CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 위해 모기 배아를 준비하고 주입하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 마이크로 주입 기술의 주요 장점은 모기 생존율이 높고 연구자들이 유전자의 기능을 결정할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 Culex 속에 속하는 모기를 주입하기 위해 특별히 조정되었습니다.

이 모기는 웨스트 나일 열과 세인트루이스 뇌염을 일으키는 바이러스뿐만 아니라 개 심장사상충과 코끼리병을 일으키는 필라리아 선충을 포함하여 여러 병원체를 전염시킵니다. 따라서 CRISPR-Cas9 게놈 편집과 같은 도구를 사용하면 이러한 중요한 질병 요인을 더 잘 이해하고 제어할 수 있습니다. 갓 낳은 곤충 배아를 주입하고 생존율을 높이려면 많은 시간, 연습 및 인내가 필요합니다.

따라서 돌연변이를 생성하기 위해 값비싼 물질을 주입하기 전에 여러 배아에 유색 식염수 용액을 주입하는 것이 좋습니다. 주사 바늘에 주사 혼합물을 다시 채우는 것으로 시작합니다. 선택한 주사 바늘의 뒤쪽 끝에 쉽게 들어갈 수 있는 바늘 필러 또는 젤 로딩 팁을 선택하십시오.

바늘 필러 끝과 주사 바늘 사이에 약간의 공간이 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 흡입하고, 주입 혼합물을 한 방울 떨어뜨려 가늘어지기 시작하는 지점 근처의 주사 바늘에 넣습니다. 그런 다음 마이크로 인젝터에 주사 바늘을 부착합니다.

배아가 들어 있는 슬라이드를 현미경의 스테이지에 놓습니다. 바늘을 열려면 약 30Psi의 시작 사출 압력을 사용하고 적절한 양의 사출 혼합물을 전달하기 위해 필요에 따라 조정합니다. 해부 현미경으로 바늘을 모기 배아 위에 놓고 미세 조작기를 조심스럽게 사용하여 바늘을 배아 위로 내립니다.

바늘이 배아에 거의 닿지 않으면 배아를 바늘의 긴 축에 수직으로 빠르게 움직입니다. 바늘이 성공적으로 열렸는지 확인하려면 주입 트리거를 누르고 바늘에서 기포나 주입 혼합물이 새어 나오는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 바늘이 열리고 방아쇠를 눌렀을 때 주입 혼합물이 빠져나갈 때까지 모기 배아를 바늘에 대고 움직이는 것을 반복합니다.

첫 번째 모기 배아를 view, 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 첫 번째 알 위에 바늘을 놓습니다. 현미경의 배율을 점진적으로 높이면서 바늘을 조심스럽게 내려 첫 번째 배아 바로 위에 유지되도록 합니다. 현미경이 최대 배율에 도달하고 배아와 바늘 모두에 초점이 맞춰질 때까지 진행합니다.

배아를 약간 왼쪽으로 이동하고 바늘을 내려 배아와 같은 시야에 있도록 합니다. 현미경 스테이지를 사용하여 배아를 바늘 끝에 부드럽게 터치합니다. 모기 배아의 좁은 뒤쪽 끝은 약간 편향되어야 합니다.

현미경 스테이지를 사용하여 배아의 뒤쪽 끝을 바늘 위로 옮기고 바늘이 모기 알의 융모막을 관통하는 것을 관찰합니다. 바늘은 막과 배아 내 극 세포의 대략적인 위치를 관통해야 합니다. 이 부위에 주입 혼합물을 배치하면 돌연변이가 발생하여 생식계열에서 유전될 가능성이 높아집니다.

주입 방아쇠를 1-3회 당겨 주입 혼합물을 배아에 쏘십시오. 배아 혈질의 작은 틈새가 감지될 수 있을 만큼만 소량의 주입 혼합물을 전달합니다. 스테이지를 사용하여 배아를 바늘 끝에서 오른쪽으로, 멀리 이동합니다.

주사가 잘 진행되면 배아에서 액체가 거의 또는 전혀 누출되지 않아야 합니다. 다음 배아가 바늘 앞에 위치하도록 스테이지를 아래로 이동합니다. 그리고 주입을 반복하십시오.

주사 혼합물이 나오지 않는 것 같거나 바늘을 제거한 후 배아에서 많은 양의 액체가 빠져 나오면 주사 바늘을 교체하고 다시 시작하십시오. 주입되지 않았거나 손상된 난자를 파괴하십시오. 슬라이드에 있는 모든 배아를 주입한 후 분무기로 역삼투압 물을 바르고 할로카본 오일을 씻어냅니다.

주입된 배아 위의 유리 커버 슬립 상단으로 물줄기를 향하게 하고 물이 커버 슬립 아래로 흐르도록 하여 흐름이 배아로 향하지 않도록 합니다. 슬라이드를 150마이크로리터의 물로 덮고 정사각형 페트리 접시 안의 젖은 여과지에 놓습니다. 페트리 접시를 섭씨 25-27도, 상대 습도 70-80%로 설정하고 하루 동안 광주기로 설정하는 환경 챔버에서 배양합니다.

이 프로토콜은 북부 집 모기인 Culex pipiens의 배아를 성공적으로 주입하는 데 사용되어 모기 배아의 앞쪽 끝이 의료용 드레싱 스트립을 넘어 확장되도록 하여 유충 생존율을 크게 높이고 성체로 발달하고 번식할 수 있는 고품질 자손을 낳습니다. 염기서열분석 결과, 스크리닝된 모기의 약 10%가 첫 번째 가이드 RNA의 Cas9 절단 부위 근처에 작은 삽입 또는 결실을 보였으며, 이는 극 세포가 마이크로 주입 중에 성공적으로 표적화되었음을 시사합니다. F1 개체는 성공적으로 짝짓기를 하여 생존 가능한 자손을 낳았으며, 그 중 일부는 돌연변이를 포함하기도 했습니다.

곤충 배아를 마이크로 주입할 때 대부분의 사람들은 처음에 바늘을 열고 배아를 바늘로 옮기는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 기술을 개발하려면 시간과 연습이 필요하다는 것을 기억하십시오. 이 프로토콜은 다른 모기 또는 다른 곤충 종의 배아를 주입하기 위해 수정되거나 조정될 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여 표적 CRISPR-Cas9 게놈 편집으로 유전자를 knock-out하는 것 외에도 동일한 기술을 사용하여 플라스미드 또는 트랜스포존을 주입하여 유전자를 knock-in하거나 무작위 돌연변이를 생성할 수 있습니다. 제 연구실에서는 현재 이 기법을 사용하여 모기가 매일 측정하고 계절 반응을 조절하는 방법을 더 잘 이해하고 있습니다. 그러나 우리 연구자들은 여러 유기체의 생물학을 더 잘 이해하기 위해 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 사용하고 있습니다.