Name: 시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 배우세요 미세유체 칩을 이용한 단백질 결정화 및 실시간 X선 회절 분석 방법을. PDMS와 투석막을 활용한 이 기술은 소량 시료로 결정 조건을 정밀 제어하며 고해상도 구조 분석을 가능하게 합니다.

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MBS는 2014-2015 년 한도에서 계약 계측에 따라 MI / CNRS의 지원을 인정합니다. NJ는 CEA의 국제 박사 과정 연구 프로그램 (Irtelis)을 박사 학위 펠로우십에 대해 인정합니다. MBS와 SJ는 마리 스크와도우스카-퀴리 보조금 계약 번호 722687에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 인정합니다. MBS, SJ, NJ는 미세 제조 실험을 위한 클린룸 설립에 대해 LIPhy(UGA)에 감사드립니다. IBS는 그르노블의 학제 간 연구소 (IRIG, CEA)에 통합을 인정합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

마이크로 유체 장치는 마이크로 투석 방법을 사용하여 온칩 단백질 결정화를 위해 개발되었으며 실온에서 X 선 회절 실험이 발생했습니다. NOA 81 칩은 온칩 단백질 결정화를 위해 마이크로 투석증을 사용하기 위해 모든 MWCO의 RC 투석 막을 통합할 수 있습니다. 상대적으로 높은 X선 투명도를 가진 제조 재료가 사용되어 칩이 시상 단백질 결정학에 호환되는 렌더링되었습니다. 장치의 단백질 결정화를 위한 구획을 구성하는 제조 재료(PMMA, Kapton, RC 투석 막)는 낮은 배경 잡이를 생성하도록 평가되었다. 구체적으로, 투석칩에 의해 생성된 배경 잡음은 주로 저해상도(> 6Å)에서 관찰되며 단백질 구조 결정에 필요한 대형 리조지메 결정의 고해상도 회절 데이터의 치료에영향을 미치지 않는다. 데이터 수집의 자동화는 매크로 분자 결정빔라인에 직접 장착하고 최대 3개의 마이크로칩을 동시에 운반할 수 있는 3D 프린팅 지지대를 사용하여 증폭됩니다. 이러한 방식으로, 깨지기 쉬운 단백질 결정의 수동 수확 및 조작은 피한다. 더욱이, 데이터 수집은 상온에서 이루어지며, 토착 단백질 구조2,3으로부터의형성적 변화와 관련될 수 있는 극저온 보호의 필요성을 피한다.
마이크로투아실시스를 온칩에서 결정화를 성장시키는 방법으로 사용하면 결정화 공정을 정확하게 모니터링하고 제어할 수 있습니다. 도입에서 논의된 바와 같이, 종래의 단백질 결정화 방법의 대부분은 미세유체장치(11,14)를사용하여 구현되었다. 그러나, 단백질 결정화를 위한 투석의 이점은 아직 마이크로스케일에서 완전히 이용되지 않았습니다. 온칩 마이크로투아섭시스는 동일한 단백질샘플(19)을사용하여 위상 다이어그램을 연구하고 결정화 조건의 선별 및 최적화를 수행할 수 있는 가능성을 제공한다. 이 작품에 제시된 프로토타입의 경우 칩당 단백질 소비량은 0.1 또는 0.3 μL로 제한됩니다. 제조 프로토콜은 많은 단계를 포함하지만 간단하고 상대적으로 저렴한 재료와 깨끗한 방에서 하루에 수많은 장치 (20 ~ 30 칩)의 제조를 가능하게한다. 그러나, 단백질의 온칩 결정화는 핵형성과 결정성장, 특히 마이크로스케일의 본질적인 금방 특성으로 인해 섬세한 절차가 될 수 있다. 현장 X선 회절 데이터 수집에 적합한 견고하고 잘 정의된 결정을 산출한 리소지메의 결정화에 잘 설정된 조건이 사용된 사례 연구가 설명되었습니다. 그럼에도 불구하고 결정화 배지가 훨씬 더 복잡하고, 위상 다이어그램이 알려지지 않고 잘 작동하는 결정화 조건이 아직 잘 확립되지 않은 막 단백질과 같은 더 도전적인 단백질 표적을 사용하면 어려움이 발생할 수 있습니다. 투석 칩은 단지 미세 유체 채널 내에서 결정화 용액을 교환하여 귀중하고 자주 비용이 많이 드는 단백질 샘플을 폐기하지 않고 이러한 어려움을 능가하고 칩상 다이어그램을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다.
미세 유체 장치의 다기능성은 결정화 조건과 낮은 단백질 볼륨을 사용하여 다양한 위상 다이어그램을 가역적으로 제어하기 위해 온칩 단백질 결정화를 위한 미세 투약을 악용하는 데서 비롯됩니다. 더욱이, 이 장치는 시투 X선 회절 실험과 호환되며 장치의 프로토타이핑은 저렴하고 빠르다. 수용성 및 멤브레인 단백질의 수많은 동종 결정 (준비)은 칩에서 재배 될 수 있으며 이러한 모든 특징은 싱크로트론 및 XFEL 시설에서 까다로운 단백질 표적에 대한 연쇄 X 선 결정학 연구에 활용 될 것으로 예상됩니다. 마지막으로, 칩 온칩과 시테투 시간 해결 연구를 수행하는 것은 결정적 커뮤니티에 큰 관심을 가질 수 있는 미래의 가능성입니다. 따라서 투석 칩의 결정을 늘리고 시약을 미세 유체 채널에 도입하여 수동으로(주사기를 사용) 또는 자동으로(압력 제어 유체 시스템 또는 주사기 펌프사용)을 도입함으로써, 미래의 노력은 미세유체 칩을 사용하여 싱크로트론 빔라인에 대한 시간 해결 실험을 성공적으로 트리거할 수 있음을 증명하는 데 초점을 맞출 것입니다.

생물학적 거대 분자의 3차원(3D) 구조를 명확히 하는 것은 X선 결정학이 주요 조사 기술로 남아 있는 구조 생물학에서 끊임없는 추구입니다. 단백질과 같은 복잡한 거대 분자의 구조적 세부 사항을 해명하기 위해 적용, 그것은 행동의 그들의 메커니즘과 다양한 생물학적 기능에 자신의 참여의 이해를 촉진하는 것을 목표로하고있다. 싱크로트론및 X선 프리 전자 레이저(XFELs)의 강력한 X선 소스는 거의 원자 분해능에서 단백질 구조에 대한 심층적인 통찰력을 제공하는 데 필요한 모든 도구를 제공합니다. 구조 연구를 위해 엑스레이의 사용과 함께 오는 장점에도 불구하고, X 선 방사선 및 결정화 과정 자체에 본질적인 한계가 있습니다. X선 빔 앞의 단백질 결정의 높은 X선 플럭스와 긴 노출 시간에 의해 유발되는 방사선 손상은 결정화제작자가 극저온 냉각1을사용하여 능가해야 하는 제한적인 매개변수이다. 그러나, 본종 단백질 구조 또는 유물로부터의 형태 변화가2,3을은폐할 수 있기 때문에 최적의 극저온 냉각 조건을 찾는 것은 힘들 수 있다. 더욱이, 최근 연구에 따르면 실온에서 회절 실험을 수행하면 특정 방사선 손상4가낮아집니다. 구조 생물학의 또 다른 병목 현상은 충분한 크기5를가진 잘 분산된 결정의 취득입니다. 작은 결정은 특히 막 단백질의 경우 생산하기 쉽지만, 더 큰 단백질 결정6의경우에 비해 높은 방사선 량이 더 적은 부피로 지시되어야하기 때문에 냉동 냉각 조건 하에서도 방사선 손상에 더 취약하다. 연속결정7,8싱크로트론 및 XFELs의 새로운 접근법은 방사선 손상억제를 우회할 수 있으며 동시에 작은 결정(200nm ~ 2μm)을 여러, 이소정형 및 임의 지향적 단백질 결정으로부터 병합하고, 펨토초 펄스, 짧은 노출, 마이크로 빔 1,마이크로 빔등관련 기술 발전으로부터 이익을 얻음으로써 더 작은 결정(200nm ~ 2 μm)을 이드로 활용할 수 있다.
미세 유체 기술은 생물학적 거대 분자의 결정화 및 구조적 조사를 위한 매니폴드 이점을 나타내는 X 선 결정학에 중요합니다. 미세 유체 장치에서 결정화 실험을 수행하려면 소량의 단백질 샘플이 필요하므로 이러한 고평가 된 바이오 거대 분자의 생산 비용을 제한하고 수많은 결정화 조건의 고처리량 선별 및 최적화를 용이하게합니다. 더욱이, 내재된 큰 표면적-부피 비는 미세유체 스케일 및 확산 제한 수송 현상에서 유동 및 온도 또는 농도 그라데이션11,12,13,14에미세한 제어를 가능하게 하며, 균일하게 크기의 결정성장과 탐사 단계 다이어그램15,16,17,18, 19,19. 더욱이, 미세유체 공구는 견본 납품인 단백질 결정학에 있는 또 다른 장애물을 해결하는 특유의 잠재력을 표시하고, X 선 회절 실험에 사용하기 전에 단백질 결정을 취급하고 수확하는 필요성. 온칩 및 시투 X선 결정예그래피의 방법은 데이터 수집 전에 결정 조작 및 결정 품질의 잠재적 저하를 제거합니다. 시투 X선 단백질 결정촬영에 적합한 광범위한 미세 유체 칩은 마이크로 패브릭 재료의 특성과 X선14,19,20,21,22, 23과의상호 작용에서 발생하는 관련 제한에 직면한 많은 연구 집단에 의해설계,개발 및 테스트되었습니다. 제조 재료는 광학적으로 투명하고 생물학적으로 불활성이어야 하며 X 선 방사선에 대한 높은 투명성과 데이터 수집 중에 최적의 신호 대 잡음 비율을 입증해야 합니다.
종래의 단백질결정학(24)에적용된 결정화 방법의대부분은,25도 마이크로유체척도(11)에서구현되었으며,14에서는 칩 결정화 및 현장에서 X선 회절 분석이 구현되었다. 증기확산(26),증발(27),자유 인터페이스 확산(FID)28, 마이크로배치(26)또는파종(29)을 통합한 단순, 하이브리드 또는 다층 미세유체 장치는 수용성 및 막 단백질을 결정화하는 데 사용되어 왔다. 결정화 조건의 높은 처리량 스크리닝 및 최적화는 잘 기반한32,물방울 계33,또는 밸브 작동34 장치에서30,31을 달성할 수 있다. 시투에서 실온에서 도전적인 단백질 표적의 X선 회절 실험은 PDMS(폴리디메틸실록산), COC(순환 올레핀 중합체), PMMA(폴리(메틸 메타크릴레이트) 등 다양한 물질로부터 제조된 마이크로칩에서 수행되었습니다.11,22,26,28,29,그래핀 필름23,Kapton35,에폭시 접착제6,또는 NOA (Norland 광학 접착제)19 및 X 선 방사선에 대한 재료의 투명성 및 배경 소음에 대한 기여도가 평가되었습니다. 더욱이, 마이크로칩은 싱크로트론 소스23,35,36 및 XFELs7에서X선 단백질 결정학 실험을 위한 단일 공구에 시투 및 직렬 데이터 수집 전략을 결합하도록 설계되었습니다.
시투 데이터 수집의 실온도 다양한 전달 방법 및 장치에서 구현되고 있다. 예를 들어, Nogly et al.54는 XFEL 소스를 사용하여 연쇄 펨토초 결정학(SFX)에 의해 광구동 광자 펌프 박테리오호도프신(bR)의 구조를 연구하기 위해 립디입방상(LCP) 인젝터를 사용했다. bR의 결정 구조는 2.3 Å 해상도로 해결되었으며, 시간 해결된 연재 된 연재 펨토초 결정학 (TR-SFX)과 LCP 인젝터의 호환성을 입증했습니다. 박스터외. 55는 다양한 크기의 레이저 컷 구멍이있는 100 또는 200 μm 두께의 폴리 카보네이트 플라스틱으로 제작된 고밀도 다중 결정 그리드를 설계했습니다. 추가 5 μm 두께의 폴리 카보네이트 필름은 앉아서 또는 매달려 드롭 결정화 실험을 위해 장치를 사용할 때 그리드의 한쪽에 고정 될 수있다. 이러한 고밀도 그리드는 결정이 디바이스의 포트에 직접 적재될 수 있거나 결정이 증기 확산 또는 LCP 방법에 의해 장치에서 재배될 수 있기 때문에 여러 가지 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 그리드는 표준 자기 기저에서 조절하고 극저온 또는 실온 조건에서 시투 X선 데이터 수집에 사용될 수 있다. 최근에는, Feiler외. 56은 최소한의 배경 소음 기여도를 가진 극저온 및 주변 온도에서 시투 X 선 결정학에서 매크로 분자용 샘플 홀더를 개발했습니다. 구체적으로, 홀더는 플라스틱 지지대, 투명한 COC 호일 및 미세다공성 구조의 폴리이미드 호일로 구성된다. 결정화 낙하를 설정하기 위해 일반적으로 사용되는 커버 슬라이드를 교체하는 동시에 결정화 낙하를 열거나 수동으로 수정을 처리하지 않고도 리간드 담그기, 복잡한 형성 및 극저온 보호와 같은 장소에서 조작할 수 있도록 설계되었습니다. 더욱이, 샘플 홀더는 결정화 플레이트에서 제거하고 표준 곤니오미터 계열 빔라인에서 시투 데이터 수집을 위해 자기 베이스에 배치될 수 있다. 주변 온도 데이터 수집의 경우, COC 호일은 실험 전에 제거되고 21 μm 두께의 폴리이미드 호일만이 배경 산란에 기여하며, 이 경우 최소한의 배경 산란에 기여합니다. 이 예는 진행중인 연구와 X 선 단백질 결정학을 위해 개발 된 다재 다능한 마이크로 칩의 무리의 작은 부분만 구성합니다.
그러나, 투석 단백질 결정화 방법은 미세유체내에 널리 통합되지 않았다. 투석은 단백질 결정화를 위한 명목 농도에 접근하고 결정화조건(24)에정밀하고 가역적인 제어를 가능하게 하기 위해 반투과성 멤브레인을 통해 침전물 농도의 평형을 목표로 하는 확산 기반 방법입니다. 반투과성 투석막의 분자량 컷오프(MWCO)는 거시분자의 분자량과 침전제의 분자량에 따라 선택될 수 있어 관심의 거대 분자를 유지하면서 작은 침전물 분자의 확산을 허용할 수 있다. 투석 과정의 가역성으로 인해 동일한 단백질 샘플을 사용하는 동안 침전물 농도를 변경하여 위상 다이어그램을 조사하기위해 독립적으로 핵형성 및 결정 성장을 최적화하기 위해 온도 조절과 결합하여 사용될 수 있다. 미세유체학내 멤브레인의 통합은 de Jong외. 38에 의해 검토되고, 마이크로칩으로 투석을 이식하는 생물학의 사례 연구는 주로 샘플 제제, 농도 또는 여과 응용39,40,41,42 또는 세포 관련 연구43,44에열거될 수 있다. PDMS를 통한 보급은 심외37에 의해 다양한 조건에서 자일라나제의 핵형성 및 성장을 연구하는 데 사용되었다. 물은 15 μm 두께의 PDMS 멤브레인을 통해 미세 유체 장치의 단백질 저장소로 침투하여 단백질과 침전제 농도를 변경합니다.
주니우스 외19,45에 의해 개발된 프로토콜은 마이크로투아진을 통해 및 실온에서 시투 X선 회절 실험을 모두 호환되는 마이크로유체 칩의 제조를 위해 제시된다. 장치 제작 프로토콜은 스터드와 동료가 수행 한 선구적인 작업에서 직접 영감을 받아12,46 은 부드러운 각인 리소그래피를 사용하여 시판되는 현작 을 포함시키는 사진 치료 가능한 티올렌 기반 수지 NOA 81의 마이크로 패턴 스티커에 대해 서술합니다. 이 방법의 혁신적인 변형으로 마이크로칩을 사용하여 단백질 결정의 온칩 성장을 위한 실험 파라미터를 정확하게 모니터링하고 제어하고 실험당 단백질 샘플 소비 감소(<1 μL)와 같은 미세유체의 이점을 동시에 활용할 수 있게 되었습니다. 전작에서는 온도-침전성 농도 상 도면을 매핑하여 결정화 조건을 선별및 최적화하기 위한 거시적 규모의 시스템(일반적인 부피 >20 μL)에 적용된 투석 원리를입증하였다. 이 작품에서, 프로토콜은 칩에 결정화 분석과 시투 X 선 회절 데이터 수집을 수행하기 위해 다른 MWCO의 재생 셀룰로오스 (RC) 투석 막을 통합 투석 마이크로 칩을 생산하기 위한 설명이다. 마이크로칩을 포함하는 물질은X선(19)에 대한 투명성을 평가하고, 장치는 수동 취급을 배제하고 깨지기 쉬운 단백질 결정의 분해를 최소화하는 시투 회절 실험에서 실온을 위해 X선 빔 바로 앞에 설정할 수 있다. 사례 연구에서, 암탉 계란 흰자 리소지메 결정은 균일하게 크기의 인구를 생성 미세 투석을 통해 칩에 성장했다. 마이크로칩은 3D 프린팅지지19를 사용하여 X선 빔 앞에 장착되었고, 현장에서 회절 데이터 세트를 다중, 동질결정에서 실온에서 수집하여 까다로운 거시 분자 표적에 대한 싱크로트론 연쇄 결정학 연구를 위한 칩의 높은 잠재력과 관련성을 입증하였다.

<table><tbody><tr><td>3 웨이퍼</td><td>실리콘 재료 Inc.</td><td></td><td>실리콘 웨이퍼</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin</td><td>벤치탑 원심분리기</td></tr><tr><td>CleWin 3.0</td><td>WieWeb 소프트웨어</td><td></td><td>설계 소프트웨어</td></tr><tr><td>에폭시 접착제</td><td>Devcon</td><td></td><td>5분 에폭시 접착제</td></tr><tr><td>유체 커넥터</td><td>Cluzeau Info Lab</td><td>N-333</td><td>NanoPort 키트 for 1/16" OD 튜빙</td></tr><tr><td>암탉 달걀 흰자 라이소자임</td><td>Roche</td><td>10 837 059 001</td><td>동결건조 단백질 분말</td></tr><tr><td>고진공 실리콘 그리스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Dow Corning&nbsp; 고진공 실리콘 그리스</td></tr>, <tr><td>HMDS</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>, 440191</td><td>실란, 케미컬</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td>, <td>Sawatec</td><td>HP-200-Z-HMDS, BM</td><td>핫 플레이트</td></tr><tr><td>, 이소프로필 알코올</td><td>, 시그마-알드리치</td><td></td><td>솔벤트</td></tr>, <tr><td>캡톤 테이프</td>, <td>듀퐁</td><td></td><td>폴리이미드 테이프</td></tr>, <tr><td>마스크 얼라인너</td><td>, SUSS MicroTec</td><td>MJB4</td>, <td>마스크 얼라인너, UV 소스</td></tr><tr><td>멤브레인 필터</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>0.22 &mu; m 기공 크기 필터</td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12164682</td><td>3 x 1 in 유리 슬라이드</td></tr><tr><td>NOA81</td><td>Norland Products Inc.&nbsp;</td><td>NOA81</td><td>광경화 수지</td></tr><tr><td>오븐</td><td>Memmert</td><td></td><td>오븐</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6543</td><td>파라필름 M 롤 사이즈 20&nbsp; 안으로. &시간; 50&nbsp; ft</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>다우 코닝</td><td>실가드 184</td><td>실리콘</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>햄프턴 리서치</td><td>HR2-603</td><td>화학</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5731</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>시그마-알드리치</td><td>484431</td><td>현상액</td></tr><tr><td>플라즈마 장비</td><td>Diener 전자</td><td>ZEPTO</td><td>플라즈마 처리</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>굿펠로우</td><td>137-745-63</td><td>PMMA 시트 150x150mm, 0.175mm</td></tr><tr><td>두께 압력 구동 시스템</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td>압력/진공 컨트롤러</td></tr><tr><td>PTFE 튜빙</td><td>Elveflow/Darwin 미세유체역학</td><td>LVF-KTU-15</td><td>PTFE 튜빙 롤 1/16" OD X 1/32" ID</td></tr><tr><td>RC 투석막</td><td>Spectra/Por</td><td></td><td>다양한 MWCO</td></tr><tr><td>메스</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td>탄소강 수술 용 블레이드</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S2889</td><td>화학</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>746398</td><td>화학</td></tr><tr><td>솔리드웍</td>스 <td>다쏘 시스템</td><td></td><td>3D-CAD 설계 소프트웨어</td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>SPS</td><td>Spin150</td><td>웨이퍼 스피너</td></tr><tr><td>SU-8 3000 시리즈</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3050</td><td>감광액</td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL Luer-Lok 주사기</td></tr><tr><td>UV 가교제</td><td>Uvitec</td><td>CL-508</td><td>UV 가교제</td></tr></tbody></table>

시투 x선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

이 프로토콜은 투석 방법으로 온칩단백질을 결정화하고 실온에서 단일 결정 또는 일련 결정예 실험을 허용하는 전체 파이프라인을 포괄하는 재현가능하고 저렴한 미세 유체 장치의 제조를 설명합니다. 이 프로토콜은 마이크로칩의 제조 공정, 온칩 결정화 실험의 조작 및 단백질 샘플의 구조적 용해를 위한 X선 회절 데이터를 수집한 시상 내의 치료에 대해 자세히 설명합니다. 이 미세 제조 절차의 주요 특징은 칩의 두 층 사이에 시판 되는 반투과성 재생 셀룰로오스 투석 막의 통합에 있다. 임베디드 멤브레인의 분자량 절단은 거대 분자와 침전제의 분자량에 따라 달라집니다. 이 장치는 미세 유체 기술의 장점을 악용, 샘플의 분 볼륨의 사용 (<1 μL) 및 운송 현상을 통해 미세 조정. 칩은 투석 방법과 결합하여 결정화 공정에 대한 정확하고 가역적인 제어를 제공하며 마이크로리터 척도에서 단백질의 위상 다이어그램을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 장치는 광학적으로 투명한 폴리머기 기판에 부드러운 각인 리소그래피를 가진 광치료성 티올렌 기반 수지로 패턴화된다. 더욱이, 마이크로칩을 구성하고 배경 잡음 생성재료의 배경 산란이 시투 X선 회절 실험에서 칩과 호환되는 렌더링을 평가하였다. 단백질 결정이 적절한 크기와 균일성까지 칩에 재배되면 마이크로칩을 X선 빔 앞에 직접 장착할 수 있으며 3D 프린팅 홀더를 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 쉽고 저렴한 방식으로 기존의 단백질 결정학 실험에서 극저온 보호제 및 수동 수확으로 발생하는 문제를 해결합니다. 칩상에서 자란 여러 개의 이소성 리소지메 결정으로부터 완전한 X선 회절 데이터 세트를 실내 온도에서 수집하여 구조 결정을 내렸다.

이 논문은 투석 방법과 시투X선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세유체 칩의 제조 프로토콜을 자세히 설명합니다. 미세 제조 공정을 통해 반과소성 재생셀룰로오스 투석 막을 칩의 두 층 사이에 분자량 차단과 통합할 수 있습니다.

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

이 논문은 투석 방법과 실온에서 시투 X 선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세 유체 칩의 제조 프로토콜을 설명합니다. 이러한 마이크로칩의 주요 장점 중 하나는 제조 재료의 선택으로 실온에서 시투 X선 회절 데이터 수집에 호환되는 칩을 렌더링하는 것입니다. 온칩 결정화 실험은 소량의 단백질 샘플이 필요하며, 이러한 고부가가치 거대 분자로 작업하는 전체 비용을 줄입니다.온칩 결정화는 또한 기존의 결정학 실험 중에 극저온 냉각과 함께 자주 적용되는 연약한 단백질 결정의 수동 수확을 제거합니다. 또한, 당사의 마이크로칩은 단백질 결정화를 위한 미세투약제(microdialis)를 사용하며, 이는 반투과성 멤브레인을 통해 침전물 농도를 평형화하는 것을 목표로 하는 확산 기반 방법이며, 단백질 결정화를 위한 크로물성 농도에 접근하고 결정화 조건에 대한 정확하고 가역적인 제어를 가능하게 합니다. 온도 조절과 결합된 미량 투약은 동일한 단백질 샘플을 사용하는 동안 침전물 농도를 변경하여 위상 다이어그램을 조사하기 위한 결정 성장으로부터 핵을 분리하는 데 사용될 수 있다.먼저 50 그램의 PDMS 실리콘 베이스를 준비하고 10 대 1 질량 비율로 경화제입니다. 두 가지 재료를 비커에 주걱으로 섞습니다. 혼합 후, 모든 기포를 제거하기 위해 진공 챔버에 혼합물을 배치합니다.제1 SU8에 25그램의 미리 혼합된 PDMS를 넣어 미세 유체 채널과 기둥의 패턴을 최대 5밀리미터까지 마스터합니다. 그런 다음 나머지 25그램의 PDMS를 두 번째 SU8 마스터에 부어 기둥의 패턴만 포함합니다. 오븐에서 2개의 PDMS 층을 338 켈빈에서 1시간 동안 치료합니다.SU8 마스터의 패턴 주위에 경화 된 PDMS 층을 메스로 자르고 실리콘 마스터에서 PDMS 금형을 부드럽게 벗깁니다. 위쪽으로 향하는 패턴이 있는 견고한 현미경 유리 슬라이드에 채널과 기둥을 모두 갖춘 PDMS 금형을 배치합니다. 단백질 챔버로 설계된 PDMS 금형의 중앙 기둥을 커버하기 위해 재생 셀룰로오스 투석 막의 작은 조각을 잘라.투석막의 분자량 차단은 단백질 샘플의 분자량 및 결정화 용액의 침전제에 따라 선택된다. 그런 다음 재생된 셀룰로오스 투석 막의 건조 조각을 조심스럽게 분리합니다. 분리된 투석 막의 작은 조각을 잘라냅니다.멤브레인의이 조각의 크기는 칩의 디자인에 따라 달라집니다. 그리고 구체적으로, 그것은 중앙 기둥의 치수에 따라 달라집니다. 유리 슬라이드에서 지원되는 PDMS 금형의 중앙 기둥에 투석 막조각을 예치하고 기둥과 채널이 위쪽으로 향합니다.그런 다음 두 번째 PDMS 금형은 유리 슬라이드에서 이미 지원되는 PDMS 금형 위에 아래쪽을 향한 기둥만 을 특징으로 합니다. 두 PDMS 금형의 모든 기둥을 정렬합니다. 재생된 셀룰로오스 투석 막의 조각은 PDMS 금형의 두 중앙 기둥 사이에 끼어 있습니다.제조 절차의 이 단계는 광학 현미경에서 또는 단순히 모든 기둥의 정렬을 주의 깊게 검사하여 수행 될 수있다. PDMS 금형 내의 갇힌 기포를 제거하고, 포토치료 가능한 NOA 수지의 삽입을 강화하기 위해 진공 챔버에 조립을 배치하고 30분 동안 담정을 하고, 이 프로토콜의 다음 단계에서 설명될 것이다. 진공 챔버에서 어셈블리를 제거하고 모세관 임비비티온에 의해, 포토 치료 가능한 티올린 계 수지, NOA 81로 두 PDMS 금형 사이의 빈 공간을 채웁니다.어셈블리의 네 면 중 3개에 수지를 적용합니다. 조립을 크로스 링커에 놓고 평방 센티미터당 35밀리와트의 정렬 된 UV 램프를 사용하여 8 초 동안 UV 광에 노출하여 NOA 수지를 치료하십시오. 현미경 유리 슬라이드의 표준 치수에 175 마이크로 미터 두께의 PMMA 조각을 잘라, PMMA 조각의 각 측면에서 플라스틱 보호를 벗겨.첫 번째 UV 노출이 완료되면, 상하 PDMS 금형및 유리 슬라이드에서 부분적으로 교차 연결된 NOA 수지로 상부 PDMS 몰드를 제거합니다. 상부 PDMS 금형의 어셈블리와 PMMA 조각에 부분적으로 경화된 NOA 수지의 조립을 부드럽게 누릅니다. 새로운 어셈블리를 크로스 링커에 놓고 UV 광에 60초 동안 노출하여 NOA 수지를 다시 치료합니다.상부 PDMS 금형을 조심스럽게 제거합니다. 완전히 교차 링크 NOA 수지로 만든 투석 칩은 재생 셀룰로오스 투석 막을 포함하고 PMMA 조각에 지원되는 준비가되어 있습니다. 빠른 에폭시 접착제와 미세 유체 채널의 입구 및 출구 지점에 상업적으로 이용 가능한 커넥터를 결합합니다.유체 처리의 경우 커넥터 크기에 따라 PTFE 튜브의 직경을 선택합니다. 튜브는 투석 칩의 유체 채널 내에서 결정화 용액의 도입에 사용됩니다. 파이펫은 투석 막 바로 위에 위치한 단백질 저장소 내부의 단백질 샘플의 액적입니다.단백질 액적의 부피는 사용되고있는 마이크로 칩의 설계에 따라 달라집니다. 그리고 구체적으로, 그것은 중앙 기둥의 부피에 따라 달라집니다, 그것은 0.1 또는 0.3 마이크로 리터 가 될 수 있습니다. 단백질 저장소 주변에 고진공 실리콘 그리스의 얇은 층을 조심스럽게 적용하십시오.PMMA의 작은 조각을 잘라 부드럽게 실리콘 그리스의 얇은 층 위에 배치합니다. 단백질 저장소 위에 놓인 PMMA 조각을 커버하고 모든 가장자리 주위에 NOA 칩에 충실 할 만큼 큰 Kapton 테이프조각을 잘라. 단백질 샘플은 저수지 내에 캡슐화되고 칩은 결정화 실험에 사용될 수 있다.먼저 버퍼 및 침전제 용액의 적절한 볼륨을 혼합하여 결정화 용액의 약 500 마이크로리터를 준비합니다. 주사기와 함께 수동으로 또는 자동화된 압력 구동 시스템을 통해 투석 칩의 지점에 결정화 솔루션을 주입합니다. 유체 채널이 결정화 용액으로 채워지고 공기가 안에 갇히지 않으면 파라필름 테이프로 칩의 입구및 출구 포트를 밀봉하십시오.파이펫 단백질 저장기 내에서 단백질 용액의 적절한 볼륨을 캡슐화하고 이미 설명된 바와 같이 단백질 샘플을 캡슐화한다. 단백질 결정 성장은 디지털 카메라로 시각화및 기록될 수 있습니다. 투석 마이크로칩의 제조를 위해 광학적으로 투명하고 생물학적으로 불활성 물질을 선택하여 시투 X선 회절 실험에서 높은 호환성을 입증했습니다.X선 빔의 직접 경로에 있는 칩의 단백질 구획을 포함하는 재료에 의해 생성된 배경 잡음이 평가되었다. 단백질 컴파트먼트는 재생된 셀룰로오스 투석 막, Kapton 테이프 및 2개의 PMMA 층으로 구성되며, 하나는 마이크로칩의 기판으로 사용되며, 하나는 단백질 샘플의 캡슐화에 사용된다. 이 사진에서는, Kapton 테이프, 재생된 셀룰로오스 투석 막, PMMA 층 및 그들의 조립에 의해 생성된 배경 잡음이 도시된다.광치료 가능한 수지 NOA가 마이크로칩의 본체를 포함하더라도 단백질 챔버의 일부가 아니기 때문에 이 측정에는 포함되지 않는다. 물질과의 X선의 상호 작용에 기인하는 확산 고리는 4개의 협질보다 낮은 해상도에서 Kapton 테이프, 4-8 개의 협질기 사이 PMMA 및 4 5 개의 협스트롬 사이의 투석 막에 대해 볼 수 있습니다. 칩에 의해 생성된 총 배경 잡음은 주로 6개 앙스트롬 보다 낮은 해상도로 관찰되며, 이는 리소지메 고해상도 회절 데이터의 처리가 영향을 받지 않음을 나타낸다.마이크로칩은 X선 회절 실험을 위해 설계된 3D 프린팅 지지대를 갖춘 X선 빔 앞에 장착되었으며 최대 3개의 칩을 동시에 보유할 수 있습니다. 실험은 마이크로투아연증 방법을 이용한 모델 용용성 단백질의 온칩 결정화를 위한 마이크로칩의 효율을 평가하기 위해 수행되었다. 리소지메 크리스탈은 두 가지 조건에서 293 켈빈에서 재배되었다.첫 번째 결정화 조건은 염화 나트륨 1.5 및 0.1 어금니 나트륨 아세테이트를 포함했다. 제2 결정화 조건에는 염화물 나트륨 1개, 어금니 나트륨 0.1, 폴리에틸렌 글리콜 400이 포함되어 있으며, 고분자 량 및 점성 용액의 침전제를 사용하여 마이크로칩및 미세투석 방법의 호환성을 보여주기 위해 선택되었다. 결정화 실험은 정적 조건하에서 수행되었다.일단 리소지메 결정이 마이크로칩에서 재배되면 실온에서 시투 X선 회절 실험에 사용되었습니다. 마이크로칩은 3D 프린팅 지지대를 지원하여 빔 라인에 장착되었으며, 완전한 X선 회절 데이터 세트는 두 개의 리소지메 결정으로부터 수집되었다. X선 회절 데이터의 처리 후, 단일 리소지메 결정의 전자 밀도 맵은 그림 A.Figure B에서 와 같이 1.95 앙스트롬 해상도로 얻어졌으며, 이는 1.85 앙스트롬 분해능에서 얻은 전자 밀도 맵을 나타낸다.두 개의 서로 다른 리소지메 결정에서 얻은 두 개의 데이터 세트를 병합한 후, 두 전기 밀도 맵은 단일 또는 다중 단백질 결정에서 실온에서 투석 마이크로칩에서 직접 수행된 시투 X선 회절 실험에서 얻을 수 있는 상세한 구조적 정보를 보여줍니다. 우리는 마이크로 투석 방법을 사용하여 온칩 단백질 결정화를 위해 설계된 미세 유체 장치에 대한 제조 절차를 시연하고 실온에서 X 선 회절 실험에서 시연했습니다. 우리는 높은 X 선 투명도를 가진 제조 재료를 사용했으며, 시상 단백질 결정예 촬영에 적합합니다.회절 데이터 수집은 칩에 대한 3D 인쇄 지지대를 사용하여 자동화되며, 이는 거시분자 결정학 빔 라인에 직접 장착할 수 있습니다. 이 마이크로칩의 다기능성은 작은 단백질 볼륨을 사용하여 결정화 조건과 맵 위상 다이어그램을 가역적으로 제어하기 위해 미세 투과를 사용하는 데서 비롯됩니다. 장치의 프로토타이핑은 간단하기 때문에 비교적 저렴한 재료로 깨끗한 방에서 하루에 최대 30 마이크로 칩을 제조 할 수 있습니다.우리는 칩의 이러한 특징이 더 도전적인 단백질 표적의 연쇄 X 선 결정학 연구에 사용될 수 있기를 기대합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

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단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

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현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

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시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

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