라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

생물학적 조직은 세포가 다양한 기계적 신호에 노출되는 3차원 소프트 환경에서 성장합니다. 우리의 방법은 생체 역학적 반응을 조사하기 위해 3차원 방식으로 하이드로겔을 늘릴 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 라이브 이미징이 수행되는 동안 두께를 따라 하이드로겔을 균일하게 늘릴 수 있습니다.

또한 하이드로겔의 형상은 모든 크기나 모양으로 조작할 수 있습니다. 세포와 세포외 기질이 힘에 어떻게 반응하는지에 대한 지식은 조직이 어떻게 발달하고 질병이 진행되는지를 밝히는 데 중요합니다. 이는 암 치료법 및 조직 공학 모델의 잠재적인 개발로 이어질 수 있습니다.

레이저 또는 수동 절단기를 사용하여 중앙에 구멍이 있는 고무 스트립을 만드는 것으로 시작합니다. 소수성 필름의 직사각형을 실리콘 스트립보다 넓게 자르고 플라스틱 접시를 70% 에탄올로 세척합니다. 보푸라기가 없는 물티슈로 건조시킨 후 밀봉 필름을 접시에 넣고 플라스틱 랩이 한쪽 면에서 제거된 실리콘 스트립 하나를 각 밀봉 필름 조각의 중앙에 놓습니다.

피브린 겔 형성을 위해 2.5마이크로리터의 콜드 라벨링된 피브리노겐을 각 스트립의 실리콘 컷아웃에 균일하게 전달하여 각 컷아웃의 전체 둘레가 피브리노겐과 접촉하도록 하고 용액의 어느 곳에서도 공기 주머니나 기포가 형성되지 않도록 주의합니다. 즉시 2.5마이크로리터의 냉각된 트롬빈을 각 피브리노겐 용액에 직접 첨가하고 조심스럽게 피펫팅하여 용액을 빠르게 혼합하고 전체 혼합물 주위로 팁을 움직여 가능한 한 균일한 용액을 만듭니다. 혼합 후 겔 중합을 위해 뚜껑을 덮은 접시를 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.

배양이 끝나면 접시에 PBS를 충분히 추가하여 젤 실리콘 구조체를 담그고 접시에서 각 샘플을 조심스럽게 들어 올려 밀봉 필름 층이 스트립에 부착된 상태로 유지되는지 확인합니다. 실리콘의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 천천히 벗겨내고 각 실리콘 조각에서 밀봉 필름을 조심스럽게 분리한 다음 스트립을 접시에 다시 놓고 접시를 광학 현미경의 무대에 올려 놓고 샘플의 상태를 평가합니다. 스트레칭 장치에 샘플을 로드하려면 수조에 PBS를 채우고 샘플 젤이 들어 있는 실리콘 스트립을 수조 상단에 걸쳐 배치하여 스트립의 끝이 수조의 양쪽에 놓이도록 합니다.

클램프와 패브릭 스트립을 배치한 다음 모든 조각이 연결되어 컷아웃이 중앙에 있는 하나의 직선 스트립을 형성하도록 조입니다. 우물에 재료를 놓고 우물 바닥에 덮개 슬립을 고정한 다음 알루미늄 액체 우물을 스트레치 장치에 넣습니다. 웰에 1-2밀리리터의 PBS 셀 배지를 채우고 스트립 패브릭 젤 구조체를 장치에 넣습니다.

Clamp 젤의 컷아웃이 중앙에 오도록 패브릭 스트립을 브래킷에 넣은 후 핀 다운 인서트를 장치의 제자리에 조심스럽게 놓고 잠급니다. 다른 천 면을 스핀들에 놓고 잠그고 스트레칭 장치와 부착된 샘플을 컨포칼 현미경의 스테이지에 놓습니다. USB 케이블을 사용하여 마이크로 컨트롤러를 컴퓨터에 연결하고 서보 모터를 마이크로 컨트롤러에 연결합니다.

그런 다음 컴퓨터에서 스트레치 장치 제어 모듈을 열어 샘플을 이미지화합니다. 샘플이 실험에 적합한지 여부를 결정하려면 저해상도 라이브 이미징을 사용하여 전체 겔을 스캔하고 컷아웃의 내벽에 완전히 접착되어 찢어짐이나 기포 없이 뚜렷한 가장 낮은 Z 위치를 결정합니다. 현미경의 Z 위치를 확인한 후 젤과 실리콘 스트립의 형광 라벨 인터페이스를 스캔하여 둘레 전체에 걸쳐 실리콘에 대한 젤의 완전한 접착력을 확인합니다.

스캔 후 젤에 더 이상 연속성이 없을 때까지 스테이지를 Z 방향으로 이동하고 Z 위치의 상한을 확인합니다. 그런 다음 하한에서 Z 방향의 상한을 빼서 샘플 두께를 계산합니다. 샘플의 사전 스트레치 위치를 확인하려면 모듈 소프트웨어에서 Go to Zero Servo POS를 클릭하여 서보 모터가 제로 위치에 있는지 확인하고 서보 모터를 스트레치 장치에 부착하여 샘플에 부담을 주지 않도록 주의하십시오.

이미징하는 동안 더하기 하나 버튼을 클릭하여 모터를 시계 방향으로 한 번에 1도씩 이동합니다. 컷아웃의 오른쪽이 이동할 때 마이너스 1 버튼을 클릭하여 샘플을 끝에서 두 번째 위치로 반전시켜 샘플을 최소 장력 하에서 유지합니다. Set Min Servo Position을 클릭하여 기준 위치를 설정하고 전체 겔 영역의 40배 확대, 고해상도, 단일 Z 슬라이스 타일 이미지를 후처리 분석의 기준선 참조로 캡처합니다.

모든 이미지가 획득되면 원하는 스트레치 크기에 도달할 때까지 서보 모터를 초당 1도 전진시킵니다. 분석이 필요한 각 스트레치 크기에서 겔과 실리콘 사이의 계면을 스캔하여 겔이 둘레 전체의 어느 지점에서도 실리콘에서 분리되지 않았는지 확인한 다음 후처리 분석을 위해 전체 겔 영역의 고해상도 타일 Z 스택 이미지 세트를 캡처합니다. 겔 스트레칭 중 비드 응집체를 확대하고 수동으로 추적하면 축 방향 및 수직 방향의 국소 겔 변형을 계산할 수 있습니다.

일반적으로 축 방향 가닥은 실리콘 컷아웃 가장자리에서 겔 중심까지 상대적으로 선형으로 전파되며 압축 수직 변형률보다 큽니다. 여기에서는 일반적인 신축되지 않고 상대적으로 등방성 하이드로겔의 고배율 이미지와 신축 방향에서 고도로 정렬된 섬유를 묘사하는 80%의 높은 컷아웃 변형률 하에서 수소가 표시됩니다. 섬유 재배향을 분석한 결과, 섬유 정렬과 컷아웃의 외부 변형률 사이에 약 선형 의존성이 40%의 변형률까지 나타났으며, 40% 이상의 변형률에서는 중간 정도의 포화를 보였음이 섬유 배향 해석에서 나타난 바와 같이, 컷아웃에 대한 외부 변형률이 증가함에 따라 섬유 정렬이 증가하여 전체 비선형 곡선을 따라 증가함을 보였습니다.

스트레치에 대한 겔 반응은 Z 두께를 따라 비교적 균일합니다. 2D 연속 재료에 대해 수행된 이 예비 유한 요소 시뮬레이션에서 볼 수 있듯이 색상 매트의 범위는 38%에서 42%로, 이는 겔 균주가 원형 겔 영역 전체에 걸쳐 비교적 균질함을 나타냅니다. 하이드로겔이 기하학적 컷아웃의 내벽에 완전히 부착되도록 하는 것이 중요한데, 이는 접착력과 연속성이 샘플의 신뢰할 수 있는 연신을 위해 중요하기 때문입니다.

실리콘 컷아웃의 형상을 수정하면 변형률과 섬유 정렬에서 그래디언트를 프로그래밍할 수 있으므로 셀을 임베딩할 때 이러한 그래디언트에 대한 반응을 분석할 수 있습니다.