Name: 상처 반응 중 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체의 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 학습하세요 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체 라이브 이미징 방법으로 상처 반응 중 수용체 역학을 시각화하고 정량 분석하는 기법입니다. 이 프로토콜은 면역 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 공초점 현미경 검사에 도움을 주신 Christine Holt와 Bill Harris에게 감사드립니다. 형광 타이머 백본 구축물에 대한 대런 길모어와 Tol2-Lyz 백본 벡터에 대한 Anna Huttenlocher에게 감사드립니다. Tg(mpx:GFP)i114 라인에 대해 Steve Renshaw에게 감사드립니다. 이 작업은 MRC (MR / L019523 / 1), Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i]와 아이작 뉴턴 트러스트 보조금 19.23 (n). C.C.는 MRC DTP 학생회와 Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금. H.W.는 MRC DTP Studentship의 지원을 받았습니다. H.P.는 Wellcome Trust PhD 보조금 (105391 / Z / 14 / Z)과 Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금과 MRC (MR / L019523 / 1).

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

기술된 방법은 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 계내에서 내인성 리간드에 반응하는 수용체 역학의 살아있는 이미징을 허용한다. Cxcr1/Cxcr2 호 중구 리포터의 사용은 감염, 종양 모델 또는 다른 유형의 조직 손상(14,25,26,27)과 같은 다른 생리학적 설정으로 확장될 수 있다. 또한, 내인성 수용체가 외인성 돌연변이 수용체에 의해 억제되고 구출되는 트랜스제닉 구조 라인은 면역 반응에서 특정 호중구 이동 패턴의 중요성을 해부하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있다. 예를 들어, 탈감작 장애를 갖는 Cxcr1 수용체 돌연변이체는 염증 부위(14)에서 더욱 두드러진 호중구 클러스터링을 야기한다. 이러한 기능 표현형의 이득은 상이한 생리학적 과정들, 예를 들어, 상처 복구, 감염성 질환 또는 종양 진화, 및 보체 수용체 녹다운/녹아웃 실험에서 호중구 회중의 역할을 이해하는데 사용될 수 있다. 이 방법론은 또한 사용 가능한 기자의 범위를 확대 할 수있는 기반을 제공합니다. 형광 리포터의 선택은 고려해야 할 중요한 것이며 생물학적 질문에 달려 있습니다. 우리는 호중구에서 이러한 케모카인 수용체의 구성 회전율이 상피 세포와 비교하여 높았으며 빠른 성숙 (예 : sfGFP)을 가진 기자가 정상 상태에서 막 수준을보고하고 호중구 자극시 차이를 해결해야한다는 것을 발견했습니다 8,14. 따라서, sfGFP/tagRFP의 막 비율은 이 세포 유형에서 리간드-유도된 내재화를 측정하는 데는 적용되지 않지만, tagRFP의 패턴은 수용체의 세포내 운명의 추적을 허용하며, 이는 일부 연구에서 유용할 수 있다. 우리는 또한 tagRFP의 더 집중된 세포 내 신호가 개별 유충을 스크리닝하는 데 유용하다는 것을 발견했습니다. 원형질막에서 수용체 수준을 측정하기 위한 대안적인 접근법은 동일한 전이유전자(9) 또는 독립적인 전이유전자(14)에서 호중구에서 형광막 마커를 공동발현시키는 것이다. 이전의 시나리오에서, 전이유전자는 물고기를 스크리닝하기 위한 추가적인 수단을 제공할 것이고, 발현 수준은 마커와 수용체 사이에서 필적할 것이다. 후자의 접근법은 수용체 리포터가있는 제브라 피쉬 라인이 다른 리포터 라인과 결합 될 수 있다는 점에서 더 모듈화 될 것입니다. 두 경우 모두 수용체 수준의 막 정량화가 군집형 호중구에서 어렵다는 점은 주목할 가치가 있습니다 (아래 참조). 마지막으로, 우리는이 프로토콜의 가능한 확장은보다 상세한 국소화 분석을 위해 면역 조직 화학에 의한 라이브 이미징을 후속 조치하는 것입니다.
Tol2 형질생성 시스템은 잘 확립되어 있고7 라이소자임 C 프로모터는 호중구 발현11,15를 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 따라서, 트랜스제네시스 접근법은, 비교적 간단하고, 이러한 프로모터로 달성된 발현 수준은 수용체 역학의 분석을 위한 충분한 콘트라스트를 제공하기에 충분히 높다. 가능한 제한은 발현 수준이 내인성 수용체 발현 수준을 재구하지 않는다는 것이다. 새로운 CRISPR 기술은 특정 관심의 수용체에 대한 녹인 라인을 확립하기 위해 배치될 수 있다(28). 이러한 기술은 여전히 번거롭고 세포 내 이미징에 필요한 발현 수준을 보장하지는 않지만 성공적인 개발은 내인성 신호 역학을 이해하는 데 중요한 돌파구가 될 것입니다. 기능적 검증은 트랜스제닉 수용체 구축물을 사용한 데이터를 해석하는데 중요하다. 예를 들어, 리간드 인식 분석은 형광 융합 단백질이 기능적이라는 것을 확립하는데 사용될 수 있고, 넉아웃 표현형을 구하고, 트랜스제닉 호중구 발현 수준이 기능성14와 양립가능하다는 것을 확립하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 수용체 융합을 검증하는 보다 직접적인 방법은 표지되지 않은 버전14와 함께 표지된 수용체를 갖는 시험관내 기능적 검정을 이용하는 것이다.
정량화 접근법은 생체 내에서 호중구에서 정확한 막 세분화의 특정 어려움을 해결합니다. 상피 성질의 세포에서, 수용체 수준의 정량화는 막 수용체 수준을 조절 마커로 정상화함으로써 자동으로 실행될 수 있으며, 이는 병렬로 또는 개별적으로 발현될 수 있다9. 실제로, 우리는 가스트레이션 배아14에서 리간드-인식 검정을 사용할 때 그러한 접근법을 적용하였다. 그러나 호중구는 생체 내에서 세포 모양의 복잡하고 급격한 변화를 겪어 2D 및 3D14에서 막 세분화를 어렵게 만듭니다. 이것은 호중구 군집이 많은 생리적 환경29에서 발생하는 경우 훨씬 더 도전적입니다. 대조 메트릭은 막 세분화를 필요로하지 않고 대신 세포에서 수용체 분포의 전체 상태 (막성 / 부드러운 대 수포 / 도티)를 반영하기 때문에이 제한을 극복합니다. 콘트라스트 메트릭은 이미지의 전체 대비에 의해 영향을 받을 수 있으므로 서로 다른 배아/샘플에서 신호의 변동성을 설명하기 위해서는 개별 세포 값을 내부 참조로 정규화해야 합니다. 예를 들어, 우리는 CHT에서 반응하지 않는 호중구의 평균 세포 대조 값 (즉, 정지되어 있고 복부 지느러미로 이동하지 않는 호중구)14를 사용했습니다. 추가적인 가능성은 동일한 세포에서 대조 마커의 대조 값으로 정규화하는 것이다. 이것은 무반응 세포의 내부 참조가 이용 가능하지 않을 때 해결책을 제공 할 것이고, 다른 조건 사이의 수용체 역학의 미세한 정량적 차이를 해결할 수 있습니다.
이미징의 위치는 고려해야 할 또 다른 변수입니다. 더 일반적으로 사용되는 꼬리 지느러미 상처 모델16,30과는 달리 복부 지느러미 상처를 여기에서 선택하는 이유는 상처 부위가 호중구 거주지 / 철새 기원 부위 근처에 있기 때문입니다. 이것은 호중구가 도착하는 데 상대적으로 적은 시간이 걸리기 때문에 분석의 타임 라인을 가속화합니다. 추가적으로, 그것은 이동 기원 (CHT) 및 관심의 표적 위치 (상처) 둘 다에서 세포 거동을 포착할 수 있는 기회를 제공한다. 이는 세포하 영상화에 필요한 공간적 및 시간적 분해능이 넓은 시야각 또는 다중 위치 스캐닝과 결합하기 어렵기 때문에 여기에서 관련이 있다. 따라서, 복부 지느러미 상처 분석은 이동 기원으로부터의 이주 반응의 진화를 추적하고 반응하지 않는 세포에서 비특이적 수용체 변동을 동시에 포착하는 것을 허용한다. 위에서 언급했듯이, 후자는 불특정 역학에 대한 내부 참조를 제공하기 때문에 정량화 목적으로 유용합니다. 다른 시스템에서, 이러한 내부 참조를 갖는 것이 불가능할 수 있으며, 이 경우 공동-발현된 막 마커의 콘트라스트 값은 대안적인 제어를 제공할 것이다.
요약하면, 우리는 방법론이 다른 시스템에 적용 가능하고 다양한 목적으로 배포 될 수 있다고 예상합니다. 예를 들어, 동일한 리포터가 감염 설정 또는 다른 질병 모델과 같은 다른 염증 설정에서 활용될 수 있다. 제브라피쉬 수용체 리포터 라인의 레퍼토리는 다른 신호전달 수용체로 확장될 수 있고, 신호전달 메카니즘을 이해하거나 생체내에서 리간드 역학을 보고할 수 있다. 이 접근법은 녹다운/녹아웃 기술과 결합하여 관찰된 역학의 기계론적 기초를 조사할 수 있다. 예를 들어, 리간드 발현의 섭동은 관찰된 수용체 역학에 대한 리간드 의존성을 나타낼 수 있다. 앞으로는 기자의 녹인 삽입을 통합하기 위해 시스템을 더욱 정교하게 만들 수 있을 것으로 예상합니다. 궁극적으로,이 방법론을 사용한 발견은 포유류에서 이러한 신호 수용체의 보존과 더 큰 유기체에서 이러한 연구를 수행하는 상대적 도전을 감안할 때 제브라 피쉬 공동체를 넘어서는 가치있는 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.

백혈구 이동은 면역 반응에 가장 중요합니다. 면역 세포는 원형 철새 세포로, 조직과 혈관을 횡단하고 미생물 또는 기타 중요한 숙주 세포쪽으로 방향으로 이동하기위한 다양한 화학적 안내 신호를 감지 할 수 있습니다. 올바른 지침은 화학 유인 물질의 인식에 의존하며, 그 중 케모카인은 가장 두드러진 범주1을 나타냅니다. 케모카인은 고도로 특이적인 일곱 막횡단 G 단백질 결합 수용체에 의해 인식된다. 케모카인 결합시, 케모카인 수용체는 형태 변화를 일으켜 연관된 삼량체 G 단백질의 활성화와 세포골격 변화 및 지시된 이동을 촉진하는 기능적 신호전달 서브유닛으로의 해리를 유도한다1. 이차적으로, 케모카인 수용체는 인산화되고, 이러한 변형은 유인제에 대한 탈감작으로 이어지고, 이는 신속한 재감작/재활용 또는 세포내 분해 및 세포 표면으로부터의 하향 조절(down-regulation 2)에 뒤따를 수 있다. 이러한 수용체 역학은 세포에 의해 수신되는 신호전달의 지속 기간 및 용량에 영향을 미치지만, 이들이 백혈구 이동 거동에 어떻게 영향을 미치는지 생체내에서 밝히기가 어려웠다.
전통적인 포유류 시스템에서 살아있는 백혈구에서 수용체 역학을 추적하는 것은 몇 가지 도전에 직면 해 있습니다. 살아있는 연구를 위해, 형광 단백질과의 수용체 융합은 세포에서 발현되어야 한다. 이것은 원발성 백혈구, 특히 호중구에서 도전적이며, 지금까지의 연구는 케모카인 수용체 3,4를 발현하기 위해 대리 호중구 세포주를 사용했다. 백혈구가 유익한 인신 매매 결함 5,6을 갖는 형광 수용체 또는 돌연변이 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델의 생성은 상당한 시간과 자원의 투자를 수반한다. 이러한 경우에도, 살아있는 동물에서 수용체 역학을 영상화하기 위한 이미징 해상도 및 콘트라스트는 제한될 수 있고, 연구는 고정된 조직 절편(5)에 대한 면역조직화학을 이용하였다. 이러한 기술적 과제를 감안할 때, 화학 유인 수용체 역학이 살아있는 조직 환경에서 세포 거동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해는 현재 제한적입니다.
여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 수용체 밀매를 모니터링하는 방법론을 제공합니다. 제브라피쉬는 생쥐처럼 유전적으로 다루기 쉽지만, 효율적인 트랜스포존 시스템과 직접 접합체 조작을 통해 트랜스제네시스가 비교적 더 간단하다7. 투명한 유충은 이상적으로 이미징에 복종 할 수 있습니다. 케모카인 수용체 역학은 형광 리포터 8,9,10과의 상응하는 융합체의 발현에 의해 원시성 생식 세포 및 측선 프리모듐에서 시각화되었다. Zebrafish 유충은 포유류 호중구와 관련하여 유전 적 및 세포 특성을 고도로 보존 한 성숙한 호중구를 갖추고 있습니다. 세포골격 역학 및 극성 조절제와 같은 세포하 신호전달 역학은 상응하는 트랜스제닉 라인(11,12,13)의 생성에 의해 이들 세포에서 시각화되었다. 최근에, 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응의 과정 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학을 시각화하고 기능적으로 분석하였다14. 여기에서는 호중구에서 케모카인 신호전달을 위한 형질전환 리포터 라인의 생성, 라이브 이미징을 위한 배아의 준비, 호중구 신호전달을 연구하기 위한 상처 분석 및 이미지의 획득 및 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 또한 후보 리간드에 대한 케모카인 수용체 반응을 시험하기 위한 사이드 프로토콜을 제공하며, 이는 특징이 없는 수용체에서 리간드 인식 패턴을 확립하려고 할 때 유용하다. 이들 기술은 내인성 케모카인 발현의 억제 또는 변경된 리간드-유도된 인신매매를 갖는 돌연변이 수용체의 생성과 같은 추가의 유전자 조작과 조합하여, 특정 신호전달 역학이 생체내에서 백혈구 거동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 사용될 수 있다. 형광 태깅된 케모카인 수용체를 발현하는 트랜스제닉 라인은 또한 내인성 케모카인 구배에 대한 리포터로서 사용될 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 직접 항체 염색에 의해 검출하기 어렵다. 기술된 방법론은 리포터의 생성을 다른 면역-신호전달 수용체로 확장시키기 위한 범위를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar 원심분리기 튜브</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark 모세관 유리</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline 얇은 표백제</td><td>과학 실험실 용품</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>해부 범위</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 마이크로 웰 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>미세분사 시스템</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer 회전 디스크 UltraVIEW ERS, Olympus IX81 회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>폴리(A) 테일링 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 붓</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 레이저 모듈</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>수술용 메스 블레이드 No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 소프트웨어</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>요코가와 CSU10 스피닝 디스크 컨포칼 스캐너</td><td>요코가와</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

상처 반응 중 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체의 라이브 이미징

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

화학적 구배에 의한 백혈구 안내는 면역 반응에 필수적입니다. 호중구는 중요한 항균 기능을 수행하는 조직 손상 부위에 모집 된 최초의 세포입니다. 이 유전자좌로의 밀매는 케모카인을 포함한 여러 염증성 화학 유인제에 의해 조정됩니다. 분자 수준에서, 화학유인제 신호전달은 상응하는 수용체의 세포내 밀매에 의해 조절된다. 그러나 케모카인 수용체의 세포 내 변화가 세포 및 조직 수준에서 백혈구 이동 역학에 어떻게 영향을 미치는지는 분명하지 않습니다. 여기서 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량 분석을위한 방법론을 설명합니다. 이러한 도구는 제브라피쉬 호중구에서의 차등 케모카인 수용체 밀매가 조직 손상 부위에서 호중구 군집화 및 분산을 조정한다는 것을 밝혀냈다. 이것은 염증 반응이 어떻게 스스로 해결되는지에 대한 우리의 이해에 영향을 미칩니다. 기술된 도구들은 다양한 생리학적 및 병리학적 설정들에서 호중구 이동 패턴을 이해하는데 사용될 수 있고, 방법론은 다른 신호전달 수용체들로 확장될 수 있다.

복부 지느러미 상처는 CHT에서 복부 지느러미로 급속 호중구 동원 및 30-60 분 이내에 상처 마진에서 군집화됩니다 (그림 1). 우리는 제브라피쉬 호중구 24에 의해 발현되는 두 개의 케모카인 수용체인 Cxcr1 및 Cxcr2의 분포를 시각화하고 스핀 디스크 공초점 현미경을 사용하여 Cxcl8a 및 Cxcl8b14를 인식합니다. 우리는 두 개의 상응하는 트랜스제닉 라인, Tg(lyz:Cxcr1-FT) 및 Tg(lyz:Cxcr2-FT)를 생성했는데, 여기서 호중구는 수용체의 형광 타이머(FT) 구축물, 즉 sfGFP 및 tagRFP의 탠덤과의 융합을 발현한다(도 2 및 참조14). 두 형광단의 사용은 광범위한 수용체 운명을 모니터링하고 원형질막에서의 단백질 턴오버 시간의 추정치를 제공하기위한 것이었으며, 새로 합성 된 수용체는 녹색으로 형광을 띠고 8,14 세가되면 점진적으로 적색이됩니다. 그러나, 이들 수용체는 호중구 원형질막에서 빠른 구성적 턴오버를 가지며 체류 시간이 tagRFP의 성숙 시간보다 짧았고, sfGFP는 막 국소화를 나타내고 tagRFP는 정상 상태에서 수포 국소화를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (보충 비디오 1 및 참조14). 따라서, 우리는 조직 손상 부위에서 리간드-유도된 내재화를 모니터링하기 위해 sfGFP의 분포에 초점을 맞추었다. 수용체 분포의 패턴은 이웃 픽셀들 사이의 강도의 차이를 보고하는 콘트라스트 메트릭을 사용하여 정량화되었다. 그 근거는 수용체 분포가 막강하고 매끄럽게 될 때 대조 값이 낮다는 것입니다. 수용체 분포가 수포성이고 더 많은 구멍을 뚫으면 명암비가 높습니다 (그림 3).
대안적인 방법은 대조군 막 마커, 예를 들어 막 CFP(mCFP)의 수준에 대한 수용체 수준(sfGFP 강도)의 비율을 정량화하는 것이다(도 3). 두 방법 모두 세포에서 전세계적으로 더 많은 수포 수용체 분포 패턴 (더 높은 명암치) 또는 막에서의 낮은 수용체 수준 (더 낮은 sfGFP / mCFP 비율)에 의해 나타나는 것처럼 수용체 내재화를 감지 할 수 있습니다. 그러나, 콘트라스트 메트릭은 또한 상처에서 호중구 클러스터에서 수용체 내재화를 검출할 수 있었는데, 여기서 막 분할은 덜 정확했고 적용 가능하지 않았다(그림 3). 이 메트릭을 사용하여 상처에서 호중구에서 Cxcr1과 Cxcr2 밀매의 가시적 인 차이를 정량화 할 수있었습니다 (그림 4 및 보충 비디오 2). Cxcr1-FT는 상처에 위치한 세포에 내재화되는 반면, Cxcr2-FT는 상처에서 호중구에서 막강한 상태로 남아있었습니다 (그림 4A-C, 보충 비디오 2 및 보충 비디오 3). 모르폴리노 치료를 통해 Cxcl8a 및 Cxcl8b의 억제는 상처에서 Cxcr1-FT 내재화에 차별적으로 영향을 미쳤다 (그림 4C, D). Cxcr1-FT가 Cxcl8a에 반응하는지 더 검증하기 위해, 우리는 초기 배아에서 케모카인 반응 분석을 수행했습니다. 우리는 Cxcr1-FT가 Cxcl8a가 공동 발현된 배아에서 현저하게 내재화된다는 것을 발견했다(도 5). 전체적으로 이들 결과는 호중구에서 케모카인 유도된 수용체 내재화를 측정하고 이들 효과를 매개하는 리간드의 동일성을 확립하기 위해 기술된 방법이 전개될 수 있음을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> 그림 1: 복부 지느러미 상처로의 호중구 이동. (A) (왼쪽) 꼬리 조혈 조직 (CHT), 금성 순환 (VC, 파란색), 복부 지느러미 (VF) 및 상처 부위의 위치를 보여주는 3 dpf 유충의 만화. (오른쪽) 호중구가 CHT에서 동원되어 상처에서 군집하는 상처 (W)의 영역을 묘사하는 만화. CHT 조직의 꼬리 정맥 신경총 (CVP)은 파란색으로 그려집니다. (B) 밝은 필드 이미지 (왼쪽) 및 공초점 투영 (오른쪽)은 상처 후 2 시간에서 Tg (mpx : GFP) 유충에서 복부 지느러미 상처와 호중구의 분포를 보여줍니다. 파선은 VF 및 CHT 윤곽선을 표시합니다. 스케일 바 = 25 μm. 만화 및 형광 이미지는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> 그림 2: 호중구에서 케모카인 수용체 밀매의 라이브 이미징. (a) Cxcr1-FT (형광 타이머) 및 Cxcr2-FT의 호중구 특이적 트랜스제닉 발현에 사용되는 작제물. 3 dpf 트랜스제닉 유충의 머리에서 호중구의 공초점 돌기 (Tg(lyz:Cxcr1-FT), 상단; Tg(lyz:Cxcr2-FT), 하단)는 tRFP(마젠타) 및 sfGFP(녹색) 채널을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. (B) 도 1A에서와 같이 3 dpf 유충의 해부학적 계획. 유충 아래에는 CHT (상단)에서 동원되거나 복부 지느러미 (하단)에 들어갈 때 화학 주성을 수행하는 호중구가있는 상처 (W)의 면적을 묘사하는 계획이 있습니다. 파선 사각형은 오른쪽의 스냅숏으로 이미지화된 영역을 나타냅니다. (C) CHT (상단 패널) 또는 상처 (하단 패널)쪽으로 화학 주축을 동원 할 때 Tg (lyz : Cxcr1-FT) 유충 (sfGFP가 표시됨)의 호중구. 화살표는 시간이 지남에 따라 동일한 셀을 표시합니다. 오른쪽 이미지의 시간 지점은 왼쪽의 이미지 이후 경과된 시간(분)입니다. 스케일 바 = 10 μm. (D) 케모카인 수용체 밀매의 라이브 이미징을 위한 실험적 접근법의 개략적인 표현. 패널 A-C가 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)로부터 변형되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> 도 3: 수용체 역학의 정량화 예. CHT에서 상처 또는 비동원된 호중구에서 단일(청색) 또는 군집형 호중구(녹색)(적색, 주황색)를 분절하고 결과를 비교하기 위해 상이한 방법에 의해 분석하였다. 표시된 동일한 예제 셀은 이미지에서 보이는 것을 추출된 값의 범위와 관련시키는 두 가지 방법으로 분석되었습니다. (a) 선택된 실시예 셀의 표면은 sfGFP 채널에서의 윤곽선 정의에 기초하여 분절되었다. (B) 콘트라스트는 A. (C)에 나타낸 실시예 세포로부터 계산하였고, 선택된 세포들, 실시예 셀들의 멤브레인은 CFP 채널에서의 등고선 정의에 기초하여 분절되었다. sfGFP/CFP의 비율계량 분석이 뒤따랐다. (D) sfGFP/CFP의 비율은 C. 에러 막대는 개별 세포로부터 S.E..M.를 나타내는 예시 셀에서 계산되었으며, n&gt;1의 경우, 여기의 값들은 통계적 분석에 사용되지 않고 단지 상이한 정량화 방법으로 얻은 측정치를 예시하기 위한 것이다. 스케일 바 = 10 μm. 참조14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> 그림 4: 상처에 대한 반응에서 Cxcr1 및 Cxcr2의 차동 역학. (A) 상처 후 80분에 상처에서 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 또는 Tg(lyz:Cxcr2-FT) 유충에서 호중구의 공초점 투영(sfGFP 채널 표시). 스케일 바 = 10 μm.  (B) 상처에서 확대된 Cxcr1-FT 호중구(왼쪽) 및 Cxcr2-FT(오른쪽). 녹색 수용체는 회색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 5 μm. (C) 정규화된 대조 (CHT에서 동원되지 않은 세포의 평균 대비로 정규화된 개별 호중구 당 대비). cxcl8a는 cxcl8a에 대한 번역 블로킹 모르폴리노와 함께 스플라이스 블로킹의 주입을 지칭한다. cxcl8b는 cxcl8b에 대한 스플라이스 블로킹 모르폴리노를 사용한 주입을 지칭한다. Tg (lyz : Cxcr1-FT)의 경우 : n = 24 세포 (CHT), n = 8 마리의 유충에서 나온 47 세포 (상처). 모르폴리노스를 가진 Tg (lyz:Cxcr1-FT)의 경우: 5마리의 유충에서 n=28 세포(Cxcl8a-MO), 5마리의 유충으로부터 n=16개의 세포(Cxcl8b-MO)가 있다. Tg (lyz : Cxcr2-FT)의 경우 : n = 10 세포 (CHT) 및 n = 20 세포 (상처) 3 마리의 유충. 데이터는 1-5 개의 이미징 세션에서 획득 한 독립적 인 유충으로부터 풀링되었습니다. Tg(lyz:Cxcr1-FT)에 대한 Dunn의 다중 비교 테스트, Tg(lyz:Cxcr2-FT)에 대한 2개의 꼬리 무쌍 Mann-Whitney 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 테스트. (d) 지느러미 상처에 반응하는 cxcl8a 모르폴리노(MO)(왼쪽) 및 cxcl8b MO(오른쪽)로 처리된 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 형질전환 유충에서 호중구의 공초점 투영(녹색으로 표시된 sfGFP 채널). 동등한 호중구 축적의 시점에서 찍은 스냅 샷 (왼쪽 이미지에서 85 분, 오른쪽 이미지에서 상처 후 45 분). 스케일 바 = 10 μm. 참조14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> 도 5: 초기 배아에서의 케모카인 반응 분석. 레이저-스캐닝 공초점 Cxcr1-FT. Cxcr1-FT mRNA의 발현 및 분포를 나타내는 가스트레이션 배아의 공초점 슬라이스를 150 pg Cxcl8a mRNA가 있거나 없는 150 pg의 세포-단계 난자에 주입하였다. 녹색 및 적색 수용체는 별개의 채널로 표시된다. 대조군 막 CFP 마커 (mCFP)는 시안 채널에 도시되어 있다. 스케일 바 = 20 μm. 참조14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 영화 1: 3 dpf에서 Tg (lyz : Cxcr1-FT) (왼쪽) 및 Tg (lyz : Cxcr2-FT) (오른쪽) 유충의 머리에있는 형질전환 호중구. sfGFP (녹색), tagRFP (자홍색). 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 5fps입니다. 스케일 바 = 20 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 영화 2: Tg(lyz:Cxcr1-FT)(왼쪽)와 Tg(lyz:Cxcr2-FT)(오른쪽)의 호중구가 지느러미 상처에 반응하는 형질전환 유충입니다. 영화는 상처 후 10 분 이내에 시작되어 60 분 동안 지속됩니다. sfGFP (녹색), tagRFP (자홍색). 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 10fps입니다. CHT = 인과적 조혈 조직. VF = 복부 지느러미. 스케일 바 = 25 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 영화 3. 상처 입은 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 트랜스제닉 유충(비디오 2에 표시된 것과 다른 유충)으로부터의 호중구의 추가 예는 CHT에서 동원될 때 또는 복부 지느러미에 진입 및 화학주성시 수용체 내재화(녹색으로 표시된 sfGFP 채널)를 보여주는, 더 높은 해상도로 획득되었다. 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 2fps입니다. 스케일 바 = 10 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1 :<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 화학유인성 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량적 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다.

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

호중구는 국소적으로 생성된 화학 리간드에 반응하여 상처에 침투하는 중요한 염증 세포입니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 이러한 리간드에 대한 반응으로 수용체 역학을 시각화할 수 있습니다. 케모카인 수용체 리포터의 사용은 감염 및 종양 모델과 같은 다른 생리학적 환경과 다른 면역 세포로 확장될 수 있습니다.이 방법을 사용하면 조직 백혈구의 언제 어디서 화학 유인 분자를 감지하는지 추적할 수 있습니다. 이를 통해 면역 반응이 어떻게 진행되고 해결되는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 제브라피시 유충에서 복부 지느러미 상처를 수행하려면 미세한 유충 조작이 필요하므로 실험 목적이 아닌 유충에 대해서는 몇 가지 연습이 필요합니다.수정 후 2.5일에서 3.5일째에 마취된 제브라피시 유충을 형광 해부 스코프 아래에 놓고 형질전환 수용체 발현을 가진 유충을 선택합니다. 선택한 유충을 E3 배지가 보충된 트리카인이 함유된 120mm 페트리 접시로 옮기고 멸균 메스를 사용하여 꼬리 조혈 조직 혈관을 절단하지 않고 상당한 호중구 동원을 유발할 수 있을 만큼 충분히 깊게 절단한 각 유충의 복부 지느러미를 절단합니다. 유리 바닥 접시에 500마이크로리터의 2X 트리카인을 넣은 다음 500마이크로리터의 아가로스 용액을 넣고 피펫 팁으로 부드럽게 저어 섞습니다.피펫을 사용하여 부상당한 마취된 제브라피시 유충을 접시로 옮기고 배아를 옆으로 향하게 하면서 물고기의 꼬리 부분이 유리 바닥에 최대한 가깝도록 부드럽게 아래로 누릅니다. 배아가 제자리에 있으면 아가로스를 식히십시오. 5-10분 후 작은 페인트 브러시로 젤을 부드럽게 만져 응고를 확인하고 트리카인 1밀리리터당 0.2밀리그램이 보충된 E3 배지 2밀리리터를 플레이트에 추가합니다.회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 상처 부위를 이미지화합니다. 아가로스가 굳은 후 가능한 한 빨리 배아를 컨포칼 이미징 스피닝 디스크 플랫폼으로 옮기고 스테이지 조이스틱과 현미경 대물렌즈를 사용하여 물고기를 찾습니다. 30-40X 대물렌즈를 사용하여 상처 부위에 초점을 맞추고 상처 주위를 이미지화할 필드를 선택합니다.레이저를 선택하고 노출 시간을 조정한 다음 원하는 시간 동안 30초마다 타임랩스를 설정하고 필드를 문서화할 명시야 이미지를 얻습니다. 상처 부위의 호중구 수용체 내재화를 정량화하려면 피지에서 이미지 데이터 세트를 열고 시간 슬라이더를 사용하여 각 데이터 세트에 대한 관심 있는 대표 기간을 선택합니다. MATLAB에서 새 스크립트를 만들고 이미지 읽기, 열기, 관심 지점의 수동 선택을 위한 함수를 포함합니다.스크립트를 실행하여 관심 프레임을 열고 분석을 위해 호중구를 클릭합니다. 복부 지느러미 상처와 꼬리 조혈 조직 모두에서 중심의 추정치를 기록하십시오. active contours 기법을 사용하여 각 프레임의 호중구를 분할하고, gray level co-occurrence matrix를 기반으로 한 호중구의 대비 계산을 포함하여 각 호중구에 대한 Gray level co-occurrence matrix의 계산을 추가하는 스크립트를 생성합니다.모든 꼬리 조혈 조직 호중구의 평균 호중구 대비 값 계산을 포함하여 복부 지느러미의 개별 호중구에 대한 값을 별도로 저장하는 명령을 추가합니다. 상처 부위에 있는 개별 호중구의 대비 값을 꼬리 조혈 조직 호중구의 계산된 평균 대비에 대한 정규화를 포함하여 대조군, 비반응 세포에 비해 개별 반응 세포 내에서 수용체의 모양이 얼마나 점박한지를 반영하는 정규화된 대비를 얻습니다. 그런 다음 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다.복부 지느러미 부상 후에는 꼬리 조혈 조직에서 배쪽 지느러미로 빠르게 호중구 동원이 이루어지고 부상 유도 후 30-60분 이내에 상처 가장자리에서 클러스터링됩니다. 이 분석에서 제브라피시 호중구에 의해 발현된 케모카인 수용체 CXCR1 및 CXCR2는 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. 수용체 분포 패턴은 인접 픽셀 간의 강도 차이를 보고하는 대비 메트릭을 사용하여 정량화되었습니다.또 다른 방법은 제어된 멤브레인 마커 수준에 대한 수용체 수준의 비율을 정량화하는 것입니다. 상처 부위의 호중구 클러스터에서 수용체 내재화를 감지하기 위해 조영제 메트릭을 사용하여 상처 부위의 호중구에서 CXCR1과 CXCR2 트래픽 간의 가시적인 차이를 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 이 분석에서 상처 부위에 위치한 세포의 형광 표지된 CXCR1 내재화는 시간이 지남에 따라 증가한 반면, 형광 표지된 CXCR2는 상처의 호중구 막에 남아 있었습니다.morpholino 처리를 통한 CXCR1 및 CXCR2 리간드의 억제는 상처 부위에서 차등 형광 표지된 CXCR1 내재화를 초래합니다. 또한, 초기 배아에서 형광 표지된 CXCR1은 수용체 리간드가 공동 발현되는 배아에서 현저하게 내재화되어 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 상처 후 가능한 한 빨리 이미징을 수행하여 상처에 호중구를 모집하는 동안 수용체 역학을 포착해야 한다는 점을 명심하십시오.정상 유충에서 케모카인 수용체의 이미징에 이어, 연구자들은 염증 조절 장애가 있는 돌연변이 유충에서 비교 이미징을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난...

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

이 비디오는 광전환 가능한 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 유충을 사용하여 백혈구 동원을 추적하는 방법을 보여줍니다. 적색 형광 염료 표지 박테리아를 이낭에 사전 주입하고 광변환을 유도하면 백혈구의 이동, 식균작용 및 몸 전체의 분산을 관찰할 수 있어 면역 반응 역학에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

박테리아에 감염된 형질전환 제브라피시의 광변환 기반 백혈구 추적

이 비디오는 제브라피시 유충에서 형광 표지된 곰팡이 병원체 감염을 관찰하기 위한 제브라피시 상처 및 포획 장치 기술을 보여줍니다. 초기 감염은 대식세포를 끌어들이고, 감염이 지속됨에 따라 주사 부위에서 호중구 동원이 진행됩니다.

진균 병원체에 감염된 제브라피시 유충을 시각화하기 위한 zWEDGI 기법

종양 이전 세포의 진행과 선천성 면역 세포 상호 작용의 가장 초기 사건을 연구하는 것은 암을 이해하고 치료하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 상피 세포 형질전환을 조건부로 유도하는 방법과 제브라피시 유충에서 피부 세포를 발현하는 HRASG12V와 선천성 면역 세포 상호 작용의 후속 라이브 이미징에 대해 설명합니다.

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

여기에서는 제브라피시 귀 소포에서 국소 박테리아 감염의 생성 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다.

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

인간 인플루엔자 A 바이러스에 대한 전신 및 국소 제브라피시 감염 모델을 보여줍니다. 전신 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 항바이러스제를 스크리닝할 수 있습니다. 국소 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 숙주 면역 세포 반응을 특성화할 수 있습니다.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

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여기 우리는 vivo에서높은 spatio 시간적 해상도에서 라이브 이미징 상처 복구와 관련 된 염증 반응에 대 한 프로토콜을 제시. 이 메서드는 초파리 개발 장기 이미징 및 시간이 지남에 따라 특정 세포 인구의 추적을 가능 하 게 하의 번데기 단계를 활용 하 고 효율적인 RNAi 중재 유전자 비활성화와 호환 됩니다.

초파리 번데기 내에서 염증 성 세포 역학의 장기 Vivo에서 추적

생체 내에서 대식세포 모집에 대한 케모카인의 효과를 시험하기 위해, 시투 혼성화에서 전체 마운트를 사용하여 케모카인의 자궁외 발현을 검출하고, 면역염색을 사용하여 대식세포에 라벨을 붙이도록 하였습니다. 라이브 이미징은 대식세포 이동의 실시간 관찰에 사용되었다.

생체내 대식세포 모집 테스트를 위한 자궁외 체모카인 발현 모델

반응성 친전자필 및 산화제(Z-REX)를 표적으로 하는 제브라피쉬는 반응성 소분자 신호 조사를 위한 화학 생물학 기반 방법입니다. 이 기술은 다양한 발달 단계의 활어에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 신호 전달 경로 분석을 위해 제브라피쉬의 표준 분석과 Z-REX를 결합합니다.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

학습하세요 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체 라이브 이미징 방법으로 상처 반응 중 수용체 역학을 시각화하고 정량 분석하는 기법입니다. 이 프로토콜은 면역 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

상처 반응 중 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체의 라이브 이미징

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