궤적의 시각적 분석 참고: 궤적 시각화는 입자 모션의 현면적 이질성 및 시간 매핑 궤적, Rg및 Dt매핑 궤적 및 극지 각 매핑 궤적과 같은 동적 파라미터의 궤적(좌표) 분포를 직관적으로 제시할 수 있습니다. 매핑 궤적그래프 및 분석 소프트웨어를 사용하여 그려졌습니다.<ol>
<li>X 좌표를 X, y 좌표로 설정하고 시간(Rg,Dt,극지 각도)을 Z로 설정합니다.</li>
		<li>"플롯| 클릭합니다. 분산 플롯 | 색상 매핑 플롯".</li>
		<li>색상 막대를 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MSD 분석 참고: MSD분석(23)에의해 입자의 동작 활동 및 동작 모드를 얻을 수 있다. Dt가클수록 입자의 확산 운동이 활성화됩니다. α~1일 때, 입자는 정상적인 확산 운동을 하며, 그렇지 않으면 비정상적인 확산 운동을 수행합니다.<ol>
<li>MSD θ 수치<ol>
<li>시간 간격(θ)을 X, MSD 데이터를 Y로 설정합니다.</li>
			<li>"플롯| 클릭합니다. 분산 플롯"</li>
			<li>"분석 | 클릭하여 데이터 맞춤 피팅 | 비선형 곡선 피팅(함수: Allometricl)".</li>
		</ol>
</li>
		<li>MSD θ 이중 로개반스피 참고: 경사가 α 가로채는 MSD θ 이중 로개반스도 피규어는 Dt이며,파티클 모션을 직관적으로 표시할 수 있습니다.<ol>
<li>로지산스믹 시간 간격을 X로 설정하고 로지스름 MSD를 Y로 설정합니다.</li>
			<li>"플롯| 클릭합니다. 분산 플롯".</li>
			<li>"분석 | 클릭하여 데이터 맞춤 피팅 | 선형 곡선 피팅".</li>
		</ol>
</li>
		<li>D-θ 그림(MSD/4t) 참고: D=MSD/4θ는 α 시간 θ 및 이상 요인의 함수이며, D θ 그림은 시간에 대한 확산 계수의 변화를 직접 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 D가 증가하면 α 1보다 크고 입자는 슈퍼퓨전 동작을 수행합니다.<ol>
<li>로지산시간 간격(θ)을 X로 설정하고 로지스믹 D를 Y로 설정합니다.</li>
			<li>"플롯| 클릭합니다. 분산 플롯".</li>
			<li>"분석 | 클릭하여 데이터 맞춤 피팅 | 비선형 곡선 피팅(함수: "Allometricl")". 참고: 궤적이 짧을수록 확산 추정치의 부정확성이 높아지다. 일반적으로, 긴 간격 시간(&gt; 30 θ)의 MSD θ 분석을 통해 Dt 및 α 수득하였다. 그러나 심플하고 거친 피팅은 모션 세부 사항을 부드럽게합니다. 따라서 짧은 간격 시간(&amp;10 θ)에 대한 MSD θ 분석은 짧은 시간에 입자의 동작 거동을 분석하기 위해 수행되어야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>통계 분석<ol>
<li>다중 입자 통계 분석 참고: 다중 입자 통계 분석은 공간 영역에서 입자의 동작 상태를 반영할 수 있으며, 이는 공간 이질성 환경을 간접적으로 나타냅니다. 예를 들어 Dt의 히스토그램이 대규모 분포 또는 다중 피크 분포를 나타내는 경우 파티클의 모션 활동이 이질적이라는 것을 의미합니다.<ol>
<li>동적 매개 변수(예: Dt,Rg,최대 변위)를 Y로 설정합니다.</li>
			<li>"플롯| 클릭합니다. 히스토그램".</li>
			<li>히스토그램을 두 번 클릭하고 분할 크기 또는 분할 수를 설정합니다. "를 클릭합니다"적용".</li>
		</ol>
</li>
		<li>단일 입자 통계 분석 참고: 단일 입자의 통계 분석은 개별 입자의 동작거동을 표시할 수 있으며, 이는 또한 주변 환경의 현면이질성을 간접적으로 반영합니다.<ol>
<li>여러 프레임<ol>
<li>단일 긴 궤적의 모든 프레임의 동적 매개 변수(예:T,스텝 크기, 극지 각도)를 계산하고 Origin 테이블에 복사하여 Y로 설정합니다.</li>
				<li>"플롯| 클릭합니다. 히스토그램".</li>
				<li>히스토그램을 두 번 클릭하고 분할 크기 또는 분할 수를 설정합니다. "를 클릭합니다"적용". 참고: Ta와 스텝 크기 모두 작은 값 분포를 나타내는 경우 파티클은 작은 단계의 초확산 모션을 수행합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>움직이는 창<ol>
<li>움직이는 창 방법(11프레임)을 통해 단일 긴 궤적의 모든 프레임의 동적 매개변수(예: Rg,Dt)를계산하고 Origin 테이블에 복사하여 Y로 설정합니다.</li>
				<li>"플롯| 클릭합니다. 히스토그램".</li>
				<li>히스토그램을 두 번 클릭하고 분할 크기 또는 분할 수를 설정합니다. "를 클릭합니다"적용".</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>타임시리즈 분석 참고: 통계 분석은 NP의 동작 상태를 나타낼 수 있으며, 타임시리즈 분석은 모션 동작을 보완으로 제시할 수 있다. 여러 타임시리즈 매개 변수를 결합하면 시간적 및 공간 수준에서 NP의 동작 동작을 구별할 수 있습니다.<ol>
<li>Y(변위, 극지 각도 및 Rg)와같은 X, 타임 시리즈 매개 변수로 시간을 설정합니다.</li>
		<li>"플롯| 클릭합니다. 다중 창 다이어그램 | 누적 된 플롯 | 선 + 기호".</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+nanoparticles%3A+journey+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Particle+Tracking%3A+From+Theory+to+Biophysical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li>
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<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction%3A+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson%27s+fluid-mosaic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li>
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<li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+membrane+organization%3A+composition%2C+regulation+and+roles+of+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li>
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<li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387(2019).</li>
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</ol>

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제시된 프로토콜은 세포막에 AuNRs의 역학을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이 프로토콜은 현미경 이미징, 데이터 추출, 동적 매개 변수 계산 및 데이터 분석 방법을 포함한 4개의 부분으로 구성되어 있으며 각 부품은 유연하고 보편적입니다. 따라서, 예를 들어, 멤브레인에 NP 연결 멤브레인 분자의 움직임을 연구하는 많은 가능한 미래의 응용 프로그램, NP 라벨 수용체의 내분비역학, 세포 내 NPs및 소포 코팅 NPs 수송의 동적 분석 등등.
기본 단계는 DFM을 사용하여 세포막에서 AuNRs의 움직임을 이미지화하는 것입니다. 현재, 세포막 역학의 분석을 위한 많은 화상 진찰 기술이 개발되고 있으며, 그 중 형광 현미경 검사법은24로널리 사용되고 있다. 그러나 형광 프로브의 광표백 특성은 오랜 시간 동안 입자 역학을 추적할 수 없게 됩니다. 여기서, 빛 안정 플라스모닉 AuN이 사용되었다. 여러 이미징 기술은 플라스모닉<sup class="...

멤브레인상 나노입자(NPs)의 역학은 세포 기능, 바이러스 또는 세균 감염 및 인공 나노 의료 전달 시스템의 개발에 필수적인 세포 섭취 과정과 밀접한 관련이 있다1,2. 단일 입자 추적(SPT) 기술은 NPs3,4의이기종 동작을 특성화하는 강력한 도구이다. 일반적으로, 세포막은 단백질 및 지질과 같은 성분이 혈장 막평면5,6,7에서측면으로 이동할 수 있음을 의미하는 유체이다. 멤브레인 조직과 구조의 현면복잡성은 NP와 멤브레인 간의 상호 작용의 현면적 이질성으로 이어질 수 있다. 따라서 멤브레인에서 의한 NPs 의 움직임을 직접 시각화하려면 높은 공간 및 시간적 해상도가 필요합니다.
수십 나노미터의 공간 분해능과 밀리초의 시간 분해능을 가진 살아있는 세포에서 개별 입자의 국소화를 모니터링하는 단일 입자 추적 현미경 검사법은 NPs 또는 멤브레인 분자 역학8,9를연구하기 위해 잘 개발되었다. 형광계 현미경 이미징 기술은 살아있는 세포 환경에서 NPs/분자를 관찰하기 위한 귀중한도구가 되었다9,10,11,12. 예를 들어, 높은 스피처럴 분해능을 가진 기판/용액 인터페이스에서 시료의 얇은 층(~100nm)을 이미지하는 총 내부 반사 형광 현미경검사법은 멤브레인 분자 역학13,14의연구에 널리 사용되고 있다. 그러나, 낮은 강도및 신속한 돌이킬 수 없는 광표백과 같은 단일 형광의 내재된 단점은추적13의정확도와 지속시간을 감소시다. 따라서 형광 프로브를 대체하는 비형성 플라스모닉 PPs는 독특한 광학특성(15)으로인해 장기 이미징 연구에서 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 플라스모닉 NP 프로브의 산란 신호에 기초하여, 여러 종류의 광학 현미경 이미징 기술은 암야 현미경 검사법(DFM)16,간섭 성 산란(iSCAT) 현미경 검사법(DICM)18과같은 생물학적 과정의 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔다. 또한, AuNRs의 동작 및 회전 역학은 DFM 및 DICM18,19,20,21,22를사용하여 얻을 수 있다. 전형적으로, SPT 실험에서, 물체의 움직임은 광학 현미경에 의해 기록된 다음 SPT 분석 방법3에의해 분석된다. 개별 NP에 의해 생성된 시간 해결 궤적 및 방향 각도는 일반적으로 스토카스틱및 이기종이므로 다양한 분석 방법으로 풍부한 동적 정보를 제시할 필요가 있습니다.
여기서는 DFM을 사용하여 세포막에 대한 AuNRs의 역학을 모니터링하고 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuNRs의 위치와 방향을 추출하고 SPT 분석 방법으로 AuNRs의 확산을 특징으로하는 통합 프로토콜을 제공합니다. 시연으로, 우리는 U87 MG 세포막에 수정되지 않은 AuNRs (CTAB-AuNRs, 보호 에이전트로 cetyltrimelammonium 암모늄 브로마이저 분자에 의해 합성)의 역학을 시각화하기 위해 SPT 프로토콜을 사용하는 방법을 여기에 보여줍니다. CTAB-AuNRs가 생물학적 환경에서 단백질을 흡착하고 세포막으로 이동한 다음 세포2,20,22를입력할 수 있음을 입증하였다. U87 MG 세포는 중추 신경계의 가장 일반적이고 가장 악성 종양이며, 그 막 수용체는 비정상적으로 발현된다. 멤브레인 수용체는 AuNRs의 역학에 영향을 미치는 AuNRs의 단백질과 상호 작용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 일반적으로 생물학 분야의 다른 SPT 실험에 적용됩니다.

<table><tbody><tr><td>CTAB 코팅 금 나노로드(CTAB-AuNR)</td><td>Nanoseedz</td><td>NR-40-650</td><td>85 nm * 40 nm</td></tr><tr><td>컬러 CMOS 카메라</td><td>올림푸스</td><td>DP74</td><td>일본</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Citoglas</td><td>z10212222C</td><td>22*22 mm</td></tr><tr><td>암시야 현미경</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td>정립 현미경</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>피지</td><td>국립 보건원</td><td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td><td>ImageJ</td></tr><tr><td>그루브 유리 슬라이드</td><td>돛 브랜드</td><td>7103</td><td>단일 오목</td></tr><tr><td>이미지 J</td><td>국립 보건원</td><td>1.52 j</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 코드</td><td></td><td></td><td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td></tr><tr><td>최소 필수 배지(MEM)</td><td>Gibco</td><td>10-010-CVR</td><td>with phenol red</td></tr><tr><td>최소 필수 배지(MEM)</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td>페놀 레드</td></tr><tr><td>없음 Origin</td><td>OriginLab</td><td>Origin Pro 2018C</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 세포 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 세포 배양 접시</td><td>팔콘</td><td>353001</td><td>35*10 mm</td></tr><tr><td>U87 MG 세포</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>ATCC HTB-14</td><td>인간 1차 교모세포종 세포주</td></tr></tbody></table>

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

세포막에 나노 입자의 확산 역학을 분석하는 것은 세포 섭취 과정을 더 잘 이해하는 데 중요한 역할을하며 나노 의학 전달의 합리적 설계를위한 이론적 근거를 제공합니다. 단일 입자 추적(SPT) 분석은 세포막에 개별 나노 입자의 위치와 방향을 조사하고 그들의 번역 및 회전 상태를 나타낼 수 있었습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuN의 위치와 방향을 추출하는 방법과 AuNR의 확산 상태를 특성화하는 방법을 보여줍니다. 수백 개의 입자의 통계 적 분석은 단일 AuNRs가 U87 MG 세포막의 표면에 브라운 운동을 수행한다는 것을 보여줍니다. 그러나 개별 적인 긴 궤적 분석은 AuNRs가 멤브레인, 즉 장거리 운송 및 제한된 면적 감금에 두 가지 유형의 모션 상태를 가지고 있음을 보여줍니다. 우리의 SPT 방법은 잠재적으로 다른 생물학적 세포에 있는 표면 또는 세포내 입자 확산을 연구하기 위하여 이용될 수 있고 복잡한 세포 기계장치의 조사를 위한 강력한 공구가 될 수 있습니다.

프로토콜에서 수정되지 않은 40 x 85 nm CTAB-AuNR이 사용되었습니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 세로 플라스모닉 최대값은 ~650nm(적색 영역)이며 횡방향 공명은 520nm(녹색 영역)이다. 이전 문헌은 플라스모닉 AuNR의 광학 특성(예: LSPR 강도)이 직경20,22로크게 변화할 것이라고 밝혔다. 도 2C에서,U87 세포막에 CTAB-AuNRs에서 산란 강도는 좁은 폭으로 전형적인 가우시안 분포를 보였으며 유리에 CTAB-AuNRs의 분포와 일치했으며, 이는 이 실험에서 추적된 CTAB-AuNRs가 잘 단분산되었다는 것을 나타낸다.
멤브레인에 CTAB-AuNRs의 동적 DFM (12 fps)에 의해 모니터링되었다. <strong class="xfig...

여기서, 우리는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 단일 AuNR의 위치와 방향은 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 감지되며 AuNRs의 확산 상태는 단일 입자 추적 해석을 특징으로 합니다.

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

당사의 프로토콜은 단일 입자 검사 분석을 사용하여 위치와 방향의 역학을 모니터링하고 세포막에 황금 나노로드가 확산되는 특성화합니다. 이 방법을 이용하여, 황금 나노로드의 번역 및 회전 역학을 모두 얻을 수 있고 역학을 종합적으로 분석하고 제시할 수 있다. 이 프로토콜은 복잡한 생물학적 시스템의 다른 유형의 연구에 사용될 가능성이 있다.먼저 화염에 에탄올 담근 유리 커버슬립을 태우고 페놀 레드 없이 세포 배양 배지 2밀리리터를 함유한 35~10mm 세포 배양 접시에 커버슬립을 넣는 것으로 시작한다. 커버슬립에 관심 있는 셀 서스펜션 50마이크로리터를 넣고, 접시를 앞뒤로 그리고 좌우로 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. CTAB 코팅 금 나노로드 20 마이크로리터를 첨가하기 전에 세포가 20~40%에 도달할 때까지 약 12시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다.부드러운 흔들림으로 나노로드를 접시 전체에 고르게 분산시키고 5분간 가습된 분위기에 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 천천히 유리 슬라이드의 홈으로 접시에서 100 마이크로 리터를 전송하고 조심스럽게 슬라이드 홈에 커버 슬립 셀 측면을 배치 한 다음 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 암필드 현미경 단계에 슬라이드를 배치하기 전에 매니큐어 건조하자. 암필드 현미경 검사법에 의한 단일 입자 추적의 경우, 오일 한 방울을 암필드 응축기에 넣고 응축기가 유리 슬라이드에 닿을 때까지 노브를 돌립니다.60X 오일 침지 목표가 오일에 닿을 때까지 오일 한 방울을 커버 글래스 상단에 놓고 초점 손잡이를 켭니다. 광원을 켜고 초점 손잡이를 약간 돌려 이미징 평면에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 카메라 아이콘을 클릭하여 CMOS 카메라를 사용하여 샘플 산란 광 화상 타임 시리즈를 기록하고 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.단일 장기 궤적을 추출하려면 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지, 유형 및 8비트를 클릭하여 RGB 모드에서 8비트 모드로 이미지를 변환합니다. 대비를 조정하려면 이미지를 클릭하고 조정하고 밝기 대비를 설정하고 매개 변수를 설정합니다. 대상 파티클을 선택하고 컨트롤 X를 사용하여 타임시리즈 배경을 차단합니다.플러그인, 파티클 트래커 클래식 및 파티클 트래커를 클릭하여 파티클 감지 및 파티클 연결 창을 열고 반경을 6으로 설정하고, 차단을 0으로 설정하고, 백분위수는 링크 범위를 10으로 설정하고 변위를 10으로 설정하고 확인을 클릭하여 결과를 볼 수 있습니다. 생성된 궤적을 검사하려면 모든 궤적을 시각화합니다. 소프트웨어가 생성된 궤적과 금 나노로드의 이동 궤적이 일치하는 경우 전체 보고서를 저장하여 결과를 저장합니다.소프트웨어 생성 궤적이 금 나노로드의 이동 궤적과 일치하지 않는 경우 파티클을 다시 클릭하여 감지된 입자를 서로 다른 링크 범위 및 백분위수 매개 변수로 다시 연결합니다. XY 좌표에 따라 각 프레임에서 금 나노로드의 중앙 픽셀 좌표를 찾으려면 xycoordination를 사용하십시오. m 기능.3x 3픽셀 행렬을 제한하려면 빨간색 또는 녹색 채널의 9개의 산란 강도 값을 추출하고 평균 값을 계산하려면 rg추출을 사용합니다. m 기능. 그런 다음 극지각을 사용합니다.m 함수는 이중 채널 차동 방법을 사용하여 극지 각도를 계산합니다. 테이블의 수식을 사용하여 동적 매개 변수를 계산하려면 두 분석 스크립트를 실행합니다. 궤적을 시각적으로 분석하려면 X 좌표를 X로 설정하고 Y 좌표를 Y로 조정한 다음 플롯, 산란 및 색상 맵을 클릭하고 그래프 매개 변수를 설정하고 색상 막대를 추가합니다.평균 정사각형 변위 시간 간격 수치를 생성하려면 시간 간격을 Y.Click 플롯, 분산, 분석, 피팅, 비선형 곡선 피팅 및 열린 대화로 X 및 평균 제곱 변위로 설정하고 그래프 매개 변수를 설정합니다. 다중 입자 통계 해석의 경우 관심 있는 동적 매개 변수를 Y로 설정하고 플롯및 히스토그램을 클릭합니다. 히스토그램을 두 번 클릭하여 분할 크기 또는 분할 수를 설정하고 적용을 클릭합니다.그런 다음 열을 추가하고 그래프 매개 변수를 설정합니다. 타임시리즈 해석의 경우 시간을 X 및 타임시리즈 매개변수로 설정하여 Y.Click 플롯, 멀티창 및 스택으로 설정합니다. 팝업 창에서 줄을 선택하고 확인합니다. 그런 다음 그래프의 매개 변수를 설정합니다.경도 플라스모닉 최대 40 x 85 나노미터 CTAB 코팅 금 나노로드는 약 650 나노미터이고 횡단 공명은 520 나노미터이다. U87 세포막에 CTAB 코팅 금 나노로드의 산란 강도는 이 실험에서 추적된 CTAB 코팅 금 나노로드가 잘 단분산되었음을 나타내는 유리에 CTAB 코팅 금 나노로드의 폭이 좁은 전형적인 가우시안 분포를 나타낸다. 그림과 같이, 500개 이상의 CTAB 코팅금 나노로드 궤적을 암장 현미경검사에 의해 추적할 수 있으며 장거리 확산 궤적 및 제한된 확산 궤적으로 나눌 수 있다.본 대표적인 분석에서 모든 500개의 궤적의 경화 반경은 0.5 마이크로미터의 평균 반경과 최대 변위가 작은 값으로 더 분포된 작은 값 분포를 보였다. 이 앙상블 시간 평균 평균 제곱 변위 분석에서 입증된 바와 같이, CTAB 코팅 금 나노로드는 일반적으로 약 하나의 알파로 확산된다. 그러나 모든 궤적으로부터 얻은 확산 계수와 알파의 밀도 분포는 금 나노로드의 역학이 초대형, 브라우니아 및 해류 모션을 통해 이질분포를 나타낸다는 것을 보여준다.또한 단일 입자 통계 분석 및 시계열 파라미터 분석을 사용하여 두 가지 대표적인 장기 제한 및 이동 궤적을 특성화할 수 있습니다. 일반적으로 몇 가지 어려운 절충이 있기 때문에 단일 입자 추적 분석 판독에서 데이터의 단일 신규 해석을 요약하고 추출할 필요가 있습니다.

visualizing-diffusional-dynamics-gold-nanorods-on-cell-membrane-using

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 특정 관심 세포주의 세포막과 플라즈몬 금 나노막대의 상호 작용을 모니터링하기 위해 단일 입자 추적(SPT) 분석과 결합된 암시야 현미경(DFM) 기술에 대해 설명합니다. 결합된 DFM 및 SPT 분석을 통해 높은 시공간 해상도로 세포막을 통한 나노막대 움직임을 시각화할 수 있습니다.

세포막에서 나노막대의 확산 역학을 시각화하기 위한 암시야 현미경 검사

우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

우리는 수생 생물의 주파수의 움직임을 조사하고 특성을 플라즈몬 나노 입자의 광학 추적을 사용합니다.

&#39;Nauplius의 움직임을 분석<em&gt; 아테 살리나</em&gt; &#39;플라즈몬 나노 입자의 광학 추적하여

효모, 사카로 미세스 세 레비 시아는, 엔도 좀 시스템의 생합성과 기능을 조절하는 유전자를 확인하고 연구하는 중요한 모델 생물이다. 여기에서 우리는 초 미세 구조 연구를위한 엔도 좀 구획의 특정 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

미세 구조의 분석을위한 효모 엔도 좀의 시스템 Nanogold 라벨링

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

이 프로토콜은 금 나노막대의 광학 흡수와 관련된 일시적인 가열을 사용하여 신경 세포의 분화 및 세포 내 칼슘 활성을 자극하는 방법을 설명합니다. 이러한 결과는 잠재적으로 신경 보철물 및 신경 과학의 기초 연구에 대한 새로운 응용 분야를 열 수 있습니다.

골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

우리는 암의 광음향 이미징을 위해 금 나노막대를 포함하는 세포 운반체의 준비 및 타당성을 보여줍니다.

금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

Plasmonic 골드 nanorods 액체에 갇혀 고 kHz 주파수 원형 편광 광학 핀셋을 사용 하 여에서 회전 될 수 있습니다. 연구와 과학의 많은 분야에서 응용 프로그램에 대 한 강력한 시스템을 리드 Brownian 역동성 분석 및 빛 scatteringspectroscopy 도구를 소개.

건설 및 골드 하이퍼 로타리 빛 구동 모터 시스템의 운영

이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD) 분석은 구조 및 동적 특성 측면에서 고유 한 시간 진화 특성을 강조하기 위해 매크로 피노솜에 적용됩니다. 그런 다음 Macropinosomes는 시간 불변의 평균 구조 / 동적 특성을 가진 세포 하부 구조에 대한 참조로서 인슐린 분비 과립 (ISGs)과 비교됩니다.

시공간 변동 분광법에 의한 밀매된 세포하 나노구조체의 구조적 및 동적 특성 조사

본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.

잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성

플라즈몬 나노핀셋은 금 나노 구조에서 국부적인 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 나노미터 규모의 광학 필드 내에서 단백질을 포함한 단일 나노 입자를 가둡니다. 산란 신호의 변화는 단백질의 존재와 구조적 역학을 드러내므로 형광단 변형이나 표면 테더링 없이 모니터링할 수 있습니다.

플라즈모닉 나노핀셋을 사용한 단일 비변형 단백질의 구조적 역학 모니터링

학습하세요 암장 현미경과 단일 입자 추적 분석을 사용하여 세포 막에서 금 나노로드의 확산 및 회전 역학을 시각화하는 방법을. 이 프로토콜은 나노재료와 세포의 상호작용 연구에 활용됩니다.

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

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