Name: CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9를 사용하여 Culex pipiens 모기 배아를 주입하고 준비하는 방법. 이 기술은 높은 생존률로 유전자 기능을 분석하고 질병 매개체 제어 전략에 활용할 수 있습니다.

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우리는 데이비드 O'Brochta 박사와 곤충 유전 기술 조정 연구 네트워크의 모든 구성원들이 유전 기술의 구현에 대해 우리와 다른 사람들에게 제공하는 도움과 훈련을 주셔서 감사합니다. 우리는 특히 컬렉스 배아를 주입하고 부화할 수 있도록 미세 조작 프로토콜을 최적화한 찬나 알루비헤어에게 감사드립니다. 또한 Meuti 연구소에서 일하는 학부 생인 데반테 시몬스와 조셉 우르소(Joseph Urso)와 트랜스제닉 모기를 돌보고 선별하는 데 도움을 준 데반테 시몬스와 조셉 우르소, ITF의 조라 엘름카미(Zora Elmkami)가 모기를 사육하고 주사를 준비하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 MEM에 제공 OSU에 감염증 연구소에서 학제 간 씨앗 보조금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Hamer, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+a+bridge+vector+of+West+Nile+virus+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).</li>
<li>Bailey, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+St.+Louis+encephalitis+virus+from+overwintering+Culex+pipiens+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes.</a> Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).</li>
<li>Sabry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+realistic+index+of+experimental+transmission+efficiency+for+Bancroftian+filariasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis.</a> The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).</li>
<li>Cancrini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+albopictus+and+Culex+pipiens+implicated+as+natural+vectors+of+Dirofilaria+repens+in+central+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy.</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).</li>
<li>Wilton, D. P., Smith, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+diapause+in+three+geographic+strains+of+Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).</li>
<li>Mattingly, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Culex+pipiens+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Entomological+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">The Culex pipiens complex.</a> Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).</li>
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<li>Spielman, A., Wong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+ovarian+diapause+in+Culex+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens.</a> Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).</li>
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<li>Meola, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+and+humidity+on+embryonic+longevity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti.</a> Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).</li>
<li>Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+efficient+genomic+editing+system+with+CRISPR%2FCas9+in+the+vector+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus.</a> Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).</li>
<li>Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+causality+between+CYP9M10+and+pyrethroid+resistance+using+the+TALEN+and+CRISPR%2FCas9+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies.</a> Scientific Reports. 6, 24652(2016).</li>
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<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilia+sericata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae).</a> Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).</li>
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<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2FCas9+plasmids+for+rapid+and+versatile+genome+editing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+genome+editing+using+RNA-guided+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
</ol>

RH는 곤충 유전자 변형 서비스를 제공하는 곤충 변환 시설에서 작동합니다.

이 프로토콜은 Culex 모기의 게놈으로 특정 돌연변이를 소개하는 방법을 제시하고 또한 그밖 모기의 게놈을 편집하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 주입 물질을 준비하는 방법뿐만 아니라 모기가 계란을 낳도록 유도하는 방법과 그 계란을 준비하고 주입하는 방법에 대한 자세한 비디오 개요를 제공한다는 점에서 중요합니다. 우리는 또한 개별 뗏목에 계란을 낳고 따라서 원하는 돌연변이를 위해 각 여성에서 자손의 작은 비율을 가리기 위하여 여성 Cx. pipiens의 생물학을 이용하는 방법의 요약합니다. 여기에 제시된 방법은 Cx. pipiens에 최적화되었지만, 다른 모기 또는 곤충의 게놈을 편집하기 위하여, 작은 조정으로, 적응될 수 있습니다. 추가적으로, 여기에서 기술된 미세 조작 및 미세 주입 프로토콜은 탈렌스 또는 아연 핑거 뉴클레아제와 같은 트랜스포슨, dsRNA 또는 그밖 엔도니슬리스를 포함하여 곤충 배아에 몇몇 다른 물질을 주입하는 것이 가능합니다. 더욱이, 베벨링 프...

컬렉스 모기는 전 세계의 온대 및 열대 지역에 분포되어 있으며 웨스트 나일 바이러스1,세인트 루이스 뇌염2뿐만 아니라 개 심장벌레3 및 elephantiasis4를일으키는 필리알 선충을 포함한 여러 치명적인 바이러스를 전송합니다. Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens 및 Cx. pipiens 성추행을포함하는 Culex pipiens 복합체의 구성원은 생물학의 많은 양상에서 눈에 띄는 변화를 보여줍니다. 예를 들어, Cx. quinquefasciatus 및 Cx. pipiens 성추행은 겨울휴면5,6, Cx. pipiens 피피엔스는 짧은 일7,8에대한 응답으로 강력한 계절 반응을 표시하고 diapause를 입력 할 수 없습니다. 또한 Cx. pipiens 성추행은 더 인류애호가경향이 있는 반면 Cx. pipiens와 Cx. quinquefasciatus는 더 많은 동물 애호가6. 그러나 미국과 전 세계 많은 다른 장소에 걸쳐, Cx의 하이브리드로 질병 전염에 강한 영향을 미치는 이 종간 교배. pipiens pipiens 와 Cx. pipiens 성추행은 기회 피더이며 조류와 인간 을 모두 물린것입니다 9,따라서 웨스트 나일 바이러스에 대한 다리 벡터역할을. Culex 모기의 생물학의 이것과 그밖 매혹적인 양상을 공부하는 것은, 부분적으로, Culex 모기는 정지및 건조 저항하는 계란10을 생성하는 Aedes 모기 보다는 실험실에서 서있기 약간 더 어렵기 때문에 및 기능적인 분자 공구가 Culex 종을 위해 잘 개발되지 않기 때문에 방해되었습니다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집은남부 집 모기, 컬렉스 퀸케파시아투스14,15,16을포함하여 몇 가지 중요한 모기 종11,12,13의생물학을 평가하는 데 사용되는 강력한 기술이다. 제니퍼 두나와 엠마뉴엘 샤펜티에가 개발한 이 기술은 세균 유래, CRISPR 관련 엔도니클로스(Cas 단백질; Van der Oost 외17)에의한 바이러스에 대한 자연적인 세균 방어를 이용합니다. 동물 배아에 주입할 때, Cas9 단백질은 적당한 가이드 RNA와 조합하여 게놈 내의 이중 좌초 된 휴식을 생성할 수 있습니다. 이것은 가장 빈번하게 게놈의 특정 지구에 엔도누엔리스 활성을 지시하는 가이드 RNA로 복합되는 Cas9 단백질을 사용하여 행해집니다. Cas9 단백질이 사이트별 이중 좌초 휴식을 만든 후, 세포 기계는 두 가지 메커니즘 중 하나를 사용하여 휴식을 복구하려고합니다. 첫 번째는 오류가 발생하기 쉽고 종종 비기능성 단백질을 초래할 수 있는 게놈의 아웃프레임 삽입 및 삭제를 생성하는 비동상종 결합(NHEJ)을 통해 두 끝을 결집시켜 녹아웃 돌연변이를 생성합니다. 또는 셀룰러 기계는 유사한 시퀀스를 찾아 파손을 올바르게 복구하여 동종 학 지향 수리(HDR)를 사용할 수 있습니다. 유사한 서열은 유기체 내의 제2 염색체에 의해 제공될 수 있다(리뷰18참조). 그러나, 수리된 서열이 원래 서열과 정확히 일치하면 Cas9 단백질은 DNA를 다시 절단할 수 있을 것이다. 대안적으로, 연구원은 또한 대체 수리 순서를 가진 표적 서열의 절단 사이트의 양쪽에 동종 서열을 포함하는 기증자 플라스미드를 포함할 수 있습니다 - 종종 형광 마커 단백질, 원래 유전자의 변형 된 버전, 또는 기타 수정 - 게놈에 복사 및 삽입 할 수 있습니다, 또는 "노크-인."
타이밍은 배아를 주입 할 때 중요하며, 특히 CRISPR / Cas9 게놈 편집을 사용하여 곤충의 돌연변이를 만들 때 특히 그렇습니다. 이는 Cas9 단백질과 gRNA가 배아가 동기화 상태에 있을 때만, 세포막이 형성되기 전에, 그리고 다중 핵이 배아 내에서 접근할 수 있을 때만 돌연변이를 생성하는 가장 큰 능력을 갖기 때문이다. 모기의 경우, 핵은 온도19에따라 oviposition 후 주변 ~ 2-4 시간 동안 도달하므로 성공적인 미세 주입이 이 시간 전에 발생해야합니다. 추가적으로, Cas9 단백질은 주입에서 유래된 개별이 세포의 모자이크를 포함할 것이라는 점을, 몇몇은 원하는 돌연변이를 가진, 그리고 그 외는 접근할 수 있는 어떤 핵 DNA든지 자를 것입니다. 이러한 돌연변이가 성공적으로 상속되기 위해서는 Cas9 단백질이 미래의 계란과 정자를 초래할 생식선에 있는 DNA를 잘라야합니다. 생식선에서 돌연변이가 생성되도록 하기 위해 곤충 생식선의 선조인 배아 내극 세포의 위치에 가까운 모든 물질을 주입하는 것이 가장 좋습니다. 극 세포는 Culex 배아20의후방 끝 근처에 위치한다. 배아를 주입하는 것 외에도 원하는 돌연변이를 감지하기 위해 자손을 횡단하고 선별하기 위한 신중한 계획을 개발하는 것이 필수적입니다.
이 프로토콜은 gRNA를 생성하고 주입 믹스를 준비하기 위해 Cas9 단백질로 복합하는 방법뿐만 아니라, 쿨렉스 피피엔스의 여성 모기가 계란을 낳는 방법과 CRISPR / Cas9 매개 게놈 편집을 위해 그 계란을 준비하고 주입하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 원하는 돌연변이가 얻어졌다는 것을 확인하기 위하여 주입된 태아 및 그들의 자손을 후면, 교차 및 스크린하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 컬렉스 피피엔스의벅아이 균주에서 관심 있는 유전자, 사이클에대한 null 돌연변이를 생성했습니다. 이 균주는 원래 콜럼버스, 오하이오에서 필드 수집 모기에서 2013 년에 설립되었으며 Meuti 실험실에 의해 유지됩니다. 이 프로토콜은 쿨렉스 모기뿐만 아니라 다른 모기 종에서 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 요구하는 추가 연구에 사용될 수 있으며, 더 일반적으로 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 모든 곤충 종에 사용하는 것과 관련이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인공 멤브레인 피더</td><td>Hemotek</td><td>SP5W1-3</td><td>회사 위치 : Blackburn, UK</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td>회사 위치 : 미국 캘리포니아 칼즈배</td></tr>드 붕<tr><td>규산 유리 mirocapillary 튜브, 1mm 외경</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-6</td><td>회사 위치 : 미국 플로리다 주 사라소타</td></tr><tr><td>BV10 바늘 베벨러</td><td>셔터 기기</td><td>BV-10-B</td><td>회사 위치: 미국 캘리포니아주 노바토</td></tr><tr><td>Whatman 원형 여과지(12.5cm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001125</td><td>회사 위치: 미국 미주리주 세인트루이스</td></tr><tr><td>원추형 튜브(50mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr> 빠른 <tr><td>유속의 Fisherbrand 코스 여과지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-800</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>커버 유리(24 x 40mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-311-20</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>치과용 댐</td><td>Henry Schein Inc</td><td>1010171</td><td>회사 위치: 미국 뉴욕 멜빌</td></tr><tr><td>스카치 양면 테이프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>회사 위치: 독일 함부르크</td></tr><tr><td>Glass vial (2 dram)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>033401C</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>할로카본 오일</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>회사 위치: 미국 미주리주 세인트루이스</td></tr><tr><td>P-2000 Laser Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td>회사 위치: 미국 캘리포니아주 노바토</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-998-944</td><td>회사 위치: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>PC-100 가중 바늘 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>이것은 단종된 이전 PC-10 모델과 호환됩니다. 회사 위치: Amityville, NY, USA</td></tr><tr><td>Phire Direct PCR Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F140WH</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>Kodak Photo-Flo (1%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-268-05</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr> 석<tr><td>영 유리 미로카필러리 튜브, 1mm 외경</td><td>Capillary Tube Supplies Limited</td><td>QGCT 1.0</td><td>회사 위치: 영국</td></tr> <tr><td>콘월가이드-잇&트레이드; sgRNA 스크리닝 키트</td><td>Takara, Bio USA</td><td>632639</td><td>이 키트를 사용하면 gRNA가 in vitro에서 DNA 염기서열을 절단하는지 확인할 수 있습니다. 회사 위치: Mountain View, CA, USA</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>회사 위치: 미국 미주리주 세인트루이스</td></tr><tr><td>작은 페트리 접시(35X10mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-190-0273</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr> 구<tr><td>연산나트륨 닭 혈액</td><td>Lampire 생물학적 제제</td><td>7201406</td><td>회사 위치: 미국 펜실베니아 주 에버렛</td></tr><tr><td>Fisherbrand 광장 페트리 접시(10cm x 10 cm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>Henry Schein Inc.</td><td>7771180</td><td>회사 위치: 미국 뉴욕 멜빌</td></tr> 열<tr><td>대어 식품</td><td>테트라민</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 여과지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-927-826</td><td>회사 위치: 미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>Whatman 여과지, 4.25cm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1001-042</td><td>회사 위치: 미국 미주리주 세인트루이스</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9를 사용하여 null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

컬렉스 모기는 웨스트 나일 바이러스와 개 심장벌레와 코끼리와 같은 filarial 선충에 기인한 질병을 포함하여 인간과 동물의 건강에 부정적인 영향을 미치는 몇몇 질병의 중요한 벡터입니다. 최근에는 제네라 아노필스와 에데스에속하는 모기를 포함하여 여러 곤충 종의 갓 배치된 배아에 가이드 RNA(gRNA)로 복합된 Cas9 단백질을 주입하여 현장 지향 돌연변이를 유도하는 데 사용되어 왔다. 컬렉스 모기를 조작하고 주입하는 것은 이 모기가 다른 모기 종처럼 뗏목에서 알을 똑바로 세우기 때문에 약간 더 어렵습니다. 여기에서 우리는 gRNA를 디자인하는 방법, Cas9 단백질로 그(것)들을 복잡하게 하고, Culex pipiens의 여성 모기를 계란을 낳기 위하여 유도하고, Cas9/gRNA를 가진 미세 주입을 위한 새로 놓인 태아를 준비하고 주입하는 방법을 기술합니다. 우리는 또한 원하는 돌연변이를 위해 주입된 모기를 후방및 스크린하는 방법을 설명합니다. 대표적인 결과는 이 기술이 Culex 모기의 게놈에 있는 사이트 지시돌연변이를 유도하기 위하여 이용될 수 있고, 약간의 수정으로, 그밖 모기 종에 있는 널 돌연변이를 생성하는 것을 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.

설명된 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 Cx. pipiens의배아를 주입할 수 있었고, 주입된 태아 중 생존율이 높은 것을 관찰하였다(~55%, 도 1). 이전 시험은 달걀 여포의 전방이 의학 드레싱 스트립에 부착되었기 때문에 생존의 비율이 낮았으며, 모기 유충이 초리온에서 탈출하고 성공적으로 물로 수영하는 것을 막았습니다. 전방 끝이 의료 드레싱의 스트립을 넘어 크게 증가 애벌레 생존을 보장하고, 성인기및 재생(그림 2B)에개발 할 수있는 고품질자에서 초래한다.
후속 실험 및 스크리닝은 circadian 클럭 유전자주기(cyc;)에대한 null 돌연변이를 나타낸다. KM355981)은 주입된 배아의 세균선으로만들었다(도 3). 우리의 프라이머가 절단 부위 근처의...

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 위해 모기 배아를 준비하고 주입하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 마이크로 주입 기술의 주요 장점은 모기 생존율이 높고 연구자들이 유전자의 기능을 결정할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 Culex 속에 속하는 모기를 주입하기 위해 특별히 조정되었습니다.이 모기는 웨스트 나일 열과 세인트루이스 뇌염을 일으키는 바이러스뿐만 아니라 개 심장사상충과 코끼리병을 일으키는 필라리아 선충을 포함하여 여러 병원체를 전염시킵니다. 따라서 CRISPR-Cas9 게놈 편집과 같은 도구를 사용하면 이러한 중요한 질병 요인을 더 잘 이해하고 제어할 수 있습니다. 갓 낳은 곤충 배아를 주입하고 생존율을 높이려면 많은 시간, 연습 및 인내가 필요합니다.따라서 돌연변이를 생성하기 위해 값비싼 물질을 주입하기 전에 여러 배아에 유색 식염수 용액을 주입하는 것이 좋습니다. 주사 바늘에 주사 혼합물을 다시 채우는 것으로 시작합니다. 선택한 주사 바늘의 뒤쪽 끝에 쉽게 들어갈 수 있는 바늘 필러 또는 젤 로딩 팁을 선택하십시오.바늘 필러 끝과 주사 바늘 사이에 약간의 공간이 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 흡입하고, 주입 혼합물을 한 방울 떨어뜨려 가늘어지기 시작하는 지점 근처의 주사 바늘에 넣습니다. 그런 다음 마이크로 인젝터에 주사 바늘을 부착합니다.배아가 들어 있는 슬라이드를 현미경의 스테이지에 놓습니다. 바늘을 열려면 약 30Psi의 시작 사출 압력을 사용하고 적절한 양의 사출 혼합물을 전달하기 위해 필요에 따라 조정합니다. 해부 현미경으로 바늘을 모기 배아 위에 놓고 미세 조작기를 조심스럽게 사용하여 바늘을 배아 위로 내립니다.바늘이 배아에 거의 닿지 않으면 배아를 바늘의 긴 축에 수직으로 빠르게 움직입니다. 바늘이 성공적으로 열렸는지 확인하려면 주입 트리거를 누르고 바늘에서 기포나 주입 혼합물이 새어 나오는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 바늘이 열리고 방아쇠를 눌렀을 때 주입 혼합물이 빠져나갈 때까지 모기 배아를 바늘에 대고 움직이는 것을 반복합니다.첫 번째 모기 배아를 view, 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 첫 번째 알 위에 바늘을 놓습니다. 현미경의 배율을 점진적으로 높이면서 바늘을 조심스럽게 내려 첫 번째 배아 바로 위에 유지되도록 합니다. 현미경이 최대 배율에 도달하고 배아와 바늘 모두에 초점이 맞춰질 때까지 진행합니다.배아를 약간 왼쪽으로 이동하고 바늘을 내려 배아와 같은 시야에 있도록 합니다. 현미경 스테이지를 사용하여 배아를 바늘 끝에 부드럽게 터치합니다. 모기 배아의 좁은 뒤쪽 끝은 약간 편향되어야 합니다.현미경 스테이지를 사용하여 배아의 뒤쪽 끝을 바늘 위로 옮기고 바늘이 모기 알의 융모막을 관통하는 것을 관찰합니다. 바늘은 막과 배아 내 극 세포의 대략적인 위치를 관통해야 합니다. 이 부위에 주입 혼합물을 배치하면 돌연변이가 발생하여 생식계열에서 유전될 가능성이 높아집니다.주입 방아쇠를 1-3회 당겨 주입 혼합물을 배아에 쏘십시오. 배아 혈질의 작은 틈새가 감지될 수 있을 만큼만 소량의 주입 혼합물을 전달합니다. 스테이지를 사용하여 배아를 바늘 끝에서 오른쪽으로, 멀리 이동합니다.주사가 잘 진행되면 배아에서 액체가 거의 또는 전혀 누출되지 않아야 합니다. 다음 배아가 바늘 앞에 위치하도록 스테이지를 아래로 이동합니다. 그리고 주입을 반복하십시오.주사 혼합물이 나오지 않는 것 같거나 바늘을 제거한 후 배아에서 많은 양의 액체가 빠져 나오면 주사 바늘을 교체하고 다시 시작하십시오. 주입되지 않았거나 손상된 난자를 파괴하십시오. 슬라이드에 있는 모든 배아를 주입한 후 분무기로 역삼투압 물을 바르고 할로카본 오일을 씻어냅니다.주입된 배아 위의 유리 커버 슬립 상단으로 물줄기를 향하게 하고 물이 커버 슬립 아래로 흐르도록 하여 흐름이 배아로 향하지 않도록 합니다. 슬라이드를 150마이크로리터의 물로 덮고 정사각형 페트리 접시 안의 젖은 여과지에 놓습니다. 페트리 접시를 섭씨 25-27도, 상대 습도 70-80%로 설정하고 하루 동안 광주기로 설정하는 환경 챔버에서 배양합니다.이 프로토콜은 북부 집 모기인 Culex pipiens의 배아를 성공적으로 주입하는 데 사용되어 모기 배아의 앞쪽 끝이 의료용 드레싱 스트립을 넘어 확장되도록 하여 유충 생존율을 크게 높이고 성체로 발달하고 번식할 수 있는 고품질 자손을 낳습니다. 염기서열분석 결과, 스크리닝된 모기의 약 10%가 첫 번째 가이드 RNA의 Cas9 절단 부위 근처에 작은 삽입 또는 결실을 보였으며, 이는 극 세포가 마이크로 주입 중에 성공적으로 표적화되었음을 시사합니다. F1 개체는 성공적으로 짝짓기를 하여 생존 가능한 자손을 낳았으며, 그 중 일부는 돌연변이를 포함하기도 했습니다.곤충 배아를 마이크로 주입할 때 대부분의 사람들은 처음에 바늘을 열고 배아를 바늘로 옮기는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 기술을 개발하려면 시간과 연습이 필요하다는 것을 기억하십시오. 이 프로토콜은 다른 모기 또는 다른 곤충 종의 배아를 주입하기 위해 수정되거나 조정될 수 있습니다.이 프로토콜을 사용하여 표적 CRISPR-Cas9 게놈 편집으로 유전자를 knock-out하는 것 외에도 동일한 기술을 사용하여 플라스미드 또는 트랜스포존을 주입하여 유전자를 knock-in하거나 무작위 돌연변이를 생성할 수 있습니다. 제 연구실에서는 현재 이 기법을 사용하여 모기가 매일 측정하고 계절 반응을 조절하는 방법을 더 잘 이해하고 있습니다. 그러나 우리 연구자들은 여러 유기체의 생물학을 더 잘 이해하기 위해 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 사용하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 배아 미세주입 기술을 통해 Anopheles gambiae 모기의 배아에 유전자 드라이브 구조를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 상동 재조합을 통해 전달된 DNA 구조를 생식세포 세포에 통합하여 형질전환된 모기 개체군을 생성할 수 있습니다.

모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.

샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

여기에서는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 통해 게놈을 수정하거나 생식계열 형질전환을 통해 표시된 전치 요소를 추가할 목적으로 세포 전 옥수수 식물 호퍼 배아를 수집하고 미세 주입하기 위한 프로토콜입니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

배우세요 CRISPR/Cas9를 사용하여 Culex pipiens 모기 배아를 주입하고 준비하는 방법. 이 기술은 높은 생존률로 유전자 기능을 분석하고 질병 매개체 제어 전략에 활용할 수 있습니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

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