상처 반응 중 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체의 라이브 이미징

여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 화학유인성 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량적 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다.

호중구는 국소적으로 생성된 화학 리간드에 반응하여 상처에 침투하는 중요한 염증 세포입니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 이러한 리간드에 대한 반응으로 수용체 역학을 시각화할 수 있습니다. 케모카인 수용체 리포터의 사용은 감염 및 종양 모델과 같은 다른 생리학적 환경과 다른 면역 세포로 확장될 수 있습니다.

이 방법을 사용하면 조직 백혈구의 언제 어디서 화학 유인 분자를 감지하는지 추적할 수 있습니다. 이를 통해 면역 반응이 어떻게 진행되고 해결되는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 제브라피시 유충에서 복부 지느러미 상처를 수행하려면 미세한 유충 조작이 필요하므로 실험 목적이 아닌 유충에 대해서는 몇 가지 연습이 필요합니다.

수정 후 2.5일에서 3.5일째에 마취된 제브라피시 유충을 형광 해부 스코프 아래에 놓고 형질전환 수용체 발현을 가진 유충을 선택합니다. 선택한 유충을 E3 배지가 보충된 트리카인이 함유된 120mm 페트리 접시로 옮기고 멸균 메스를 사용하여 꼬리 조혈 조직 혈관을 절단하지 않고 상당한 호중구 동원을 유발할 수 있을 만큼 충분히 깊게 절단한 각 유충의 복부 지느러미를 절단합니다. 유리 바닥 접시에 500마이크로리터의 2X 트리카인을 넣은 다음 500마이크로리터의 아가로스 용액을 넣고 피펫 팁으로 부드럽게 저어 섞습니다.

피펫을 사용하여 부상당한 마취된 제브라피시 유충을 접시로 옮기고 배아를 옆으로 향하게 하면서 물고기의 꼬리 부분이 유리 바닥에 최대한 가깝도록 부드럽게 아래로 누릅니다. 배아가 제자리에 있으면 아가로스를 식히십시오. 5-10분 후 작은 페인트 브러시로 젤을 부드럽게 만져 응고를 확인하고 트리카인 1밀리리터당 0.2밀리그램이 보충된 E3 배지 2밀리리터를 플레이트에 추가합니다.

회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 상처 부위를 이미지화합니다. 아가로스가 굳은 후 가능한 한 빨리 배아를 컨포칼 이미징 스피닝 디스크 플랫폼으로 옮기고 스테이지 조이스틱과 현미경 대물렌즈를 사용하여 물고기를 찾습니다. 30-40X 대물렌즈를 사용하여 상처 부위에 초점을 맞추고 상처 주위를 이미지화할 필드를 선택합니다.

레이저를 선택하고 노출 시간을 조정한 다음 원하는 시간 동안 30초마다 타임랩스를 설정하고 필드를 문서화할 명시야 이미지를 얻습니다. 상처 부위의 호중구 수용체 내재화를 정량화하려면 피지에서 이미지 데이터 세트를 열고 시간 슬라이더를 사용하여 각 데이터 세트에 대한 관심 있는 대표 기간을 선택합니다. MATLAB에서 새 스크립트를 만들고 이미지 읽기, 열기, 관심 지점의 수동 선택을 위한 함수를 포함합니다.

스크립트를 실행하여 관심 프레임을 열고 분석을 위해 호중구를 클릭합니다. 복부 지느러미 상처와 꼬리 조혈 조직 모두에서 중심의 추정치를 기록하십시오. active contours 기법을 사용하여 각 프레임의 호중구를 분할하고, gray level co-occurrence matrix를 기반으로 한 호중구의 대비 계산을 포함하여 각 호중구에 대한 Gray level co-occurrence matrix의 계산을 추가하는 스크립트를 생성합니다.

모든 꼬리 조혈 조직 호중구의 평균 호중구 대비 값 계산을 포함하여 복부 지느러미의 개별 호중구에 대한 값을 별도로 저장하는 명령을 추가합니다. 상처 부위에 있는 개별 호중구의 대비 값을 꼬리 조혈 조직 호중구의 계산된 평균 대비에 대한 정규화를 포함하여 대조군, 비반응 세포에 비해 개별 반응 세포 내에서 수용체의 모양이 얼마나 점박한지를 반영하는 정규화된 대비를 얻습니다. 그런 다음 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다.

복부 지느러미 부상 후에는 꼬리 조혈 조직에서 배쪽 지느러미로 빠르게 호중구 동원이 이루어지고 부상 유도 후 30-60분 이내에 상처 가장자리에서 클러스터링됩니다. 이 분석에서 제브라피시 호중구에 의해 발현된 케모카인 수용체 CXCR1 및 CXCR2는 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. 수용체 분포 패턴은 인접 픽셀 간의 강도 차이를 보고하는 대비 메트릭을 사용하여 정량화되었습니다.

또 다른 방법은 제어된 멤브레인 마커 수준에 대한 수용체 수준의 비율을 정량화하는 것입니다. 상처 부위의 호중구 클러스터에서 수용체 내재화를 감지하기 위해 조영제 메트릭을 사용하여 상처 부위의 호중구에서 CXCR1과 CXCR2 트래픽 간의 가시적인 차이를 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 이 분석에서 상처 부위에 위치한 세포의 형광 표지된 CXCR1 내재화는 시간이 지남에 따라 증가한 반면, 형광 표지된 CXCR2는 상처의 호중구 막에 남아 있었습니다.

morpholino 처리를 통한 CXCR1 및 CXCR2 리간드의 억제는 상처 부위에서 차등 형광 표지된 CXCR1 내재화를 초래합니다. 또한, 초기 배아에서 형광 표지된 CXCR1은 수용체 리간드가 공동 발현되는 배아에서 현저하게 내재화되어 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 상처 후 가능한 한 빨리 이미징을 수행하여 상처에 호중구를 모집하는 동안 수용체 역학을 포착해야 한다는 점을 명심하십시오.

정상 유충에서 케모카인 수용체의 이미징에 이어, 연구자들은 염증 조절 장애가 있는 돌연변이 유충에서 비교 이미징을 수행할 수 있습니다.