Name: 메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 메틸살리실레이트 클리어링과 3D 이미징을 활용한 쥐와 인간 백색 지방 조직의 구조 분석 방법입니다. 이 기술은 혈관, 면역 세포, 지방 방울을 시각화하여 대사 질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 INSERM에 의해 지원되었다, 유니버시테 코트 다쥐르( Côte d'Azur)와 프랑스 국립연구청(ANR)의 보조금으로 퓨처 라벡스 시나라이프(ANR-11-LABX-0028-01), 아카데미 2 "시스테메스 컴플렉스" 및 아카데미 4 "비벤테"를 통해 프로그램 UCA JEDI(ANR-15-IDEX-01) 라 레체르체 메디칼(에키페 FRM DEQ20180839587)과 J.G.(ANR18-CE14-0035-01-길러론)에 대한 젊은 조사 프로그램 도 쏟아졌다. 또한 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 감사드리며, IBISA 현미경 및 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원합니다. 우리는 조직 준비에 기술적 인 도움을 매리언 두소트 감사합니다. 우리는 애비 컷트리스, UCA 국제 과학 가시성, 원고의 증거 읽기에 감사드립니다.

이 프로토콜은 테스트되었으며 모든 마우스 및 인간 흰색 지방 조직 창고에 대해 검증되었습니다. 인간과 마우스 조직 조직은 유럽 법률에 따라 수집및 프랑스와 스웨덴 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 마우스와 인간의 흰색 지방 조직의 고정
<ol><li>수확한 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직을 15mL 플라스틱 튜브에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 PBS의 최소 10mL에 담급니다.</li>
	<li>1 시간 동안 압연 접시에 실온에서 플라스틱 튜브를 흔들어.</li>
	<li>플라스틱 튜브를 하룻밤 동안 롤링 플레이트에 4°C로 두고 고정을 완료합니다. 참고: 본 프로토콜은 마우스로부터 얻은 전체 부피지방 패드와 같은 대형 지방 조직 샘플에 적응되어 정상적인 식단을 공급합니다(≈250 mg - ≈0.6 cm3). 쥐로부터 얻은 고지방 지방 패드(≈1.5g-≈4cm3)또는 인간 지방 조직 샘플을 공급한 고지방 지방 패드와 같은 더 큰 시료의 경우, 클리어링 프로토콜은 전체 샘플(PFA 및 항체 혼합물을 스케일업하여)에 완벽하게 작동해야 하지만, 일반적으로, 1g(≈2.5cm3)주위의 조직 조각을 절단하여 추가 적인 시료를 예비합니다. PFA (단계 1.1.)의 경우 조직의 약 10 배 의 부피를 사용하는 것이 좋습니다. 항체 혼합물의 경우(3.1단계 및 3.4.) 부피를 증가시키고, 조직이 1.5mL 플라스틱 마이크로튜브에 너무 큰 경우 15mL 플라스틱 튜브(재료표참조)를 사용한다(재료표참조).</li>
</ol>2. 마우스와 인간의 백색 지방 조직의 투과 및 포화
<ol><li>PFA의 모든 흔적을 제거하기 위해 실온에서 5 분 동안 PBS의 10 mL에서 고정 된 흰색 지방 조직을 헹구는다.</li>
	<li>0.3% 글리신(재료표참조)으로 보충된 15mL 의 PBS 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 분당 100회전(rpm)에서 1시간 동안 궤도 셰이커에서 실온에서 튜브를 흔들어 나머지 자유 알데히드 군을 담급니다.</li>
	<li>0.2% 트리톤 X-100(재료표 참조)으로 보충된 15mL 의 PBS를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 100rpm에서 2시간 동안 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 튜브를 흔들어 줍니다. Table of Materials</li>
	<li>0.2% 트리톤 X-100 및 20% DMSO(재료표참조)로 보충된 15mL 의 PBS를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 밤새 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 튜브를 흔들어 줍니다.</li>
	<li>0.1% Tween-20(재료표 참조), 0.1% 트리톤 X-100, 0.1% 데옥시콜레이트(재료표 참조) 및 20% DMSO(재료표 참조) 및 20%의 DMSO에서 튜브를 흔들어 온도 조절식 암울 의 경우 10mL의 PBS가 함유된 15mL 플라스틱 튜브에 침수하고, 20%의 DMSO에서 튜브를 흔들어 온도 조절식 궤도 흔들림 을 20시에 20°C로 흔들었다. Table of Materials Table of Materials</li>
	<li>0.2% Triton X-100으로 보충된 PBS의 10mL를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고 100 rpm에서 궤도 셰이커에서 실온에서 튜브를 흔들어 1 h.</li>
	<li>0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO 및 3% BSA(재료표 참조)로 보충된 15mL 의 Table of MaterialsPBS 를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 12시간 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 튜브를 37°C로 흔들어, 특별히 비항체를 사용할 수 있는 부위를 포화시한다. 참고: 2.7 단계에서, BSA는 사용되는 이차 항체의 종의 혈액 혈청에 의해 대체될 수 있다.</li>
</ol>3. 마우스와 인간의 흰색 지방 조직에 대한 염색 절차
<ol><li>PBS의 300 μL을 함유한 1.5mL 플라스틱 마이크로튜브로 조직을 전송하여 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO, 3% BSA 및 1차 항체(극저온분 염색에 대한 것보다 10배 더 농축되지만 최적의 항체 농도는 각 항체에 대해 평가되어야 한다). 알루미늄 호일로 덮어 로부터 튜브를 보호하고 적어도 이틀 동안 100 rpm에서 온도 제어 궤도 셰이커에서 37 °C에서 튜브를 흔들어 (단계 1.1 및 단계 3.7.1의 노트 참조).</li>
	<li>15mL의 PBS를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충하고 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호된 튜브를 5시간 동안 100rpm에 온도 조절 궤도 셰이커로 흔들어 줍니다. 이 단계를 두 번 수행합니다.</li>
	<li>1박 2일 동안 1박 2일 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 0.2% Triton X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충된 PBS10mL의 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고, 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 1박 2일 동안 1박 2일 동안 1박 2일 동안 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 진동을 조절한다.</li>
	<li>조직을 PBS의 300 μL을 함유한 1.5mL 플라스틱 마이크로튜브로 옮기는 것은 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO, 3% BSA 및 이차 항체(극저온염색보다 10배 더 농축)로 보충하였다. 알루미늄 호일로 덮어 로부터 튜브를 보호하고 적어도 이틀 동안 100 rpm에서 온도 제어 궤도 셰이커에서 37 °C에서 튜브를 흔들어 (단계 1.1 및 단계 3.7.1의 노트 참조).</li>
	<li>PBS의 10mL를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고 0.2% 트리톤 X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충되어 5h의 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 줍니다. 이 단계를 두 번 수행합니다.</li>
	<li>1박 2일 동안 1박 2일 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 0.2% Triton X-100, 10% DMSO 및 3% BSA로 보충된 PBS15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구십시오.</li>
	<li>10mL의 PBS를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에서 조직을 헹구고, 2시간 동안 100rpm의 온도 조절 궤도 셰이커에서 37°C에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 줍니다. 참고: 핵 이나 액틴과 같은 특정 구조의 라벨링에 대 한, 추가 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI 또는 동등한) 및/또는 형광 표표-phalloidin 단계에서 추가 해야 3.1. 형광으로 만 표기 된 1 차적인 항체가 사용되는 경우, 또는 단계에서 3.4. 이차 항체가 사용될 때. 참고: 염색 절차의 경우, 이미 플루오로크롬(유동 세포측정에 사용되는 것과 같은)으로 컨쥬게이트된 1차 항체를 사용할 수 있으며 시간과 특이성을 얻기 위해 권장합니다. 실제로, 마우스 1차 항체가 이차 항마우스 항체에 의해 사용될 수 있더라도, 여기서 입증했듯이, 우리는 종종 순환면역글로불린으로 인한 혈관의 비특이적 염색을 관찰했다. 따라서, 이 문제점을 피하기 위하여는, 이미 표지된 1 차적인 항체는 높게 추천되고 여기에서 우리는 유동 세포측정에 사용된 항체가 우리의 절차와 호환된다는 것을 증거를 제공합니다. 그러나, 낮은 수준에서 발현되는 항원의 특정 한 경우, 이차 항체를 통한 신호 증폭 단계가 필수적이다. 유일한 유효한 1 차항체가 마우스에서 만들어지면, 희생시 적어도 5 분 동안 PBS를 가진 마우스의 심관류는 순환 면역 글로불린의 큰 비율을 제거하고 따라서 비 특이적 염색을 제거할 수 있다.</li>
</ol>4. 마우스 및 인간 흰색 지방 조직에 대한 클리어링 절차
<ol><li>15mL 플라스틱 튜브에 50% 에탄올10mL이 들어있는 튜브를 침전하고 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 100rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 흔들어 줍니다.</li>
	<li>15mL 플라스틱 튜브에 70% 에탄올이 들어 있는 15mL 플라스틱 튜브에 침을 을 채우고, 2시간 동안 100rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 보냅니다.</li>
	<li>95%의 에탄올10mL를 함유한 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 담그고, 2시간 동안 100rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 보냅니다.</li>
	<li>100% 에탄올10mL가 들어있는 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 담그고 빛으로부터 보호되는 튜브를 2시간 동안 100rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 흔들어 줍니다.</li>
	<li>100% 에탄올10mL의 10mL를 포함하는 15mL 플라스틱 튜브에 조직을 침수하고 밤새 100 rpm의 궤도 셰이커의 실온에서 빛으로부터 보호되는 튜브를 흔들어 줍니다.</li>
	<li>화학 후드 아래 메틸 살리실레이트 5mL(재료 표 참조)가 들어있는 플라스틱 캡(재료 표참조)이 있는 20mL 유리 병에 조직을 담그고 빛으로부터 보호된 유리 용기를 2시간 이상 100rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 흔들어 주세요. 참고: 4.3단계를 피함으로써 클리어링 절차가 크게 가속화될 수 있습니다(필요한 경우). 및 4.5., 최종 클리어링 품질은 약간 감소 될 것이지만.</li>
</ol>5.3D 클리어 된 백색 지방 조직의 공초점 화상 진찰
<ol><li>화학 후드 아래 유리 바닥 (재료의 표참조)가 장착 된 금속 이미징 챔버로 조직을 전송하고 신선한 메틸 살리실레이트로 챔버를 채웁니다. 참고: 조직을 제자리에 고정시키고 챔버에서 옆으로 부동하거나 움직이지 않도록 하려면 챔버에 장착할 때 조직 위에 18mm 둥근 유리 커버립(재료 표참조)을 적용하십시오.</li>
	<li>반전된 공초점 현미경에 이미징 챔버를 놓습니다.</li>
	<li>낮은 배율 목표(예를 들어, 4배 목표)를 사용하여 조직을 이미지화하여 전체 지방 조직 또는 인간 조직 샘플의 몇 cm3 3D 맵을 생성한다.</li>
	<li>더 높은 배율에서 조직 샘플링을 위한 몇몇 지역을 선택합니다. 일반적으로 해상도와 깊이 사이의 좋은 비율을 제공하는 20배 의 장거리 공기 목표를 사용합니다. 600~2000μm 깊이 의 z-스택이 있는 대형 모자이크 이미지를 획득합니다. 참고: 장거리 목표를 사용하여 조직에 더 깊이 이미지를 적용합니다.</li>
</ol>6. 3D 지방 조직 이미지에서 정량적 결과의 추출
참고: 5지점에서 생성된 3D 이미지 스택으로부터의 상이한 구조의 세분화 및 후속 추출은 상업적 또는 프리웨어 중 많은 기존 이미지 분석 소프트웨어 옵션을 사용하여 수행할 수 있다. 다음 지점에서는 상용 소프트웨어를 사용하여 3D 지방 조직 이미지에서 정량적 정보를 추출하는 데 일상적으로 사용되는 전략을 설명합니다(재료 표참조).
<ol><li>3D 스택을 소프트웨어 형식으로 변환하여 메모리 공간을 확보합니다.</li>
	<li>셀을 분할합니다.<ol>
<li>소프트웨어의 셀 모듈을 엽니다.</li>
		<li>세포 검출 설정을 플라즈마 멤브레인 염색으로 변경합니다.</li>
		<li>세포 주변을 묘사하는 데 사용되는 마커의 형광 채널을 선택하십시오(대식대식용 F4/80과 같은 피질 액틴 또는 플라즈마 멤브레인 마커를 라벨로 표시하는 phalloidin, T 세포를 위한 TCR-β 또는 면역 세포 특수형에 특이적인 분화 CD 단백질의 클러스터).</li>
		<li>임계값을 설정하고 예상 셀 크기범위(즉, 세포 검출을 위한 1~200 μm)를 제공합니다.</li>
		<li>분할을 실행합니다. z-스택에 대응하는 부피는 각 이웃 셀에 대해 다른 색상으로 색으로 구분된 분할된 셀로 생성됩니다.</li>
		<li>통계 탭에 통계 필터(크기, 둥글림, 원형 등)를 적용하여 세분화 된 아티팩트를 제외하거나 세그먼트 된 세포를 크기에 따라 관심 있는 셀로 미세 조정합니다 (즉, 20-200 μm 대식세포용, 대식세포용 1-3 μm).</li>
		<li>통계 탭에서 측정 및 정량 적 데이터(볼륨, 수, 크기, 직경 등)를 추출합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 성분(핵, 소포 등) 또는 혈관을 구조로 분할한다. 참고: 필라멘트 분할은 선박의 연결을 연구하는 데 매우 유용하지만, 우리는 선박의 크기, 부피 및 직경에 대한 데이터를 추출하기 위해 표면 모듈 세분화를 사용합니다. 실제로 필라멘트 모듈을 사용할 때 선박의 크기가 정량화됩니다.<ol>
<li>소프트웨어의 Surface 모듈을 엽니다.</li>
		<li>세포 전 성분을 3D로 재구성하기 위해 세포 전 성분에 특별히 레이블을 지정하는 데 사용되는 마커의 형광 채널을 선택합니다.</li>
		<li>임계값을 설정하고 구조의 예상 직경 크기의 범위를 제공합니다 (즉, 핵에 대한 0.5-5 μm; 혈관에 대한 0-100 μm; 등).</li>
		<li>분할을 실행합니다. 분할된 셀룰러 구조를 가진 부피가 생성됩니다. 측정 및 정량 적 데이터(볼륨, 수, 크기, 직경 등)는 통계 탭에서 추출할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈관을 관 전위로 분류합니다. 참고: 필라멘트 분할은 선박의 연결을 연구하는 데 매우 유용하지만, 우리는 선박의 크기, 부피 및 직경에 대한 데이터를 추출하기 위해 표면 모듈 세분화를 사용합니다. 실제로 필라멘트 모듈을 사용할 때 선박의 크기가 정량화됩니다.<ol>
<li>소프트웨어의 필라멘트 모듈을 엽니다.</li>
		<li>혈관 염색에 대응하는 형광 채널을 선택합니다.</li>
		<li>형광 강도에 대한 임계값을 설정하고 예상되는 연결 노드수를 적절히 선택합니다.</li>
		<li>분할을 실행합니다. 선박 네트워크를 나타내는 필라멘트는 3D로 생성됩니다. 측정은 통계 탭에서 추출하여 선박 길이, 선박 분기 수 등을 포함한 정량적 데이터를 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 할 충돌이 없습니다.

비만과 같은 병리학적 진행 과정에서 지방 조직 내에서 발생하는 수정은 병리학 뒤에 있는 메커니즘의 이해에 기본입니다. 지방 조직에서 이러한 메커니즘을 밝힌 선구적인 연구는 전체 지방 조직프로테오믹스(21),유동 세포측정법(22,,23)및전사학(24,,25)과같은 글로벌 접근법에 기반을 두고 있다.22 또한, 조직학적 분석을 이용하여 지방 조직에서 발생하는 구조적 변화를 탐구하기 위한 노력이 이루어지고 있다26,,27,,28,,29. 그러나, 5-10 μ...

비만은 지방 조직 질량에 있는 증가를 특징으로 하고 비만을 가진 사람들이 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병, 간 질병 및 몇몇 암을 개발의 리스크를 증가했다는 것을 감안할 때, 중요한 세계적인 공중 위생 문제점이 되었습니다.
지방 조직의 근본적인 생리적 기능은 전신 포도당과 지질 항상성1,,2를조절하는 것입니다. 먹이 주기 동안, 지방 조직의 주요 세포(즉, 지방 조직의 주요 세포)는 식사에서 제공하는 포도당과 지질의 과잉을 트리글리세라이드로 저장합니다. 금식 하는 동안, 지방 세포는 신체의 에너지 수요를 유지 하기 위해 비 에스테르 지방산 과 글리세롤으로 트리 글리세라이드를 분해. 비만의 발달 도중, 지방 조직은 그들의 저장 용량을 증가시키기 위하여 adipocytes의크기 (비대성) 및/또는 수 (hyperhyperasia)를 증가시킴으로써 확장합니다. 지방 조직의 팽창이 한계에 도달하면, 환자 들 사이에서 일정한 높게 변수, 나머지 지질은 근육과 간3을포함하여 다른 신진 대사 기관에 축적3,4,그들의 기능 적 실패와 비만 관련 심장 대사 합병증을개시1,,5. 따라서, 지방 조직 확장을 지배하는 메커니즘을 식별하는 것은 중요한 임상 과제입니다.
비만 도중 지방 조직 안에 문서화된 형태학적 수정은 그것의 병리학적인 역기능에 연결됩니다. 여러 염색 절차는 액틴6,혈관 마커7,지질-물방울 마커8,및 특정 면역 세포 마커9,,10을포함하는 지방 조직의 조직 조직을 설명하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 대지세포(50~200 μm)의 막대한 직경11때문에, 비만 시 관찰된 극적인 구조적 AT 변화를 정확하게 분석하기 위해서는 전체 조직의 상당 부분을 3차원으로 분석하는 것이 필수적이다. 그러나, 빛이 불투명한 조직을 관통하지 않기 때문에, 형광 현미경검사를 이용한 대형 조직 샘플 내에서 3D로 이미징하는 것은 불가능합니다. 그(것)들을 투명하게 하기 위하여 조직 청산의 방법은 문헌에서 보고되었습니다 (검토를 위해,12참조) 조직을 지우고 심층적인, 전체 조직 형광 현미경 검사를 능력을 발휘할 수 있도록 합니다. 이 방법은 건강하고 병들게 한 조직에서 3D 세포 조직을 평가하는 전례없는 기회를 제공합니다. 각 기재 방법에는 장점과 단점이 있으므로 연구된 조직에 따라 신중하게 선택해야 합니다(검토를 위해13참조). 실제로, 일부 접근법은,14,,15,,16,17,18,,19를얻기 어렵거나, 독성이 있거나, 고가의 물질 또는화합물의사용 및/또는 사용이 필요하다. 베르너 Spalteholz에 의해 세기 전에 사용 된 첫 번째 화합물 중 하나를 활용20,우리는 매우 잘 화학 후드, 온도 제어 궤도 셰이커와 공초점 현미경을 포함한 전형적인 장비와 실험실에서 모든 마우스와 인간의 지방 조직 창고의 청산에 적응 사용자 친화적이고 저렴한 프로토콜을 설정합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td>, <td>Eppendorff 튜브 - Dutscher</td><td>33528</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 플라스틱 튜브</td><td>, Falcon 튜브 - Dutscher</td><td>352096</td><td></td></tr>, <tr><td>18 mm 원형 유리 커버슬립</td>, <td>Mariendfeld</td><td>0117580</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 유리병</td><td>, Wheaton</td><td>986546</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>, <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-605-150</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>CD301-PE 항체</td><td>Biolegend</td><td>BLE145703</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>CD31 항체</td><td>AbCam</td><td>ab215912</td><td>희석: 1/50</td></tr><tr><td>상용 3D 분석 소프트웨어 - IMARIS</td><td>Oxford instrument</td><td></td><td>셀 모듈</td></tr><tr><td>포함 컨포칼 현미경 - Nikon A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>재고 농도: 5 mg/mL; 희석 1/1000</td></tr><tr><td>Deoxycholate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Glut4 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53566</td><td>희석: 1/50</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Lectin-DyLight649</td><td>Vector Lab</td><td>DL-1178-1</td><td>재고 농도 : 2 &micro; g/&마이크로; L; IV 주입 : 50 &micro; 유리</td></tr><tr><td>바닥이 장착된 L/마우스 금속 이미징 챔버 - AttoFluor Chamber</td><td>Thermofisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>메틸 살리실레이트</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>페리리핀 항체</td><td>Progen</td><td>651156</td><td>희석: 1/50</td></tr><tr><td>Phalloidin-alexa488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>TCR-&베타;-PB 항체</td><td>Biolegend</td><td>BLE109225</td><td>희석: 1/100</td></tr><tr><td>TH 항체</td><td>AbCam</td><td>ab112</td><td>희석: 1/50</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P416</td><td></td></tr></tbody></table>

메틸살리실레이트 클리어링 및 3d 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

비만은 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병 및 간 질병을 개발하는 리스크를 증가시키는 중요한 세계적인 공중 위생 문제점입니다. 비만은 지방 조직 (AT) 대두 증식 및 비대성으로 인해 질량의 증가를 특징으로하며, 3 차원 구조의 심오한 리모델링으로 이어진다. 실제로, 비만 도중 확장하는 AT의 최대 용량은 비만 관련 병학의 발달에 중추적인 입니다. 이 AT 확장은 에너지 섭취량의 과잉에 적응을 가능하게하고 다른 신진 대사 기관에 해로운 지질 유출을 피하기 위해 중요한 정향적 메커니즘입니다, 근육과 간 등. 따라서 AT 확장의 실패로 이어지는 구조적 리모델링을 이해하는 것은 높은 임상 적용성을 가진 근본적인 질문입니다. 이 기사에서는 형광 이미징에 의한 마우스 및 인간 백색 지방 조직의 형태를 탐구하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 간단하고 빠른 클리어링 방법을 설명합니다. 이 최적화된 AT 클리어링 방법은 화학 후드, 온도 제어 궤도 셰이커 및 형광 현미경을 갖춘 모든 표준 실험실에서 쉽게 수행됩니다. 또한 사용되는 화학 화합물을 쉽게 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 방법은 다양한 마커를 염색하여 3D AT 구조를 구체적으로 시각화하여, 신경 및 혈관 네트워크, 그리고 선천적이고 적응적인 면역 세포 분포를 확인할 수 있게 한다.

여기에 기재된 절차를 이용하여 도 1에요약된, 우리는 도 2A 및 도 2B에각각 제시된 바와 같이 인간및 마우스 백색 지방 조직을 각각 얼룩지게 하고 광학적으로 맑은 조직할 수 있었다. 클리어된 조직은 공초점 이미징(도 3A)을 수행하기 위해 금속 이미징 챔버로옮겨졌다. 클리어링은 우리가 획득할 수 있었던 조직 이미지의 깊이를 크게향상(도 3B 및 도 3C). 전체 지방 조직은 4배 목표(보충 동영상 1 참조)를사용하여 낮은 배율에서 3D로 획득할 수 있으며, 3D 맵을 생성하여 20배 목표(도3D)를사용하여 높은 배율에서 획득할...

여기서, 우리는 형광 화상 진찰에 의하여 혈관, 핵, 면역 세포, 뉴런 및 지질 물방울 외투 단백질을 시각화하기 위하여 마커의 조합을 사용하여 마우스와 인간 백색 지방 조직의 3D 구조를 해결하는 간단하고 저렴하고 빠른 청산 방법을 기술합니다.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

이러한 프로토콜은 마우스 지방 조직 발레 현미경검사에 매우 큰 인간의 3 차원 구조의 분석을 할 수 있습니다. 지방 조직 구조 변화와 병리학 적 기능 장애의 연결을 촉진. 이 클리어링 과정은 매우 간단하며, 따뜻한 쥐에 인간을 지우는 데 매우 잘 적응되어 조직 조직을 지방 조직으로 제거하고 다른 명확한 프로토콜에 비해 에탄올 또는 메틸 살리실레이트와 같은 독성이 적은 용매를 사용합니다.먼저 수확한 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직을 PBS에서 4% 이상의 포름알데히드(포름알데히드)에 15밀리리터 플라스틱 튜브를 화학 후드 아래에 두는 것으로 시작합니다. 하룻밤 사이에 4도에서 튜브를 압연 플레이트로 옮기기 전에 1 시간 동안 실온에서 롤링 플레이트에 티슈를 흔들어보십시오. 다음날 아침, 고정된 백색 지방 조직을 실온에서 5분 동안 PBS10 밀리리터로 헹구고, 1000분의 궤도 셰이커에서 실온에서 10밀리리터의 글리신을 포함하는 15밀리리터 튜브로 조직을 이송한다.나머지 무료 알데히드 그룹이 담금질되었을 때, PBS에서 0.2%의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 조직을 담급하여 섭씨 37도에서 흔들어 두 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션의 끝에서 0.2 %의 트리톤 X-100 및 20 %DMSO의 10 밀리리터로 조직을 치료하며 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 흔들리고 있습니다. 다음날 아침, PBS에서 0.1%Tween 20, 0.1%트리톤 X-100, 0.1%deoxycholate 및 20%DMSO를 함유한 15밀리리터 플라스틱 튜브에 조직을 몰입하여 37°C에서 최소 24시간 동안 잠복합니다.인큐베이션이 끝나면 PBS에서 0.2%의 10밀리리터로 조직을 헹구고 분당 100회전에서 1시간 동안 궤도 셰이커를 시비탈 셰이커로 헹구는다. 그 다음으로 0.2%의 트리톤 X-100, 10%DMSO, PBS 3%BSA의 15밀리리터에 12시간 동안 37°C의 흔들림이 뒤따랐습니다. 흰색 지방 조직의 염색을 위해.조직을 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS의 3%BSA로 전송하여 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 대한 주요 항체로 보완되어 알루미늄 호일로 빛을 보호하고 튜브를 50 밀리리터 팔콘 튜브에 넣습니다. 튜브를 궤도 셰이커에 넣고 2일 동안 흔들리는 섭씨 37도에서 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS3%BSA의 10밀리리터에서 2회 조직을 헹구고 37도에서 5시간 동안 PBS에서 37도의 흔들림과 빛으로부터 보호합니다.두 번째 헹도 세척 후 10 밀리리터에서 10 밀리리터의 신선한 0.2% 트리톤 X-100, 10%DMSO 및 3%BSA 및 PBS는 섭씨 37도에서 16~48시간 동안 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS의 3%BSA를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브로 이송하여 적절한 이차 항체및 알루미늄을 사용하여 알루미늄을 보호합니다. 셰이커에서 섭씨 37도에서 이틀 간 배양한 후, 0.2%의 트리톤 X-100, 10%DMSO, 3%BSA의 10밀리리터에서 2회 세척하여 37°C에서 5시간 동안 PBS에서 37도에서 진동을 방지합니다. 두 번째 세척 후, 신선한 0.2 %트리톤 X-100, 10 %DMSO 및 PBS에서 3 %BSA의 10 밀리리터를 포함하는 튜브로 조직을 헹구고 37 섭씨에서 37 섭씨에서 흔들리고 빛 보호합니다.그 다음에는 PBS 10밀리리터에서만 37도에서 흔들림과 가벼운 보호 기능을 하며 2시간 동안 세척합니다. PBS 세척의 끝에 백색 지방 조직 클리어링을 위해, 지시된 바와 같이 빛으로부터 보호되는 흔들림과 함께 실온에서 농도당 2시간 배양에 대한 오름차순 송신 에탄올 농도 시리즈의 조직 및 10 밀리리터를 침수한다. 다음 날 아침, 연기 후드에 메틸 살리실레이트 5밀리리터가 들어있는 플라스틱 캡이 달린 20밀리리터 유리 병에 티슈를 담그면 됩니다.백색 지방 조직은 이 단계에서 아직도 명확하게 보입니다. 용기를 흔들어 적어도 2 시간 동안 실온에서 빛으로부터 보호하십시오. 백색 지방 조직은 완전히 이식됩니다.스테인드 및 클리어 된 흰색 지방 조직의 3D 공초점 화상 진찰을 위해 유리 바닥과 연기 후드가 장착 된 금속 이미징 챔버를 챔버로 전달합니다. 신선한 메틸 살리실레이트로 챔버를 채웁니다. 작은 커버 슬립을 추가하여 챔버의 장착을 마무리하여 조직을 안정화시키고 큰 커버 슬립을 챔버를 닫습니다.전체 지방 조직 샘플의 몇 입방 센티미터 3D지도를 생성하기 위해 낮은 배율에서 조직 이미징을위한 반전 공초점 현미경 단계에 챔버를 배치합니다. 3D 맵 생성 후 해상도와 깊이 사이의 좋은 비율을 제공하는 20배 장거리 공기 목표를 사용하여 더 높은 배율에서 조직 샘플링을 위한 여러 영역을 선택합니다. 셀 세분화의 경우 3D 스택을 소프트웨어 형식으로 변환하여 메모리 공간을 확보합니다.소프트웨어의 셀 모듈을 열기 전에. 세포 검출 설정을 플라즈마 멤브레인 염색으로 변경하고 세포 주변을 설명하는 데 사용되는 마커의 형광 채널을 선택합니다. 그런 다음 임계값을 설정하고 예상 셀 크기의 범위를 제공하고 분할을 실행합니다.인간과 마우스 백색 지방 조직에 청산의 영향은 육안으로 관찰될 수 있습니다. 클리어링은 또한 획득할 수 있는 조직의 이미지 깊이를 크게 향상시킵니다. 또한 4배 배율로 조직 3D 이미징 및 3D 맵 생성을 용이하게 합니다.3D 매핑을 통해 20배배율에서 2밀리미터 깊이로 다양한 관심 영역을 선택할 수 있습니다. 지질 방울과 지방세포의 특정 염색은 각각 페리핀 및 항글루4 항체를 사용하여 달성될 수 있다. 혈관은 희생 직전에 CD31 항체 또는 렉틴 DyLight 649의 정맥 주사를 사용하여 검출될 수 있습니다.대식세포및T세포는 항체 CD301 피코에리스린 항체 및 항 TCR 베타 퍼시픽 블루 항체를 사용하여 시각화될 수 있다. 말초 신경 네트워크는 항 티로신 하이드록실라제 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 라벨링을 이용하여 지방 조직 내의 선포세포 및 혈관 네트워크 밀도의 평균 크기 및 크기 분포를 결정할 수 있다.열악한 샘플 준비로 인해 좋은 이미지 품질이 발생하지 않기 때문에 작업 시간을 입증한 대로 따르는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 고급 이미징 시스템과 결합하거나 후처리 이미지 분석 프리웨어에 결합될 수 있습니다.

exploring-adipose-tissue-structure-methylsalicylate-clearing-3d

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

때문에 비만 및 다른 동반 질환의 급격한 음의 연결, 역할 지방에 대한 연구는 질병에 재생 및 전반적인 건강을 보증합니다. 우리는 고립과 현장에서 사용하여 지방의 연구를 허용 지방 창고의 절제 및 생체 외 방법에 프로토콜을 제시한다.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

새로운 혈관 형성 및 동 정적인 신경 분포 개장 하는 지방 조직에서 중추적인 역할을 재생합니다. 그러나, 시각화 및 양적 측정 지방 조직에 기술적인 문제가 남아 있다. 여기 우리는 성공적으로 레이블 및 양적 혈관과 다른 adipose 조직에 신경 섬유의 밀도 비교 하는 프로토콜을 제시.

혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩

우리는 지방 조직 신진 대사 표현형에 기여에 매트릭스 및 지방 세포의 역할의 해부를 허용하는 시험관 내 3D 인간 세포 외 매트릭스 -adipocyte를 설명합니다.

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

건강한 근육 조직을 근육 내 지방으로 대체하는 것은 인간의 질병과 상태의 두드러진 특징입니다. 이 프로토콜은 근육 내 지방을 시각화, 이미지 및 정량화하는 방법을 간략하게 설명하여 근육 내 지방 형성의 기초가되는 메커니즘에 대한 엄격한 연구를 가능하게합니다.

근육 내 지방 형성과 골격근의 세포 기원을 조사하는 가이드

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

여기에서는 쥐 쇄골 상부 갈색 지방 조직의 조직학적 및 유전자 발현 분석을 해부하고 수행하기 위한 실용적인 절차를 제공합니다.

쥐 쇄골 상갈색 지방 조직의 해부, 조직학적 처리 및 유전자 발현 분석

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

배우세요 메틸살리실레이트 클리어링과 3D 이미징을 활용한 쥐와 인간 백색 지방 조직의 구조 분석 방법입니다. 이 기술은 혈관, 면역 세포, 지방 방울을 시각화하여 대사 질환 연구에 활용됩니다.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

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