Name: 튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 간암 연구를 위한 3D 생체 모방 모델로 종양-스트로마 상호 작용을 분석하는 방법입니다. 조절 가능한 하이드로겔 강도와 간 세포주를 활용하여 간암 발생 기전과 치료 전략에 대한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 스웨덴 암 재단 (Cancerfonden, CAN2017/518), 의학 연구를위한 스웨덴 사회 (SSMF, S17-0092), O.E. och Edla 요한슨 재단 및 올가 욘슨 재단에서 얻은 보조금을 통해 투자되었습니다.  이러한 자금 출처는 연구 설계에 관여하지 않았습니다. 데이터의 수집, 분석 및 해석; 보고서 작성; 그리고 출판을 위해 기사를 제출하기로 결정. 이 프로토콜에 사용되는 사용자 정의 설계 스페이서의 3D 프린팅은 U-PRINT에서 수행되었다: 웁살라 대학의 3D 인쇄 시설은 의학 및 약국의 징계 도메인에서, U-PRINT@mcb.uu.se. 우리는 우리의 프로젝트에 대한 그의 귀중한 입력 폴 오칼라한 감사하고 싶습니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig1.jpg"> 그림 1: 3D 생체 모방 HCC 모델의 생성에 대한 그래픽 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig1large.jpg" target="_blank">묘사는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: 이 프로토콜의 전체 워크플로우는 그림 1의 그림에 명시되어 있습니다.
1. 피브리노겐 재고 솔루션 준비
<ol><li>1M 칼슘 염화물(CaCl2)스톡 용액을 2.21g의무게로 20mL 증류수(dH2O)에 첨가하여 준비한다. 재고 용액은 실온(RT)에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>20mL 아프로틴 스톡 솔루션(1218.75 KIU/mL)을 5 mg의 아프로틴계량하여 20mL dH2O. Aliquot 스톡 용액을 1mL 알리쿼트스톡용액에 넣고 -20°C에 보관한다.</li>
	<li>80 mg / mL 피브리노겐 재고 솔루션의 10 mL을 준비합니다.<ol>
<li>50mL 튜브에서 7.849 mL 인산완충식셀린(PBS), 2.051mL 아프로틴 재고(1218.75 KIU/mL)를 추가하여 최종 아프로틴 농도 250KIU/mL, 100 μL CaCl 2(1M)의 최종2ClM 농도를 기록했다.</li>
		<li>무게 800 피브리노겐의 mg.</li>
		<li>무게 200 mg 염화 나트륨 (NaCl) 재고 용액에 대 한 포함 하는 2% w/v NaCl.</li>
		<li>PBS, 아프로틴 및 CaCl2를포함하는 50 mL 튜브에 피브리노겐과 NaCl을 증분에 추가한다. 이 용액에 형성 되는 fibrinogen 겔화 및 덩어리 귀착 될 것 이다 적극적으로 저어 또는 흔들어 하지 마십시오.</li>
		<li>피브리노겐 스톡 용액의 50mL 튜브를 셰이커에 수평으로 놓고 300 rpm의 낮은 설정에서 흔들어 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>용액이 용해되면 볼륨에 따라 0.22 μm 주사기 필터 또는 병 상단 필터를 사용하여 필터링합니다. 중요한 것은, 이것이 피브리노겐을 파괴할 것이기 때문에 피브리노겐 용액을 자동화하지 마십시오. 참고: 프로토콜의 이 부분은 재고 솔루션의 양에 따라 2~5시간 정도 걸릴 수 있으며, 이번에는 실험 설정 중에 고려해야 합니다.</li>
</ol>2. 하이드로겔을 인서츠에 파종하기 전에 콜라겐으로 인서트를 코팅합니다.
<ol><li>라미나르 플로우 후드 또는 조직 배양 후드에서 멸균 핀셋을 사용하여 플레이트에서 인서트를 제거하고 플레이트 뚜껑에 반전배치합니다.</li>
	<li>20mM 빙하 아세트산 스톡 용액 100mL를 dH2O의25mL에 115 μL을 추가하고 dH2O.로 100mL의 최종 부피에 적응하여 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다. 재고 용액은 RT에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>20mM 빙하 아세트산 스톡 용액의 1.960mL에 5 mg/mL 콜라겐 용액의 40 μL을 추가하여 5 mg/mL 콜라겐 용액으로부터 100 μg/mL 콜라겐 용액의 2mL를 준비한다.</li>
	<li>각 인서트에 용액의 100 μL을 파이프팅하여 2.3으로 제조된 100 μg/mL 콜라겐 용액으로 인서트를 코팅합니다. 2 ~3 시간 동안 라미나르 플로우 후드 또는 조직 배양 후드 내에서 공기를 건조하게하십시오.</li>
	<li>일단 인서트가 건조되면 PBS로 각 삽입 3배. 12 웰 플레이트의 각 웰에 PBS 1 mL을 추가하고, 우물에 아래로 향한 콜라겐 코팅삽입을 배치하고, 우물에서 PBS를 제거하고 절차를 반복합니다. 라미나르 플로우 후드 1~2시간 내에 공기를 건조시키십시오. 주의: 아세트산은 세포에 독성이 있으며 삽입은 PBS로 철저히 세척되어야 합니다.</li>
	<li>인서츠 위에 사용자 정의 3D 인쇄 스페이서를 추가하면 젤이 삽입에서 매달려 있으면 플레이트의 바닥 우물을 만지지 않도록해야합니다(그림 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig2.jpg"> 그림 2: 사용자 정의 3D 인쇄 스페이서이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig2large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="7"><li>반전된 인서트를 플레이트의 바닥 부분으로 덮고 셀이 하이드로겔에 내장되어 종자 될 때까지 인큐베이터에 넣습니다.</li>
</ol>3. 하이드로겔에 내장된 파종 셀을 삽입에 넣습니다.
참고: 표 1은 준비될 다양한 농도의 피브리노겐을 가진 3개의 제제에 대한 설명을 제공한다. 제형 1개는 섬유증, 2개의 간경변 및 3개의 HCC의 개시 도중 간, 2개의 간경변 및 3개의 HCC에 대응하는, 이들 제제각각에 대한 강성 값은 프로토콜 최적화 동안 유경학으로 결정되었다.
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>정립</td>
			<td>최종 피브리노겐 농도 (mg/mL)</td>
			<td>최종 콜라겐 농도 (mg/mL)</td>
			<td>셀(LX2 + HepG2 공동 배양 1:1)</td>
			<td>간 단계</td>
			<td>문학 간 강성 값 (kPa)</td>
			<td>유경학(kPa)의 모델 강성 값</td>
			<td>정립</td>
			<td>추가하는 피브리노겐 (mL)</td>
			<td>추가할 콜라겐(mL)</td>
			<td>10% DMEM(mL)</td>
			<td>트롬빈 (μL)</td>
			<td>
참조s</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 셀/mL</td>
			<td>섬유 증</td>
			<td>≥2</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4</td>
			<td>28; 29; 30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 셀/mL</td>
			<td>경 변 증</td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>2</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.45</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 셀/mL</td>
			<td>Hcc</td>
			<td>≥10</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1</td>
			<td>28; 31; 32</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 하이드로겔에 내장된 파종 세포에 대한 제형에 대한 설명
<ol><li>dH2O의 100mL에 NaOH 3.99 g를 추가하여 수산화 나트륨 스톡 용액 1M을 준비하십시오.  그런 다음 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터링할 수 있습니다. 재고 솔루션을 RT에 저장합니다.</li>
	<li>5 mg / mL 콜라겐과 얼음에 1 M NaOH의 10 mL을 놓습니다.</li>
	<li>50mL PBS, 15mL 트립신, 70mL 10% DMEM 및 피브리노겐 스톡 용액을 예열하여 1부에서 37°C~ 37°C로 수조에서 20분 동안 준비하였다.</li>
	<li>셀 서스펜션을 준비합니다.<ol>
<li>T175 배양물에서 간 염기 세포(LX2) 및 간 암종(HepG2) 세포를 PBS 10mL로 두 번 세척한다.</li>
		<li>37°C에서 4분 동안 6mL 트립신으로 세포를 트립시니즈합니다.</li>
		<li>10% DMEM의 6mL로 트립신을 비활성화합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 15mL 튜브와 원심분리기에서 300 x g로 3분 동안 수집합니다.</li>
		<li>원심 분리 후, 10% DMEM의 5mL에서 상류체를 흡인하고 각 세포줄을 재연한다.</li>
		<li>자동 셀 카운터를 사용하여 셀 계산: 각 셀 서스펜션의 10 μL을 카운팅 챔버 슬라이드에 추가하고 슬라이드를 셀 카운터에 삽입합니다. 셀 카운트는 셀/mL로 표시됩니다.</li>
		<li>명확하게 표시된 15 mL 튜브로 3.4.6 단계의 세포 수를 사용하여 각 세포주에서 1 x 106 세포로 세포를 희석시. 300 x g에서 3 분 동안 희석을 원심 분리합니다.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심분리 후, 표 1에 따라 각 15mL 튜브에 10% DMEM을 흡인시키고, 표에제공된 값은 각 제형의 2mL에 대한 것이다.</li>
	<li>콜라겐의 양을 10μL/mL NaOH(1M)로 중화시키고, 중화 콜라겐을 세포 현탁액에 첨가하고, 10% DMEM선물은 노란색으로 변하고, 서스펜션이 컷 팁으로 파이펫팅하여 철저히 혼합되면 밝은 분홍색으로 변하게 된다.</li>
	<li>표 1에 따른 콜라겐 세포 현탁액에 피브리노겐을 추가하고, 컷 파이펫 팁을 사용하여 서스펜션을 철저히 섞는다.</li>
	<li>마지막으로 콜라겐-피브리노겐 세포 현탁액에 혈전을 추가, 0.1 KIU 혈소암각 10 mg의 피브리노겐에 대 한.</li>
	<li>인큐베이터에서 2절에 제조된 미리 코팅된 반전 인서트를 제거하고, 지정된 인서트에 준비된 서스펜션의 200 μL 파이펫 팁, 파이펫 200 μL을 사용하여 한다. 젤이 라미나르 플로우 후드 내에서 15분 동안 크로스링크를 연결하도록 허용합니다.</li>
	<li>15분 후, 접시의 바닥 부분을 젤 위에 부드럽게 놓고 인큐베이터로 이동하여 젤이 45분 동안 37°C에서 교차연결할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>젤이 교차 연결되면 인서트를 다시 반전시키고 플레이트의 각 하단 우물에 10% DMEM의 2mL을 추가합니다.</li>
</ol>4. 내피 세포를 파종
<ol><li>25mL 행크 균형 소금 용액 (HBSS), 10 mL 트립신, 10 mL 트립신 억제제 및 50 mL 내피 성장 매체, 수조에서 20 분 동안 37 °C로 예열하십시오.</li>
	<li>내피 (HUVEC) 세포 현탁액을 준비한다.<ol>
<li>T175 배양물에서 HUVEC 세포를 10mL HBSS로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>37°C에서 4분 동안 6mL 트립신으로 세포를 트립시니즈합니다. 6 mL 트립신 억제제와 트립신을 비활성화. 200 x g에서3 분 동안 튜브와 원심 분리기의 15 mL에서 세포 현탁액을 수집합니다.</li>
		<li>원심분리 후 상류체를 흡인시키고 5mL 내피 성장 배지에서 세포를 중단한다.</li>
		<li>자동화된 셀 카운터를 사용하여 3.4.6에서 이전에 설명한 대로 셀을 계산합니다.</li>
		<li>세포 카운터에서 세포 수를 사용하여 내피 성장 배지에서 1.0 x 104 세포/mL의 파종 밀도를 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후브C 셀 서스펜션의 종자 500 μL은 인서트가 삽입당 5.0 x 103 세포의 최종 부피를 갖는 인서드의 상단 부분의 각 우물에 들어갑니다.</li>
</ol>5. 유지 보수
<ol><li>양일마다 성장 배지를 교체하고, 우물과 인서트가 모두 소비한 성장 배지를 흡인한다. 2mL 10% DMEM을 후브C 세포를 함유하는 인서츠에 겔 및 0.5mL 내피 성장 배지를 함유하는 웰에 첨가한다.</li>
	<li>실험 전에 21일 동안 모델을 유지관리합니다.</li>
</ol>6. 리솔로지
<ol><li>겔 제형의 저장 계수를 측정하여 rheometer를 사용하여 강성 값을 나타내고, 0.1-20 Hz에서 0.267% 및 37°C의 주파수 스윕을 수행하여 8mm 직경의 병렬 플레이트 스테인리스 스틸 기하학을 사용하여 0.1N의 일정한 축력을 발휘합니다.</li>
</ol>7. 생존력 및 약물 반응
<ol><li>2D 공동 배양 및 3D 모델에서 약물 반응 및 생존 가능성을 결정합니다.<ol>
<li>종자 HepG2 (5.0 x 103 세포 /mL) 및 LX2 (5.0 x 103 세포 /mL) 세포는 1.0 x 104 셀 /mL의 종자 밀도에서 검은 선명한 하단 96 웰 플레이트로 2D 공동 배양을위한 1:1 비율로 세포.  세포가 하룻밤 사이에 부착되도록 허용합니다.</li>
		<li>3D 모델을 설정하여 6kPa의 강성 값을 가진 cirrhotic 환경에 대응한다.  독소루비신 치료 21일 전에 모델을 유지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>독소루비신 치료 2시간 전에, 2D 및 3D 모델 모두에서 배양 배지를 흡인한다. PBS로 두 모델을 두 번 세척합니다. 기아 배지(1% v/v 항진항항생제 용액으로 보충)를 2D 공동배양(웰당 200 μL)과 3D 모델(하이드로겔을 함유한 웰에 2mL 및 삽입에 500 μL)을 추가한다.</li>
	<li>2D 및 3D 모델 모두에 독소루비신을 투여한다.  투여량은 다음과 같습니다: IC25, 50 및 75 값에 대응하는 0.5, 1 및 1.5 mMM, 각각.  두 모델을 72h로 처리합니다. 참고: 독소루비신, 토포이소라제 II 억제제는 HCC에 사용되는 최초의 화학요법 약물 중 하나이며 HCC33,34의치료에 가장 활발한 화학요법 제제 중 하나이기도 하다.</li>
	<li>72h 이후, 2D 및 3D 모델 모두에서 흡인 배양 배지. 나머지 배양 매체는 PBS로 두 모델을 두 번 세척하여 제거되었는지 확인합니다.</li>
	<li>제조업체의 권장 사항에 따라 AlamarBlue를 준비하고 2D 및 3D 모델의 우물에 추가하십시오. 2D 배양에 대해 우물당 150 μL, 3D 배양을 위해 인서드당 2mL, 인서드당 500 μL을 추가합니다.  37°C에서 하룻밤 동안 배양.</li>
	<li>3D 설정의 각 웰에서 AlamarBlue의 150 μL을 블랙 클리어 하부 96 웰 플레이트로 배양 전송합니다. AlamarBlue는 2D 모델의 플레이트에서 직접 읽을 수 있습니다.</li>
	<li>각각 485 및 550 nm의 난초 파장 및 방출 파장에서 마이크로 플레이트 판독기와 형광을 읽어보십시오.</li>
	<li>다음 수식을 사용하여 두 모델모두에서 셀 실행 가능성을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61606/61606eq1.jpg">
</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 HCC에 대한 생체 모방 모델을 만드는 방법의 개발을 설명합니다. 명확한 워크플로우가 설정되었으며 관련 중요한 단계를 식별했습니다. 이러한 중요한 단계에는 피브리노겐 스톡 용액의 제조, 콜라겐으로 인서트를 코팅하고 하이드로겔에 침지된 세포를 파종하는 것이 포함됩니다. 피브리노겐 스톡 솔루션을 준비하는 동안 더 높은 농도에서 더 작은 증분에 피브리노겐을 추가하는 것이 중요합니다. 이것은 피브리노겐이 용해되는 데 걸리는 시간을 줄일 뿐만 아니라 도 11에서볼 수 있듯이 피브리노겐이 일관되고 조기에 겔화되는 것을 방지할 수 있습니다. 피브리노겐 젤의 제조는 상당한 시간이 걸리며 이것은 전반적인 실험 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. 결과는 피브리노겐 젤이 일관되게 젤을 시작하면 그것을 버리는 것이 가장 좋습니다. 인서츠는 콜라겐으로 코팅하고, PBS로 세척하고 하이드로겔에 내장된 세포를 파종하기 전에 라미나르 플로우 후드 내에서 건조되어야 합니다. 인서트가 건조하도록 하지 않으면 하이드로겔이 인서츠 의 가장자리 위로 흘러들어와 균일한 젤이 생성됩니다. 젤의 불균일성은 궁극적으로 확산이 요인인 결과에 영향을 미칩니다.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig11.jpg"> 도 11: 피브리노겐/콜라겐 하이드로겔 제형용 피브리노겐 젤의 제조. (A)덩어리를 형성하고 튜브에 용해되지 않은 피브리노겐을 고수하여 조기에 젤을 형성한 피브리노겐 젤 용액. (B)완전히 용해된 피브리노겐 젤 용액은 용액이 명확하고 약간 점성이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
피브리노겐 성분이 혈소판을 추가하여 교차 연결을 시작하기 때문에 하이드로겔 세포 현탁액을 삽입물에 시드하는 동안 가능한 한 빨리 작업하는 것이 좋습니다.  젤이 시딩하는 동안 교차하는 것을 방지하기 위해 더 높은 농도에서 젤 서스펜션으로 작업할 때 한 번에 더 작은 작업량을 준비합니다. 후자는 각 우물에 시드 된 젤의 분포 와 양에 영향을 미칠 것입니다. 이 프로토콜에서는 구성 요소를 추가하는 순서가 매우 중요하며, 이 프로토콜에서는 젤이 조기에 교차하는 것을 방지하기 위해 간소화된 워크플로우를 제공했습니다.  하이드로겔 젤 서스펜션의 점도로 인해 절단 파이펫 팁으로 작업하는 것은 혼합 및 측정 중에 권장됩니다.  현탁액을 혼합할 때 균일한 서스펜션을 만들기 위해 신속하고 균등하게 수행되도록 합니다. 고르지 않은 혼합은 결과에 부정적인 영향을 미칠 이질성 젤을 초래할 것이며, 그림 12를참조하십시오.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig12.jpg"> 그림 12: 콜라겐/피브리노겐 젤을 12개의 웰 플레이트에 시드했습니다. 모든 젤은 2mg/mL 콜라겐을 함유하는 200 μL의 부피와 2.0 x 106 세포/mL을 함유한 20 mg/mL 피브리노겐으로 시드되었습니다. (A)하이드로겔의 이질적인 일관성, 가시적인 비균일한 하이드로겔을 결합한 하이드로겔겔. (B)하이드로겔이 균질하게 혼합된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
프로토콜 최적화에 따라, 모델은 모델바이오-물속성을 결정하기 위해 평가되었다. 유변학 데이터는 생리학적으로 관련된 세포외 매트릭스 성분, 즉 콜라겐 타입 I 및 피브리노겐으로 구성된 당사의 모델이 섬유성, cirrhotic 및 HCC 간28,29,30,31,32의생체 물리적 특성을 모방할 수 있었다는 것을 보여주었다. HCC에 대 한 3D 모델에서 간 강성을 다시 항복 하는 것은 상당한 중요성이며 종종 모델 개발 하는 동안 간과. 증가 된 간 강성은 HCC38내화학 요법 저항, 증식, 이주 및 휴면과 관련이 있습니다. HCC에서 간 stellate 세포의 활성화는 증가 세포 외 매트릭스 강성과 연관되는 동안, 메카노민증을 보여주는 이러한 간 stellate 세포와 관련된 여러 신호경로와 39.
HCC를 위한 3D 모델의 발달에 있는 간 stellate 세포 및 내피 세포와 같은 기질 관련 세포의 포함은 점점 더 관련성이 되고 있습니다. 연구 결과에 따르면 간 stellate 및 HCC 세포로 구성된 다세포 구체는 PXT 마우스 모델 및 인간 HCC 조직 샘플17과비교했을 때 생체 내에서 HCC 종양 모양을 모방하면서 화학 요법 저항및 침습적 이동을 증가시켰다. 정외에 의한 유사한 연구 결과는, 2017년 간세포 암종(Huh-7) 및 내피(HUVEC) 세포로 구성된 다세포 구엽이 혈관화 및공격성(22)을승진시켰다는 것을 것을을 발견했습니다. 이러한 스페로이드는 Huh-7 단양스페로이드(22)와비교했을 때 독소루비신과 소라페네이브의 상당히 높은 농도에서 생존력을 보였다. HCC의 강성 값과 스트로마 관련 세포(LX2 및 HUVEC)의 포함에 상응하는 강성 값을 가진 독소루비신에 대한 모델의 생존가능성 과 반응에 대한 평가는 2D 공동 배양 모델에 비해 화학요법에 대한 반응에서 유사한 감소를 보였다.  따라서, 일반적으로 환자 및 기타 3D HCC 모델에서 볼 수 있는 약물 내성을 효과적으로 모방한다.
이는 모듈식 시스템이므로 다른 세포외 매트릭스 성분, 라미닌 및 히알루론산의 첨가에 의해 모델을 강화할 수 있다. 대안적으로, 이 모델 내에서 사용되는 현재 하이드로겔은 알기네이트 나트륨 또는 키토산과 같은 합성 하이드로겔로 대체될 수 있다. 현재 모델에 대한 추가 변형은 1차 세포 배양과 세포주를 대체하여 더욱 생리적으로 관련된 모델을 생성하거나 다른 종양 및 기질 세포주 조합을 사용할 수 있다.
우리는 이렇게 성공적으로 HCC에 있는 종양-stroma 상호 작용을 공부하기 위한 조정 가능한 bio-물리적 속성을 가진 3D 모형을 개발했습니다.  우리는 독소루비신에 대한 응답으로 기존의 2D 문화와 비교할 때 생체 내 상황을 보다 대표적인 것으로 나타났습니다. 그러나 아직 해야 할 일이 많으며, 이 모델을 광범위하게 특성화하고 HCC 연구에 남아 있는 더 복잡하고 시급한 질문에 답할 수 있는 가능한 전이성 플랫폼으로 모델을 탐구하기를 희망합니다.

간세포 암 (HCC)은 모든 1 차성 간암1,2의90 %를 포함한다. 매년 810,000명의 사망자와 854,000건의 새로운 사례가 보고되면서 현재 사망률1의가장 높은 발병률 중 하나인 전 세계적으로 다섯 번째로 흔한 암으로 평가받고 있습니다. HCC의 발달은 주로 만성 간 질환, 바이러스 성 간염, 만성 과다 알코올 섭취, 대사 증후군, 비만 및 당뇨병1,3,4와관련된 염증에 기인한다.  이러한 병리학적 조건과 관련된 염증은 섬유증5를개시하기 위해 간세포 와 염증 세포를 활성화하고 모집하는 다양한 사이토카인의 간세포 손상 및 분비를 초래한다. 간 질세포는 간 섬유증의 개시, 진행 및 회귀에 있는 그들의 중요한 역할에 대 한 알려져 있습니다. 활성화시 수축, 프로 염증 및 프로 피브리노겐 성질6,7,8을가진 세포와 같은 근섬유세포로 분화한다. 결과 섬유증은 차례로 세포외 매트릭스 리모델링 효소 활성의 난독증을 일으켜, 성장 인자의 분비를 동반한 전반적인 강성을 특징으로 하는 환경을 조성하여 HCC 병인9,10에더 기여한다. 암 개시, 중간엽 전이(EMT), 혈관신생, 전이성 전위 및 변경된 약물 반응11,12,13에연료를 공급하는 간세포와 기질 환경 사이의 이러한 지속적인 병원성 피드백 루프이다.  종양과 종양 미세 환경 사이의 상호 작용의 관점에서 간근증 발생에 대한 통찰력은, 따라서, 기계론뿐만 아니라 치료 관점에서뿐만 아니라 상당한 중요성이다.
체외 세포 배양 모델의 2차원(2D)은 주로 암세포 생물학자14의80%에 의해 사용된다. 그러나, 이들 모델은 화학요법반응(14,15,16)에영향을 미치는 진정한 종양 미세 환경을 대표하지 않는다. 현재 화학요법 약물의 96%는 임상 시험14시동안 실패한다.  약물 감소율에 있는 이 높은 부각은 시험관 외 사전 검열 모형이 HCC 복잡성 및 마이크로 환경의 우리의 현재 통찰력 그리고 이해를 완전히 나타내지 않는다는 사실에 기인할 수 있습니다16. 반대로 인간에 비해 종양과 미세 환경 간의 상호 작용에 있는 손상된 면역 계통 및 불일치로 존재하는 생체 내 동물모형은 16,17에비하여. 동물 연구에서 얻은 결과의 평균 8%만이 임상 전에서 임상설정(16,17)으로안정적으로 번역될 수 있다. 따라서, HCC의 평가는 종양뿐만 아니라 미세 환경의 복잡성을 효과적으로 재구성하는 체외 플랫폼의 개발이 필요하다는 것이 분명합니다. 이 플랫폼은 현재 사용 가능한 시험관장 전 임상 선별 모델을 보완하고 향후7,14에서동물 연구의 양을 줄일 것입니다.
이러한 플랫폼 중 하나는 고급 3차원(3D) 세포 배양 모델이다. HCC를 연구하는 이러한 고급 3D 모델의 무리가 지난 10 년 동안 등장하고 다양한 리뷰가 출판되었습니다. HCC를 연구하는 사용 가능한 3D 모델에는 다세포 스페로이드, 오르가노이드, 스캐폴드 기반 모델, 하이드로겔, 미세 유체 및 바이오 프린팅이 포함됩니다. 이들 중, 다세포 구체는 종양 발달의 연구에 사용되는 가장 잘 알려진 모델 중 하나입니다. 스페로이드는 낮은 기술적 난이도를 가진 저렴한 모델이며 동시에 생체종양아키텍처(18,19,20)에서효과적으로 모방된다. 다세포 구형은 HCC17,21,22에대한 풍부한 정보에 기여했다. 그러나, 표준화된 배양 시간은 다세포 스페로이드가 7 48일 사이에 배양에 유지되기 때문에 부족합니다. 문화 시간이 증가하는 것은 상당히 중요합니다. Eilenberger는 스페로이드 시대의 차이가 소라페닙 (간암 치료에 사용되는 키나아제 억제제)에 심오하게 영향을 미친다는 것을 발견했습니다(23) 확산성 및독성(23). Wrzesinski와 Fey는 3D 간세포 구체가 트립시화 후 주요 생리적 간 기능을 다시 확립하는 데 18 일이 필요하다는 것을 발견했지만 이 회복 후 최대 24 일 동안 안정적인 기능을 계속 전시하고있으며 24,25.
좀 더 진보된 3D HCC 모델 중 일부는 인간 탈세포화된 간 비계 및 생체 인쇄 비계의 사용을 포함한다. Mazza와 동료는 이식에 적합하지 않은 탈세포 인간 간을 사용하여 HCC 모델링을위한 천연 3D 비계를만들었습니다(26). 이러한 천연 스캐폴드는 콜라겐 타입 I, III, IV 및 섬유넥틴과 같은 주요 세포외 매트릭스 성분의 발현을 유지하면서 간 질및 간 세포종 세포의 공동 배양으로 21 일 동안 성공적으로 다시 채워질 수 있었습니다. 질병 모델링 이외에, 이 모형은 또한 기능성 기관 이식 및 전임상 약물 및 독성스크리닝(26)의이점을 제공한다. 3D 바이오 프린팅의 발전으로 3D 세포 외 매트릭스 스캐폴드는 이제 바이오 인쇄될 수 있습니다.  Ma 및 동료, 세포외 외 세포 매트릭스(27)에서하이드로겔 엔지니어를 사용하여 가변 기계적 특성 및 생물 모방 마이크로 아키텍처를 가진 바이오 인쇄 외세포 매트릭스 스캐폴드. 의심 할 여지없이 이들은 모두 우수한 3D HCC 모델입니다. 그러나, 인간의 간 가용성및 필요한 장비 및 재료 취득에 관련 된 비용 불리 한이러한 모델을 배치. 또한, 이러한 방법은 모든 기술적으로 고급 모든 연구원에 게 쉽게 사용할 수 없습니다 광범위 한 훈련을 필요로.
HCC와 현재 사용 가능한 3D 모델의 복잡성을 바탕으로 모든 것을 포괄하는 3D HCC 모델을 개발하기 위해 노력했습니다. 우리는 조정 가능한 하이드로겔 강성 값을 통합하여 전문체 및 종양 미세 환경을 모두 회수할 수 있는 모델을 목표로 했습니다.  더욱이, 우리는 또한 HCC의 병기에서 중요한 역할을 하는 간세포 세포주 및 기질 관련 세포주를 포함했습니다. 이들은 생리적으로 관련 하이드로겔로 구성된 미세 환경에서 자란 내피 세포, 간질 세포 및 악성 간구세포를 포함합니다. 선택된 하이드로겔, 콜라겐 타입 I 및 피브리노겐을 사용하여 HCC의 개시 및 진행 중에 간 경직에서 볼 수 있는 바이오 물리적 변화에 필적하는 비율로 통합되었습니다.  또한, 우리는 장기간 문화에 보관 할 수있는 모델을 목표로했다. 우리는 기본 장비, 최소한의 교육 및 경험, 쉽게 사용할 수있는 재료로 설정할 수있는 모듈식, 비용 효율적인 모델을 구상했다.

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue (Resazurin sodium salt)</td><td>Sigma</td><td>211-500</td><td>제조사 권장 사항에 따라 준비</td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액 (100&times;), 안정화된</td><td>Sigma</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌 프로테아제 억제제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78432</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C1016-2.5KG</td><td>무수, 과립, &le; 7.0 mm, &ge; 93.0%</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Kebo Biomed 스웨덴</td><td></td><td></td></tr><tr><td>코닝 블랙, 투명 평면 바닥 96-웰 플레이트</td><td>Sigma</td><td>CLS3904-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning HTS Transwell-24 웰 투과성 지원</td><td>Sigma</td><td>CLS3396-2EA</td><td>HTS Transwell-24 유닛 w/ 0.4 &mu; m pore 폴리카보네이트 멤브레인 및 6.5mm 인서트, TC 처리, 멸균, 2/cs</td></tr><tr><td>Discovery Hybrid Rheometer 2</td><td>TA 기기, Sollentuna, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제(LX2 및 HepG2 세포)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965059</td><td>10% v/v FBS 및 1% v/v 항생제 항진균 용액</td></tr><tr><td>보충 내피 세포 성장 배지(500ml)(HUVEC)</td><td>Cell Applications, Inc</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 인증, One Shot 형식, 뉴질랜드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3160902</td><td></td></tr><tr><td>소 플라즈마의 피브리노겐 I-S</td><td>시그마</td><td>F8630-10G</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar 오메가 플레이트 리더</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks의 균형 잡힌 소금 용액</td><td>시그마</td><td>H9394-500ML</td><td>수정됨, 중탄산나트륨, 염화칼슘 및 황산마그네슘 없음</td></tr><tr><td>Labogene scanspeed 416 원심분리기</td><td>Labogene, 스웨덴</td><td></td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>Kebo Biomed 스웨덴</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toledo AG245 분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TMS 광학 현미경</td><td>Nikon, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>제조업체 권장 사항에 따라 준비</td></tr>: <tr><td>쥐꼬리 콜라겐 I형 5mg/mL</td><td>Ibidi</td><td>50201</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Merck</td><td>B619298</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 세포 계수기 </td><td></td> 소 플라즈마에서 나온 BioRad <td></td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td> 카운팅 <td>슬라이드 Sigma</td><td>T9549</td><td>Powder, 세포 배양에 적합, &ge; 1,500 NIH 단위/mg 단백질(E1%/280 = 19.5)</td></tr><tr><td>트립신(2.5%) 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 글리신 최대(대두)의 PBS 트립신 억제제<td>에서 1배로 희석</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>T6414-100ML</td><td>용액, 멸균 여과</td></tr></tbody></table>

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3d 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

간 세포 암 (HCC) 만성 간 질환의 여파로 개발 하는 기본 간 종양. 만성 간 질환과 염증은 간장암 발생을 적극적으로 지원하고 운전하는 섬유성 환경으로 이어집니다. 종양 기질 미세 환경과 종양 세포 사이의 상호 작용의 관점에서 간장 암분 발생에 대한 통찰력은 따라서 상당한 중요성이다. 3차원(3D) 세포 배양 모델은 현재 시험관 내 2D 세포 배양 모델과 생체 내 동물 모델 사이의 누락된 링크로서 제안된다. 우리의 목표는 섬유질 기질 구획과 혈관과 함께 새로운 3D 생체 모방 HCC 모델을 설계하는 것이었습니다. 콜라겐 및 피브리노겐과 같은 생리학적으로 관련된 하이드로겔은 종양 ECM의 생체 물성을 모방하기 위해 통합되었다. 이 모델에서 LX2 및 HepG2 세포는 하이드로겔 매트릭스에 내장되어 반전된 대막 인서트에 시드하였다. HUVEC 세포는 그 때 막의 반대쪽에 시드되었다. 세포에 내장된 ECM-하이드로겔로 구성된 3개의 제형이 제조되었고, 바이오-물체성질은 유경학에 의해 결정되었다. 세포 생존가능성은 21일 동안 세포 생존성 분석에 의해 결정되었다. 화학요법 약물 독소루비신의 효과는 72시간 동안 2D 공동 배양및 3D 모델 모두에서 평가되었다. 유변학 결과는 섬유증, cirrhotic 및 HCC 간의 생체 물리적 특성이 성공적으로 모방될 수 있다는 것을 보여줍니다. 전반적으로, 결과는 이 3D 모델이 전통적인 2D 배양에 비해 생체 내 상황을 더 대표한다는 것을 나타낸다. 우리의 3D 종양 모형은 HCC 환자에서 전형적으로 보인 약 저항을 모방하는 화학요법에 감소된 반응을 보여주었습니다.

농도 범위 및 시드 볼륨 최종 기능 프로토콜을 얻기 위한 프로토콜 최적화는 도 3에제시된 회로도도에 따라 일어났다. 2개의 생리학적 관련 하이드로겔, 콜라겐 타입 I 및 피브리노겐은 문헌검색(35,36)을통해 확인되었다.  쥐 꼬리 콜라겐 유형 I로 시작하여, 농도의 범위 (4, 3, 2 및 1 mg/mL)는 다시 한 번 반전 된 삽입에 성공적으로 부착 할 수있는 능력을 결정하기 위해 반전 인서트에 시드되었다. 이 범위 내의 모든 농도는 젤을 형성할 수 있었지만, 콜라겐 젤은 평평해 보였고 처리 및 파이펫팅으로 인해 다양한 기포가 그 안에 갇혀 있었으며, 도 4 및 도 5를참조하십시오. 콜라겐 겔의 품질을 향상시키기 위한 최적의 파종 부피를 결정하기 위해, 다양한 파종부(100, 150 및 200 μL)를 반전 된 인서트에 시드하였고, 도 5를참조하십시오.  시드 볼륨은 젤의 출현이나 젤 내의 거품의 존재에 영향을 미치지 않았다. 이에 따라, 200 μL이 가장 완전한 젤을 생산하는 최적의 종자 부피라고 결정되었다. 피브리노겐은 또한 장기간 인서트를 부착할 수 있는 젤을 생산하는 능력에 대해 평가되었다.  농도 범위(70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/mL)를 12웰 플레이트의 뚜껑에 200 μL의 부피로 제조 및 시드하였다, 도 6을참조한다. 모든 농도를 시드 후 20 분 이내에 성공적으로 젤을 형성 할 수 있었다. 그러나, 농도 5 및 1 mg/mL은 형성된 겔이 일관성과 같은 유체를 가지고 있고 37°C에서 하룻밤 동안 보관된 후 뚜껑에서 분리되기 시작했기 때문에 배제되었다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig3.jpg"> 그림 3: 프로토콜 최적화의 회로도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig4.jpg"> 도 4: 콜라겐 젤 4 mg/mL 포함 1.0 x 105 세포/mL 에 시드 된 삽입에 젤에 존재하는 거품을 보여주는. 왼쪽에 삽입된 것은 15분 동안 얼음 위에 탈가스가 있었고, 오른쪽에 삽입된 것은 탈가스가 없습니다. 탈기는 젤에 존재하는 기포에 어떤 영향도 미치지 않았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig5.jpg"> 그림 5: 콜라겐 젤 4 mg/mL 포함 1.0 x 105 셀/mL 다양한 볼륨의 인서츠에 시드. (A)시드 직후 왼쪽 100 μL, 중간 150 μL 및 오른쪽 200 μL에 삽입합니다. 젤의 거품은 여전히 존재했다. (B)60분 크로스링크 후 왼쪽 200 μL, 중간 150 μL 및 오른쪽 100 μL에 삽입한다. 볼륨에 관계없이 모든 젤은 여전히 평평하게 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig6.jpg"> 그림 6: 12웰 플레이트의 뚜껑에 시드된 70~1mg/mL의 농도 범위에서 피브리노겐(200 μL). (A)시드 직후에 젤. (B)시드 후 20분 젤. (C)젤은 하룻밤 동안 보관. 모든 젤은 잘 둥근 나타납니다, 5 mg/mL 및 1 mg/mL 젤 그들은 더 유동적인 농도를 가지고 등장으로 제외 되었다 20 시드 후 분 하룻밤 유지 되 고 뚜껑에서 분리 하기 시작 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
조합 콜라겐과 피브리노겐 콜라겐 및 피브리노겐 농도 범위의 결과에 기초하여 콜라겐과 피브리노겐을 결합하는 효과를 평가하였다. 3개의 삽입은 다음, 4 mg/mL 콜라겐, 20 mg/mL 피브리노겐 및 콜라겐 (4 mg/mL) 및 피브리노겐 (20 mg/mL)의 1:1 배급을, 도 7을참조하십시오. 하이드로겔을 파종한 직후, 콜라겐을 직접 삽입한 것은 겔 내의 거품 발생과 결합된 평평한 외관을 가지고 있음을 관찰했습니다. 피브리노겐을 가진 인서트가 풀고 둥근 젤을 생산했기 때문에 콜라겐과 피브리노겐의 조합으로 인서트를 했습니다. 60분 동안 37°C에서 교차 연결한 후, 모든 젤은 인서트에 부착되어 있었고, 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션에 부착되어 있었다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig7.jpg"> 그림 7: 콜라겐과 피브리노겐의 조합의 효과. (A)콜라겐 4 mg/mL 시드는 왼쪽에 인서트를 삽입하고, 피브리노겐 20 mg/mL은 중앙및 콜라겐 4 mg/mL, 피브리노겐 20 mg/mL(1:1 ration)에 삽입하여 오른쪽에 삽입하였다. 1.0 x 105 세포/mL을 함유한 200 μL의 부피로 시드된 모든 젤은 37°C에서 60분 동안 교차연결되었다(B) 콜라겐 4 mg/mL 60분 교차 후 겔이 평평하게 나타났고 거품이 있었다. (C)왼쪽 피브리노겐 20 mg/mL에 삽입하고, 겔이 둥글게 나타나고, 거품이 없고, 오른쪽 콜라겐 4 mg/mL, 피브리노겐 20 mg/mL 젤에 삽입하고, 겔은 거품없이 잘 둥글게 된다. (D)콜라겐 4 mg/mL 젤은 37°C에서 하룻밤 동안 보관된 후, 겔은 여전히 많은 양의 거품을 포함하고 있으며, 겔의 일부 부종이 발생하였다. (E)피브리노겐 20 mg/mL은 37°C에서 하룻밤 동안 보관되어 있습니다.(F)콜라겐 4 mg/mL, 피브리노겐 20 mg/mL 젤은 37°C에서 하룻밤 동안 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig7large.jpg" target="_blank">보관되어 있습니다.</a>
세포 종자 밀도 결정 하이드로겔과 함께 작업한 이전의 경험을 바탕으로 최적의 세포 시싱 밀도(도시되지 않은 데이터)를 결정하기 위한 실험이설정되었다(37). 세포는 콜라겐과 피브리노겐의 조합으로 다음과 같은 농도 범위(7.5 x 105,8.5 x 105,9.5 x 105,1.0 x 106,1.5 x 106 및 2.0 x 106 세포/mL), 2.0 x 10 6 세포/mL, 2.0 x 106 세포/mL의 조합으로 포함되었다.
경채학 피브리노겐 및 콜라겐 하이드로겔 조합의 10가지 제형은 유경학을 통해 평가하였고, 표 2를참조하였다. 목표는 이러한 제제 중 HCC 의 발달 중에 볼 수있는 간 강성을 모방 할 수있는 결정이었습니다. 문헌은 섬유증, 간경변 및 HCC 동안 쥐, 마우스 및 인간에게 알려진 간 강성 값을 제공했으며, 목표는 이러한값(28,29,30,31,32)에최대한 가까워지는 것이었다. 표 2에 명시된 10개의 제형은 각각의 트리플리케이트및 저장계를 사용하여 제조되었고, 결과는 도 8에도시되었다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>정립</td>
			<td>피브리노겐 (mg/ml)</td>
			<td>콜라겐 (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 경직성 값을 결정하기 위해 유경학과 평가된 다양한 농도의 콜라겐 및 피브리노겐 조합
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig8.jpg"> 그림 8: 유경학으로 평가된 다양한 농도에서 콜라겐 및 피브리노겐 조합에 대한 하이드로겔 강성 값. 스토리지 계수 및 손실 계둘루는 디스커버리 HR-2 하이브리드 Rheometer(n= 3, 오류 막대 = SD)를 통해 37°C 및 1Hz에서 결정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 10개의 수식에서 3개가 선택되어 진행했습니다. 여기에는 섬유증 발병 시 간 강성 값에 해당하는 2 mg/mL 콜라겐 타입 I 및 10 mg/mL 피브리노겐, 2 mg/mL 콜라겐 타입 I 및 2 mg/mL 콜라겐 타입 I 및 40 mg/mL 피브리노겐이 포함되었다.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig9.jpg"> 도 9: 다양한 피브리노젠/콜라겐 하이드로겔 제형에 대한 하이드로겔 강성 값을 계속 선택하였다.  스토리지 계둘루 및 손실 계둘루는 37°C 및 1Hz(n= 3, 오류 막대 = SD)로 결정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
생존가능성, 약물 반응 및 전이성 전위 AlamarBlue 분석의 결과는 2D 공동 배양 내에서 전체적인 감소된 세포 생존가능성을 보였으며, 알려진 보고된 IC 25, 50 및 75값에 기초하여 예상보다 낮으며, 처리되지 않은 대조군과 비교했을 때 도 10을참조하십시오. 이것은 Doxorubicin 처리에 더 민감한 우리의 공동 배양에 있는 LX2 세포에 기인할 지도 모릅니다. 그러나, 우리의 3D 모형에서 우리는 3D 모형 시스템에서 수시로 보인 화학요법 잠재력에 있는 감소를 확인하는 독소루비신 저항에 있는 그리고 증가했습니다. 대조군과 비교한 통계적 유의성은 학생 T 시험(두 꼬리)을 사용하여 평가되었으며, P&amp;05는 유의하다고 판단되었습니다.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig10.jpg"> 도 10: 72h의 기간 동안 다양한 농도에서 Doxorubicin을 치료한 후 3D 모델에 비해 2D 공동 배양 모델의 백분율 세포 생존가능성. 처리되지 않은 컨트롤(n=3, 오류 막대 = SD)에 비해 정규화된 결과(* = p&amp;0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
겔 구조는 하이드로겔의 상이한 농도 내에서 세포 성장을 따르기 위해 가벼운 현미경을 사용하여 매일 육안으로 검사되었다. 세포는 균일하고 컴팩트한 방식으로 하이드로겔을 채웠으며, 7일째부터 스페로이드가 매트릭스 내에서 조립되기 시작했습니다.

이 프로토콜은 섬유성 기질 구획을 동반한 3D 생체 모방 모델을 제공합니다. 생리학적으로 관련된 하이드로겔을 사용하여 기질 세포 외 매트릭스의 생체 물성 특성, 세포 상호 작용, 종양 성장 및 전이의 활성 중재자를 모방합니다.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

이 모델은 생리학적으로 관련된 하이드로겔과 조정 가능한 강성, 간세포 및 기질 관련 세포주를 통합하여 전악성 및 종양 미세환경을 모두 요약합니다. 이 모델은 모듈식이고 비용 효율적이며 기본 장비와 쉽게 구할 수 있는 재료로 준비할 수 있으며 복잡한 종양-기질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 종양-기질 상호 작용 모델은 간암 발생에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.그리고 이것은 기계론적 관점과 치료 관점 모두에 매우 중요합니다. Carlemi Calitz와 함께 절차를 시연하는 것은 Angstrom 실험실의 박사 과정 학생인 Jenny Rosenquist가 맡을 것입니다. 10밀리리터 피브리노겐 원액 80밀리리터를 준비하려면 먼저 2.21그램의 염화칼슘과 5밀리그램의 아프로티닌을 20밀리리터의 증류수에 첨가합니다.그런 다음 2.051ml의 아프로티닌 원액과 100마이크로리터의 염화칼슘 원액을 7.849ml의 PBS에 추가합니다. 다음으로, 교반하거나 흔들지 않고 용액에 피브리노겐 800mg과 염화나트륨 200mg을 점진적으로 첨가하고 피브리노겐 원액 튜브를 셰이커에 수평으로 놓습니다. 분당 300회전으로 2-5시간 동안 진탕한 후 결과 용액을 여과하여 준비 중에 형성된 덩어리를 제거합니다.세포 배양 인서트 콜라겐 코팅의 경우, 생물 안전 캐비닛에서 멸균 핀셋을 사용하여 인서트를 세포 배양 플레이트의 뚜껑에 뒤집습니다. 다음으로, 115마이크로리터의 빙초산과 25밀리리터의 증류수를 혼합한 후 여과하기 전에 추가 증류수로 용액을 100밀리리터의 최종 부피로 조정합니다. 2밀리리터의 100마이크로그램 콜라겐 용액을 준비하려면 40마이크로리터의 밀리리터당 5밀리그램 콜라겐 용액을 20밀리리터의 빙초산 원액 1.9ml에 첨가합니다.생성된 콜라겐 용액 100마이크로리터를 각 삽입물의 바닥에 추가합니다. 인서트가 건조되면 인서트 위에 맞춤형 3D 프린팅 스페이서를 놓습니다. 2-3시간의 공기 건조 후, 세척당 웰당 1밀리리터의 신선한 PBS가 들어 있는 12웰 플레이트의 개별 웰에 콜라겐 코팅 면이 아래로 향하게 하여 인서트를 잠시 배치하여 세척합니다.마지막 세척 후 인서트를 플레이트 뚜껑에 다시 놓고 1-2시간 동안 공기 건조합니다. 그런 다음 거꾸로 된 삽입물을 플레이트 바닥으로 덮고 삽입물을 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 세포를 파종하기 전에 증류수 100ml에 수산화나트륨 3.99g을 넣고 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통해 용액을 여과합니다.다음으로, T175 간성상 및 간암 세포 배양액을 세척당 10ml의 PBS로 2회 세척한 후 섭씨 37도에서 4분 동안 6ml의 트립신으로 세포를 처리합니다. 세포가 분리되면 섭씨 37도 10%DMEM의 6밀리리터로 효소를 비활성화하고 각 세포 배양을 개별 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 원심분리로 세포를 침전합니다.그리고 튜브당 예열된 10%DMEM 5밀리리터에 펠릿을 재현탁시킵니다. 계수 후 두 세포 집단을 중간 농도의 밀리리터당 10에서 6번째 세포로 희석하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 상등액을 제거한 후, 표에 나타난 바와 같이 예열된 10%DMEM을 적정량의 세포에 첨가하고 섭씨 4도의 수산화나트륨 밀리리터당 10마이크로리터로 섭씨 4도의 콜라겐을 적정량의 중화합니다.냉각된 중화 콜라겐을 세포 현탁액에 추가합니다. 매체가 노란색으로 바뀝니다. 현탁액을 절단된 피펫 팁과 완전히 혼합하면 배지가 밝은 분홍색으로 변합니다.표에 표시된 대로 적절한 양의 섭씨 37도의 피브리노겐을 추가하고 절단된 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 완전히 혼합합니다. 혼합 후 각 튜브에 피브리노겐 10mg당 0.1kg 국제 단위의 트롬빈을 추가하고 수정된 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 삽입물의 바닥에 200마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 플레이트의 바닥 부분을 젤 위에 부드럽게 놓기 전에 실온에서 15분 동안 겔을 가교한 다음 삽입물을 인큐베이터에 넣어 섭씨 37도에서 45분 동안 추가 가교를 수행합니다.배양이 끝나면 인서트를 12웰 플레이트의 개별 웰에 넣고 각 웰에 예열된 10%DMEM 2밀리리터를 추가합니다. 삽입물에 내피 세포를 파종하려면 시연된 바와 같이 섭씨 37도의 트립신으로 세포를 분리하기 전에 10ml의 PBS로 T175 인간 혈관 내피 세포 배양물을 세척합니다. 계수를 위해 5 밀리리터의 내피 성장 배지에 세포를 재현탁하고 세포를 내피 성장 배지 농도의 밀리리터당 10 내지 4 번째 세포로 재현탁합니다.그런 다음 각 삽입물의 상단에 500마이크로리터의 세포를 추가하고 플레이트를 21일 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 겔 형성의 저장 계수를 측정하려면 파종(seeding) 60분 후 레오미터를 사용하여 스테인리스강 형상의 8mm 직경 평행판을 사용하여 0.1N의 일정한 축력으로 0.26% 및 섭씨 37도에서 0.1Hz에서 20Hz까지 주파수 스윕을 수행합니다. 이 대표적인 분석에서는 피브리노겐 및 콜라겐 하이드로겔 조합의 10가지 제형을 준비하여 간세포 암종 발병 중에 관찰된 것과 유사한 간 경직도를 모방할 수 있는 제형을 결정했습니다.그런 다음 각 농도의 저장 탄성률을 레오미터를 사용하여 측정했습니다. 이 10가지 공식에서, 섬유증 발병 시 간 경직 값에 해당하는 콜라겐 1형 1 - 10 밀리그램 당 10 밀리그램, 간경변에 해당하는 콜라겐 유형 1 밀리리터당 2 밀리그램 내지 30 밀리그램, 콜라겐 유형 1 밀리리터당 2 밀리그램 및 간세포 암종에 해당하는 피브리노겐 밀리리터 당 40 밀리그램을 선택하였다. AlamarBlue 분석은 2D 공동 배양 내에서 전반적으로 감소된 세포 생존율을 보여주었으며, 이는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 알려진 보고된 억제 농도 값을 기반으로 예상보다 낮았습니다.그러나 3D 모델에서는 독소루비신 내성의 증가가 관찰되었습니다. 하이드로겔 세포 현탁액을 삽입물에 파종할 때 간소화된 워크플로우가 프로토콜의 성공에 필수적이므로 신속하게 조치를 취해야 합니다. RNA 및 단백질 분리 기술을 최적화하면 전사 및 번역 수준에서 종양-기질 상호 작용을 추가로 연구할 수 있습니다.

a-biomimetic-model-for-liver-cancer-to-study-tumor-stroma

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

테스트 시스템으로 인간의 3D 종양 조직을 만들 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 decellularized 생물 혈관을 비계 (BioVaSc), 인간의 기본 세포와 흐름 생물 반응기의 동적 조건에서뿐만 아니라 정적에서 배양 할 수있는 종양 세포 라인을 기반으로합니다.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

비소세포폐암(NSCLC) 표적 치료에 대한 민감도를 연구하기 위해 생물학적 콜라겐 골격을 기반으로 하는 3차원(3D) 폐암 모델을 제시합니다. 우리는 증식 지수, 세포사멸 및 상피-중간엽 전이(EMT) 상태를 결정하기 위해 다양한 판독 기술을 보여줍니다. 수집된 데이터는 약물 민감성 예측을 위해 인실리코(in silico) 모델에 통합됩니다.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

우리는 산소와 영양분을 전달하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용하여 배양할 수 있는 3D 유방암 대리모를 생성하는 방법을 시연합니다. 성장 후, 대리모는 관심 매개변수의 평가를 위해 고정되고 파라핀으로 처리됩니다. 이러한 매개 변수 중 하나 인 세포 밀도의 평가가 설명됩니다.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

종양 세포와 기질 섬유아세포의 이질적 상호작용에 기초한 새로운 3차원 스페로이드 모델이 확립된다. 여기에서, 우리는 spheroids의 대형을 구상하기 위하여 종양 세포 및 기질 섬유아세포, 시간 경과 화상 진찰 및 공초점 현미경 검사법의 공동 배양제시합니다. 이 3차원 모델은 종양-기질 상호 작용을 연구하고 암 치료제를 테스트하는 적절한 플랫폼을 제공합니다.

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

이 프로토콜의 목표는 약물 선별 연구에 사용될 수 있는 3D 유방 내피 상양 모델을 빠르게 만들기 위해 사전 형성된 내피 네트워크에 다세포 스페로이드로서 유방 상피 세포를 직접 바이오프린트하는 것입니다.

내피 네트워크에 3D 다세포 유방 스페로이드의 직접 생체 인쇄

결장직장암(CRC) 오가노이드의 포털 정맥 주사는 스트로마가 풍부한 간 전이를 일으킨다. CRC 간 전이의 이러한 마우스 모델은 종양-스트로마 상호작용을 연구하고 아데노-관련 바이러스-매개 유전자 요법과 같은 신규한 스트로마-지시 치료제를 개발하는데 유용한 도구를 나타낸다.

간 전이 스트로마를 연구하기 위해 대장암 오가노이드의 포털 정맥 주사

관련 인간 질병을 충실하게 재구성하는 포괄적인 체외 모델은 부족합니다. 현재 연구는 인간 간세포 암에서 종양 기질 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수있는 체외 도구인 3차원 (3D) 종양 스페로이드 생성 및 문화를 제시합니다.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

오가노이드는 장기 개발, 약물 발견 및 질병 연구를 위한 맞춤형 조직 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 오가노이드 엔지니어링은 복잡한 합성 조직을 만드는 것으로 발전합니다. 목표는 형태 형성, 조립체 기술 및 생체 매트릭스를 통합하여 조직 공학을 발전시키는 것입니다. 이 프로토콜은 간 기관 형성을 모델링하고 합성 조직 구축에 대한 지침을 수립하는 데 도움이 됩니다.

인간 세포주를 사용하여 간 기관 형성 모델링, 조립체 구축 및 합성 조직 설계를 위한 체외 배양 기술

학습하세요 간암 연구를 위한 3D 생체 모방 모델로 종양-스트로마 상호 작용을 분석하는 방법입니다. 조절 가능한 하이드로겔 강도와 간 세포주를 활용하여 간암 발생 기전과 치료 전략에 대한 통찰을 제공합니다.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

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