Name: メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶメチルサリチル酸を用いた脂肪組織クリアリング法で、マウスおよびヒト白色脂肪組織の3次元構造を可視化する技術です。血管、免疫細胞、脂質滴を蛍光標識し、病理学的構造変化を解析します。

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この作品は、INSERMによってサポートされました。 コート・ダジュール大学、そして将来のラベックス・シグナライフへの投資を通じたフランス国立研究庁(ANR)からの助成金(ANR-11-LABX-0028-01)、プログラムUCA JEDI(ANR-15-IDEX-01)、アカデミー2「システムズコンプレックス」とアカデミー4「コンプレックス・エ・ダイバート」を通じて フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカル(エキペFRM DEQ20180839587)とJ.G.(ANR18-CE14-0035-01-ギレロン)に若い調査官プログラムを注ぎます。また、コンセシル・デ・アルプ・マリティームとレジオンPACAが出資するC3Mのイメージングコア施設に感謝し、IBISA顕微鏡・イメージングプラットフォームコートダジュール(MICA)も支援しています。マリオン・デュソットの組織準備に関する技術的な助けに感謝します。私たちは、原稿の証拠読み取りのためにアビー・カットトリス、UCA国際科学可視性に感謝します。

このプロトコルはテストされ、すべてのマウスおよびヒト白色脂肪組織の貯蔵所について検証される。ヒトおよびマウス脂肪組織は、それに応じて欧州の法律に従って収集され、フランスとスウェーデンの倫理委員会によって承認されました。
1. マウスとヒト白色脂肪組織の固定
<ol><li>収穫したマウスまたはヒト白色脂肪組織を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む少なくとも10mLのPBSに15mLのプラスチックチューブに浸漬する。</li>
	<li>ローリングプレートの室温でプラスチックチューブを1時間振ります。</li>
	<li>プラスチックチューブをローリングプレートの上に4°Cで一晩放置し、固定を完了します。 注:このプロトコルは、通常の食事を与えられたマウスから得られた全身上端体脂肪パッド(≈250mg - ≈0.6 cm3)などの大規模な脂肪組織サンプルに適合しています。高脂肪食(≈1.5g - ≈4 cm3)またはヒト脂肪組織サンプルを与えられたマウスから得られた上端体脂肪パッドのようなより大きなサンプルについては、クリアプロトコルは完全に(PFAと抗体混合物をスケールアップすることによって)サンプル全体に対して完全に機能するはずですが、一般的に、残りのサンプルを1g(≈2.5cm3)の周りに切断して、追加の染色またはアプリケーションのために残りのサンプルを予約します。PFA(ステップ1.1.)の場合、組織の体積の約10倍を使用することをお勧めします。抗体混合物(ステップ3.1.および3.4.)の場合、組織を完全に浸漬するために体積を増やし、組織が1.5 mLプラスチックマイクロチューブに対して大きすぎる場合は15mLプラスチックチューブ( 材料表を参照)を使用します( 材料表を参照)。</li>
</ol>2. マウスとヒト白色脂肪組織の透過と飽和
<ol><li>固定白色脂肪組織をPBSの10 mLで室温で5分間リンスし、PFAの痕跡をすべて除去します。</li>
	<li>0.3%のグリシン( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、残りの遊離アルデヒド基を1分あたり100回転(rpm)で軌道シェーカーで室温で1時間振り、残りの遊離アルデヒド基を急いで残します。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100( 材料表を参照)を補ったPBS10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、100rpmで2時間の温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを振ります。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100と20%DMSO( 材料表を参照)を補ったPBSの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、一晩100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを振ります。</li>
	<li>0.1%のTween-20( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、0.1%トリトンX-100、0.1%デオキシコール酸( 材料表を参照)、20%DMSOで37°Cの温度制御軌道シェーカーでチューブを少なくとも240rpmで振る。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100を補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100 rpmで軌道シェーカーで室温でチューブを1時間振ります。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSA( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、12時間100rpmの温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを12時間、非特異的に結合する可能性のある任意の部位を飽和させる。 注:ステップ2.7において、BSAは、使用される二次抗体の種の血清によって置換することができる。</li>
</ol>3. マウスとヒト白色脂肪組織の染色手順
<ol><li>0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAおよび一次抗体を補った300μLのPBSを含む1.5mLプラスチックマイクロチューブ内の組織を移管する(凍結染色よりも10倍多く濃縮されたが、抗体ごとに最適な抗体濃度を評価する必要があります)。アルミニウム箔で覆い、温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを少なくとも2日間100rpmで振って、光からチューブを保護します(ステップ1.1とステップ3.7.1のノートを参照)。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAを補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、温度制御された軌道シェーカーで37°Cで光から保護されたチューブを100 rpmで5時間振る。この手順を 2 回実行します。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAを補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで100rpmで37°Cで1泊から2日間、光から保護されたチューブを振ります。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAおよび二次抗体(凍結染色よりも10倍濃縮)を補ったPBSの300 μLを含む1.5 mLプラスチックマイクロチューブに組織を移す。アルミニウム箔で覆い、温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを少なくとも2日間100rpmで振って、光からチューブを保護します(ステップ1.1とステップ3.7.1のノートを参照)。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100、10%DMSO、および3%BSAを補ったPBSの10 mLを含む15mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cで光から保護し、5時間で37°Cでチューブを振ります。この手順を 2 回実行します。</li>
	<li>0.2%トリトンX-100、10%DMSO、および3%BSAを補ったPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで100rpmで37°Cで光から保護されたチューブを1泊から2日間振ります。</li>
	<li>PBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cで2時間、光から保護されたチューブを振ります。 注:核やアクチンなどの特定の構造の標識については、4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPIまたは同等物)および/または蛍光標識ファロイジンをステップ3.1に追加する必要があります。蛍光標識された一次抗体のみが使用される場合、またはステップ3.4で使用する。二次抗体が使用される場合。 注:染色手順では、既にフルオロクロムと結合した一次抗体(フローサイトメトリーに使用されるものなど)を使用することができ、時間と特異性を得るためにお勧めします。実際、マウス一次抗体を使用し、その後に二次抗マウス抗体を使用できたとしても、ここで実証したように、循環免疫グロブリンによる血管の非特異的染色を観察することが多い。したがって、この問題を回避するために、既に標識されている一次抗体が強く推奨され、ここではフローサイトメトリーで使用される抗体が我々の手順と互換性があることを示す証拠を提供します。しかし、低レベルで発現される抗原の特定の場合には、二次抗体を介したシグナル増幅ステップが必須である。唯一の利用可能な一次抗体がマウスで作られると、犠牲で少なくとも5分間PBSを有するマウスの心臓灌流は、循環免疫グロブリンの大部分を除去することができ、したがって非特異的染色を行うことができる。</li>
</ol>4. マウスとヒト白色脂肪組織のクリア手順
<ol><li>50%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。</li>
	<li>70%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。</li>
	<li>95%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。</li>
	<li>100%エタノールの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。</li>
	<li>100%エタノールの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、一晩100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。</li>
	<li>5 mLのメチルサリチル酸を含むプラスチックキャップ( 材料表を参照)を化学フードの下に20 mLガラス瓶に浸し、光から保護されたガラス容器を100rpmの軌道シェーカーで室温で少なくとも2時間振ります。 注: 手順 4.3 を回避することで、クリア処理手順を(必要に応じて)大幅に高速化できます。4.5.と、最終的なクリア品質はわずかに低下しますが。</li>
</ol>クリアホワイト脂肪組織の5.3D共焦点イメージング
<ol><li>化学フードの下にガラス底( 材料表を参照)を装備した金属画像チャンバーに組織を移し、新鮮なメチルサリチル酸でチャンバーを満たします。 注:所定の位置に組織を固定し、したがって、チャンバー内に浮いたり、横に動かないようにするために、チャンバーに取り付けるときに、複数の18ミリメートルの丸いガラスカバーリップ( 材料表を参照)を適用します。</li>
	<li>反転した共焦点顕微鏡の上に撮像チャンバーを置きます。</li>
	<li>低倍率の目的(例えば、4倍の目的)を用いて組織を画像化し、脂肪組織全体またはヒト組織サンプルの数cm33D マップを生成する。</li>
	<li>高い倍率で組織サンプリング用の領域を複数選択します。通常、解像度と深さの間に良好な比率を提供する 20 倍の長距離エアの目的を使用します。深さ600~2000μmのzスタックを持つ大型モザイク画像を取得します。 注: 遠距離の目的を使用して、組織の奥深くに画像を表示します。</li>
</ol>3D脂肪組織画像からの定量的結果の抽出
注:異なる構造のセグメンテーションと、ポイント5で生成された3D画像スタックからの定量的情報の抽出は、市販またはフリーウェアのいずれかの既存の画像解析ソフトウェアオプションのいずれかを使用して実行できます。以下の点では、当社の研究室で、商用ソフトウェアを用いて3D脂肪組織画像から定量的情報を抽出するために日常的に使用されている戦略を説明します( 材料表を参照)。
<ol><li>3D スタックをソフトウェア形式に変換して、メモリ空間を解放します。</li>
	<li>セルをセグメント化します。<ol>
<li>ソフトウェアの Cell モジュールを開きます。</li>
		<li>細胞検出の設定を、プラズマ膜染色に変更します。</li>
		<li>細胞周辺(マクロファージのF4/80、T細胞のTCR-β、または免疫細胞サブタイプに特異的な分化CDタンパク質のクラスターのような皮質アクチンまたは血漿膜マーカーを標識するファロイジン)を線引するのに使用されるマーカーの蛍光チャネルを選択します。</li>
		<li>しきい値を設定し、予想されるセルサイズの範囲を提供します(すなわち、セル検出のための1〜200 μm)。</li>
		<li>セグメンテーションを実行します。z スタックに対応するボリュームは、隣接するセルごとに異なる色で色分けされたセグメント化されたセルで生成されます。</li>
		<li>統計タブに統計フィルター(サイズ、丸み、円形など)を適用して、セグメンテーションアーティファクトを除外したり、セグメント化された細胞をそのサイズに基づいて対象細胞に絞り込んだりします(例えば、有数葉細胞の場合は20〜200μm、マクロファージの場合は5〜25μm、リンパ球の場合は1〜3μm)。</li>
		<li>統計タブから測定値と定量データ(体積、数、サイズ、直径など)を抽出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞成分(核、小胞など)または血管を構造としてセグメント化します。 注:フィラメントのセグメンテーションは、船舶の接続性を調べるのに非常に便利ですが、表面モジュールのセグメンテーションを使用して、血管のサイズ、体積、直径に関するデータを抽出します。実際、フィラメントモジュールを使用すると、血管のサイズの定量化が失われます。<ol>
<li>ソフトウェアの サーフェス モジュールを開きます。</li>
		<li>細胞下の成分を3Dで再構成するために、細胞内成分に特異的に標識するために使用されるマーカーの蛍光チャネルを選択します。</li>
		<li>しきい値を設定し、構造物の予想直径サイズの範囲を提供します(すなわち、核の場合は0.5〜5 μm、血管の場合は0〜100μmなど)。</li>
		<li>セグメンテーションを実行します。セグメント化されたセルラー構造を持つボリュームが生成されます。測定値と定量データ(体積、数、サイズ、直径など)は、統計タブから抽出することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>管状の連続体として血管をセグメント化します。 注:フィラメントのセグメンテーションは、船舶の接続性を調べるのに非常に便利ですが、表面モジュールのセグメンテーションを使用して、血管のサイズ、体積、直径に関するデータを抽出します。実際、フィラメントモジュールを使用すると、血管のサイズの定量化が失われます。<ol>
<li>ソフトウェアの フィラメント モジュールを開きます。</li>
		<li>容器染色に対応する蛍光チャネルを選択します。</li>
		<li>蛍光強度のしきい値を設定し、予想される接続ノードの適切な数を選択します。</li>
		<li>セグメンテーションを実行します。容器ネットワークを表すフィラメントは3Dで生成されます。測定は統計タブから抽出することができ、容器の長さ、船舶の分岐の数などを含む定量的なデータを得ることができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation%3A+plasticity+of+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li>
<li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li>
<li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).</li>
<li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471(2016).</li>
</ol>

著者らは開示する矛盾を持っていません。

肥満などの病理学的進行の過程で脂肪組織内で起こる修飾は、病理学の背後にあるメカニズムの理解の基本である。脂肪組織におけるこのようなメカニズムを明らかにした先駆的な研究は、全体の脂肪組織プロテオミクス21、フローサイトメトリー22、23、および転写23体2224、25などの世界的なアプローチに24,25基づいている。さらに、組織学的分析26、27、28、29,27,28を用いて脂肪組織で起こる構造変化を29探る努力がなされている。しかし、5-10 μm脂肪組織切片の分析は、セクションのサイズが限られているた...

肥満は脂肪組織量の増加を特徴とし、肥満の人々が心血管疾患、2型糖尿病、肝臓病およびいくつかの癌を発症するリスクを高めていることを考えると、世界的に主要な公衆衛生問題となっている。
脂肪組織の基本的な生理学的機能は、全身グルコースおよび脂質恒常性11,22を調節することである。この摂食期間中、脂肪細胞(すなわち脂肪組織の主細胞)は、食事によって提供される過剰のグルコースおよび脂質をトリグリセリドに保存する。断食の間、脂肪細胞はトリグリセリドを非エステル化脂肪酸とグリセロールに分解して体のエネルギー需要を維持します。肥満の発症の間、脂肪組織は脂肪細胞のサイズ(肥大症)および/または数(過形成)を増加させることによって拡大し、その貯蔵能力を高める。脂肪組織の拡張がその限界に達すると、患者の間で一定の高い可変性、残りの脂質は筋肉および肝臓3、44を3含む他の代謝器官に蓄積し、その機能障害および肥満関連の心代謝合併症を発症する1,1、5。したがって、脂肪組織の拡張を支配するメカニズムを特定することは、臨床的な課題です。
肥満の間に脂肪組織内で文書化された形態学的修飾は、その病理学的機能不全に関連している。いくつかの染色手順は、アクチン6、血管マーカー7、脂質滴マーカー8、および特異的免疫細胞マーカー9、1010を含む脂肪組織の組織組織を記述するために使用されてきた。9しかし、アディポサイトの直径が大きい(50~200μm)11の11場合、肥満時に観測された劇的な構造AT変化を正確に分析するためには、組織全体の大部分を3次元で分析することが不可欠です。しかし、光が不透明な組織に浸透しないため、蛍光顕微鏡を用いた大組織試料内での3Dでのイメージングは不可能である。透明にする組織のクリアの方法は、文献で報告されています (レビューのために、12を参照してください ) 1 つの組織をクリアし、組織全体の顕微鏡を実施することができます。これらの方法は、健康で病気の組織における3D細胞組織を評価する前例のない機会を提供します。記載された各方法には利点と欠点があり、したがって、研究された組織に応じて慎重に選択する必要があります(レビューのために、13を参照)。実際、いくつかのアプローチは、高価な、有毒であるか、,,,または14、15、16、17、18、19を得14,15,ることが困難である材料または化合物の使用を長い潜伏期間および/または使用する必要があります。16171819ヴェルナー・スポルテホルツが1世紀前に使用した最初の化合物の1つを利用して組織20をクリアし、化学フード、温度制御軌道シェーカー、共焦点顕微鏡を含む標準的な機器を備えた実験室ですべてのマウスおよびヒト脂肪組織貯蔵庫のクリアに非常によく適応したユーザーフレンドリーで安価なプロトコルを設定しました。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロチューブ</td><td>Eppendorff チューブ - Dutscher</td><td>33528</td><td></td></tr><tr><td>15 mL プラスチックチューブ</td><td>Falcon チューブ - Dutscher</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 丸型ガラスカバースリップ</td><td>Mariendfeld</td><td>0117580</td><td></td></tr><tr><td>20 mL ガラスボトル</td><td>Wheaton</td><td>986546</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス-alexa647-標識抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-605-150</td><td>希釈率:1/100</td></tr><tr><td>抗ウサギ-alexa647標識抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>希釈率:1/100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>CD301-PE抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>BLE145703</td><td>希釈率:1/100</td></tr><tr><td>CD31</td>抗体 <td>AbCam</td><td>ab215912</td><td>希釈率:1/50</td></tr><tr><td>市販の3D解析ソフトウェア - IMARIS</td><td>Oxford instrument</td><td></td><td>セルモジュール付</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡 - Nikon A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>ストック濃度: 5 mg/mL; 希釈 1/1000</td></tr><tr><td>デオキシコール酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Glut4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53566</td><td>希釈: 1/50</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Lectin-DyLight649</td><td>Vector Lab</td><td>DL-1178-1</td><td>ストック濃度 : 2 & micro;g/&micro;L;IVインジェクション:50&micro;L/マウス</td></tr><tr><td>ガラス底部を備えた金属イメージングチャンバー - AttoFluor</td>チャンバー <td>サーモフィッシャー</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>サリチル酸メチル</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>ペリリピン抗体</td><td>プロジェン</td><td>651156</td><td>希釈率:1/50</td></tr><tr><td>ファロイジン-アレクサ488</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A12379</td><td>希釈率:1/100</td></tr><tr><td>TCR-&β;-PB抗体</td><td>Biolegend</td><td>BLE109225</td><td>希釈率:1/100</td></tr><tr><td>TH 抗体</td><td>AbCam</td><td>ab112</td><td>希釈:1/50</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P416</td><td></td></tr></tbody></table>

メチルサリチル酸除去と3dイメージングによる脂肪組織構造の探索

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

肥満は、心血管疾患、2型糖尿病、および肝臓疾患を発症するリスクを高める世界的な公衆衛生上の主要な問題です。肥満は脂肪細胞肥大や肥大による脂肪組織(AT)質量の増加を特徴とし、その三次元構造の深い改造につながる。確かに、肥満の間に拡大するATの最大容量は肥満関連病理の開発にとって極めて重要である。このAT拡張は、過剰なエネルギー摂取量への適応を可能にし、筋肉や肝臓などの他の代謝器官への有害な脂質の波及を避けるために重要な恒食機構です。従って、AT拡張の失敗につながる構造改造を理解することは、臨床的適用性の高い根本的な問題である。本稿では、蛍光イメージングによるマウスとヒト白脂肪組織の形態を探求するために当研究室で日常的に使用されている、シンプルで高速なクリアリング方法について説明します。この最適化されたATクリアリング方法は、化学フード、温度制御軌道シェーカー、蛍光顕微鏡を備えた標準的な実験室で簡単に行われます。また、使用する化学化合物は容易に入手可能である。重要なことに、この方法は、様々なマーカーを染色することによって3D AT構造を解決し、アディポ細胞、神経および血管ネットワーク、および先天的および適応的な免疫細胞分布を特異的に視覚化することを可能にする。

図1に示したここで説明した手順を用いて、それぞれ図2Aおよび図2Bに示すように、ヒトおよびマウス白色脂肪組織をそれぞれ染色し、光学的に透明化することができた。クリアされた組織を金属イメージングチャンバに移し、共焦点イメージングを行った(図3A)。クリアによって、取得できた組織画像の深さが大幅に改善されました(図3Bおよび図3C)。脂肪組織全体は、4倍の目的を使用して低倍率で3Dで獲得することができ(補足ムービー1を参照)、3Dマップを生成し、20倍の目的を使用して高倍率で獲得する異なる領域を選択することを可能にする(図3D)。高倍率画像は、深さ2mmの3Dで取得されます(<strong cl...

ここでは、蛍光イメージングによる血管系、核、免疫細胞、ニューロン、脂質・液滴被覆タンパク質を可視化するマーカーを組み合わせて、マウスとヒトの両方の白色脂肪組織の3D構造を解決するための簡単で安価で迅速なクリアリング方法について述べています。

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

これらのプロトコルはマウス脂肪組織のバレエ顕微鏡上の非常に大きい人間の三次元構造の分析を可能にする。脂肪組織の構造変化と病理学的機能不全の結合を促進する。この清算プロセスは非常に簡単で、組織を脂肪化し、他の明確なプロトコルと比較してエタノールやメチルサリチル酸などの毒性の低い溶媒を使用して、暖かいマウスで人間をクリアするのに非常によく適応しています。採取したマウスまたはヒト白色脂肪組織を、PBSの4%パワーホルムアルデヒドの少なくとも10ミリリットルに、化学フードの下で優先的に15ミリリットルのプラスチックチューブに浸すことから始めます。一晩摂氏4度でローリングプレートにチューブを移す前に、室温でローリングプレートの組織を1時間振ります。翌朝、固定白脂肪組織をPBSの10ミリリットルで室温で5分間洗いすぎ、固定剤のすべての痕跡を取り除き、PBSで10ミリリットルの0.3%グリシンを含む15ミリリットルチューブに組織を移し、1分あたり100回転の軌道シェーカーで室温で1時間インキュベーションする。残りの遊離アルデヒド基がクエンチされた場合、10ミリリットルの0.2%トリトンX-100を含む15ミリリットルのチューブに、37°Cで振る2時間のインキュベーションを行う。インキュベーションの終わりに、一晩摂氏37度で振る0.2%トリトンX-100と20%DMSOの10ミリリットルで組織を治療します。翌朝、10ミリリットルの0.1%Tween 20、0.1%トリトンX-100、0.1%デオキシコール酸、20%DMSOを含む15ミリリットルのプラスチックチューブに組織を浸し、37°Cで少なくとも24時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、PBSで10ミリリットルの0.2%トリトンX-100で、1分間に100回転/分でオービタルシェーカーで組織を1時間リンスします。その後、15ミリリットルの0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAをPBSで37°Cで12時間浸漬し、揺れで37度に浸漬した。白色脂肪組織の染色のため。組織を0.2%トリトンX-100、10%DMSO、PBSの3%BSAの300マイクロリットルに移し、1.5ミリリットルマイクロチューブの目的とする一次抗体を補い、アルミニウム箔で光から保護し、チューブを50ミリリットルのファルコンチューブに入れる。チューブを軌道シェーカーに入れ、2日間のインキュベーションを摂氏37度で揺らします。インキュベーションの終わりに、0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAの10ミリリットルの組織を、揺れと光からの保護で摂氏37度で5時間、PBSで2回リンスする。2回目のすすいで、新鮮な0.2%トリトンX-100の10ミリリットルで組織を洗浄した後、 10%DMSOと3%BSAとPBSを37°Cで16〜48時間振盪し、その後、0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよびPBSの3%BSAの300マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブに組織を移し、適切な二次抗体を補い、アルミニウム箔を使用してチューブを軽く保護します。シェーカーで摂氏37度で2日間のインキュベーションを行った後、0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAの10ミリリットルで2回、光から保護された37°Cで5時間PBSで洗浄します。2回目の洗浄後、新鮮な0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAを含むチューブに組織を洗浄し、37°Cで16〜48時間、揺れと光保護を行います。その後、揺れと光の保護で摂氏37度でPBSの10ミリリットルだけで2時間の洗浄が行われます。PBSの終了時に白い脂肪組織を洗浄するためには、示されているように光から保護された揺れで室温で2時間の上昇送送用エタノール濃度系列の組織と10ミリリットルを浸す。翌朝、発煙フードに5ミリリットルのメチルサリチル酸を含むプラスチックキャップを持つ20ミリリットルのガラス瓶に組織を浸します。白い脂肪組織は、この段階でまだはっきりと見えます。容器を室温で少なくとも2時間は光から守ってください。白い脂肪組織は完全に移植される。染色され、クリアされた白い脂肪組織の3D共焦点イメージングのために、ガラス底を備えた金属イメージングチャンバーをマウントし、ヒュームフードで組織をチャンバに移す。新鮮なメチルサリチル酸塩でチャンバーを充填します。チャンバを閉じるための組織と大きなカバースリップを安定させるために小さなカバースリップを追加することにより、チャンバーのマウントを確定します。チャンバーを低倍率で組織イメージング用の反転共焦点顕微鏡ステージに置き、脂肪組織サンプル全体の数立方センチメートルの3Dマップを生成します。3D マップの生成後、解像度と深さの間に良好な比率を提供する 20X 長距離エア目標を使用して、高い倍率で組織サンプリング用の領域を選択します。セルセグメンテーションの場合は、3Dスタックをソフトウェア形式に変換してメモリスペースを解放します。ソフトウェアのセルモジュールを開く前に。細胞検出設定をプラズマ膜染色に変更し、細胞周辺を分化するために使用するマーカーの蛍光チャネルを選択します。次に、しきい値を設定し、予期されるセル サイズの範囲を指定して、セグメンテーションを実行します。ヒトおよびマウス白色脂肪組織に対するクリアの影響は、肉眼で観察することができる。クリアはまた、獲得可能な組織の画像深度を大幅に向上させます。そして4Xの倍率の全体のティッシュの3Dイメージ投射および3D地図の生成を促進する。3Dマッピングにより、20倍の倍率で2ミリメートルの深さまで、興味のあるさまざまな領域を選択できます。脂質滴および脂肪細胞の特異的染色は、それぞれペリリピンおよび抗GLUT4抗体を用いて達成することができる。血管は、犠牲の直前にCD31抗体またはレクチンDyLight 649の静脈注射のいずれかを使用して検出することができる。マクロファージおよびT細胞は、抗CD301フィコエリスリン抗体および抗TCRベータブルー抗体を用いて可視化することができる。末梢神経ネットワークは、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて検出することができる。これらの標識を用いて、脂肪細胞の平均サイズおよびサイズ分布と脂肪組織内の血管ネットワーク密度を決定することができる。サンプルの準備が不十分な場合は画質が良くなるため、実証されているように職業時間に従う必要があります。このプロトコルは、高度なイメージングシステムと組み合わせることができ、または後処理画像解析フリーウェアに結合することができます。

exploring-adipose-tissue-structure-methylsalicylate-clearing-3d

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

原因肥満や他の併存疾患の間で抜本的なと負の接続に、ロールの脂肪の研究は、病気で再生し、全体的な健康が保証されています。私たちは、 その場で、そしてインビトロ方法で使用して脂肪の研究を可能に脂肪デポの単離および切除するためのプロトコルを提示する。...

マウス脂肪デポのローカライズ、識別、および切除

白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス...

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

高脂質含量のため従来の組織学的方法を使用して視覚化する脂肪組織にチャレンジしております。裏打ちクリアは、堅牢なラベリングと脂肪組織の高分解能体積蛍光イメージングができるテクニックをクリア組織です。ここでは、試料調製、前処理、染色、クリア、およびイメージング用取付方法をについて説明します。...

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

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全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

新しい血管の形成と交感神経支配は、脂肪組織リモデリングの極めて重要な役割を果たします。しかし、可視化と脂肪組織を定量的測定の技術的な問題が残っています。ここで正常にラベルを付け、血管や脂肪組織における神経線維の密度を定量的に比較するためのプロトコルを提案する.

共同血管や脂肪組織における神経線維を染色

我々は、脂肪組織代謝表現型に寄与するマトリックスおよび脂肪細胞の役割の解剖を可能にする3Dヒト細胞外マトリックス脂肪細胞in...

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

健康な筋肉組織を筋肉内脂肪で置き換えることは、ヒトの疾患および状態の顕著な特徴である。このプロトコルは、筋肉内脂肪を視覚化、画像化、定量化する方法を概説し、筋肉内脂肪形成の根底にあるメカニズムの厳密な研究を可能にします。...

骨格筋における筋肉内脂肪形成とその細胞起源を調べるためのガイド

新生仔マウスの肩甲間褐色脂肪組織の間質血管分画から前駆脂肪細胞を単離し、脂肪滴を蓄積する細胞に分化し、分子マーカーを発現し、成熟した褐色脂肪細胞のミトコンドリア形態を示します。これらの細胞は、免疫蛍光法および透過型電子顕微鏡法によってさらに分析されます。...

新生仔マウスの肩甲間脂肪組織の間質血管画分からの褐色脂肪細胞の分化とイメージング

ここでは、マウスの鎖骨上褐色脂肪組織の組織学的および遺伝子発現解析を解剖および実行するための実用的な手順を提供します。...

マウス鎖骨上褐色脂肪組織の解剖、組織学的処理、遺伝子発現解析

ここでは、ヒト皮下脂肪組織(hSATMVEC)から微小血管内皮細胞を単離、培養、および表現型決定するためのプロトコールについて説明します。さらに、hSATMVEC-脂肪細胞クロストークの実験モデルについても説明します。...

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

学ぶメチルサリチル酸を用いた脂肪組織クリアリング法で、マウスおよびヒト白色脂肪組織の3次元構造を可視化する技術です。血管、免疫細胞、脂質滴を蛍光標識し、病理学的構造変化を解析します。

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

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