Name: 이더말 미세칼로리메트리를 사용하여 새로운 천연 제품의 박테리시달 또는 박테리오정성 효과를 결정하는 대사 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 이더말 미세칼로리메트리를 사용하여 A.baumannii의 항생제 대사 반응을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 비침습적 기술은 박테리시달 효과 분석과 신약 개발에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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저자는 유익한 토론에 대한 심셀의 팀에 감사하고 싶습니다 우리는 간나 올리니크와 빌헬름 폴란더의 큰 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 자연 제품을 제공하고 숙련 된 기술 지원을 위한 스테파니 슈미트를 제공 다니엘 Kohnhäuser 감사드리고 싶습니다.

참고: 계측기 온도는 시스템의 안정성을 보장하기 위해 적어도 하루 전에 사용되는 박테리아에 따라 설정해야합니다. 여기서, 아신토박터 바우마니 DSM30008 샘플은 30°C에서 실행된다.
1. 문화 준비
<ol><li>CASO 한천 판에 조사 중인 변형(여기: A. baumannii)을펼치고 30°C의 정적 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>MHB(뮬러-힌튼 국물)의 단일 식민지를 접종하여 하룻밤 문화를 준비하고 30°C에서 180rpm에 흔들리는 인큐베이터에 배양한다.</li>
</ol>2. 샘플 준비
<ol><li>1.5mL 튜브를 사용하여 선택된 약물 또는 화합물의 농도 범위를 준비합니다(예: DMSO에 100배 스톡 솔루션의 1.5 μL을 추가하여; 단계 2.3 참조).</li>
	<li>MHB 배지에서 하룻밤 문화를 희석시.<ol>
<li>600 nm의 파장에서 분광계를 사용하여 야간 배양의 광학 밀도를 측정합니다.</li>
		<li>배양을 희석하여 신선한 MHB 배지에서 5 x 105 콜로니 형성 유닛(CFU)/mL을 얻습니다. 하나의 OD600은 약 5 x 108 CFU/mL(예: 에슈리치아 대장균, 황색포도상구균, A. baumannii)와같습니다. 참고: 적용된 배양 조건 하에서 각 개별 세균 균주에 대해 전환인자 OD600에서 CFU/mL로 보정하는 것이 중요합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.1 단계에서 준비된 시험관에 세포의 150 μL을 추가하여 테스트 된 약물 또는 화합물의 정확한 최종 농도를 보장하고 최종 세포 농도를 수정합니다.</li>
	<li>화합물을 세포와 혼합하여 소용돌이를 가합니다. 참고 : 샘플 플레이트 (재료의 표참조) 각각 8 개의 우물, 총 48 웰을 포함하는 여섯 행이 있습니다; 행 A와 행 F는 열역학 참조입니다. 따라서, 어떤 샘플도 그 우물에로드 할 수 없습니다, 해당 미디어는 그 우물에로드됩니다. B-E 행의 우물을 사용하여 실행당 32개의 테스트 샘플을 측정할 수 있습니다. 개별 테스트 샘플은 최소한 중복으로 실행되어야 합니다(여기: 모든 샘플은 트리플리케이트로 실행되었습니다). 성장 컨트롤을 포함해야 합니다.</li>
</ol>3. 삽입 준비
<ol><li>2.4단계에서 제조된 혼합물에서 플라스틱 인서츠로 120 μL을 옮김한다. 참고: 3.1 단계에서 역파이프를 사용하여 액체가 플라스틱 인서트 측면에 분사되는 것을 방지하여 올바른 신호 판독을 방해할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 티타늄 바이알을 핀셋으로 홀더에 넣습니다(재료 표참조).</li>
	<li>홀더 플레이트의 티타늄 바이알에 인서트를 부드럽게 전달합니다.</li>
	<li>티타늄 뚜껑을 모든 티타늄 바이알에 느슨하게 놓습니다.</li>
</ol>4. 인서드 로딩
<ol><li>티타늄 컵으로 홀더를 샘플 스테이션으로 옮기고 지정된 구역에 배치합니다.</li>
	<li>40cNm 힘으로 설정된 토크 렌치를 사용하여 모든 뚜껑을 조입니다.</li>
</ol>5. 샘플 실행
<ol><li>calView 소프트웨어에서 새로운 실험을시작합니다(추가 그림 1).</li>
	<li>계측기에서 샘플 삽입 암을 철회합니다.</li>
	<li>컵 홀더를 "브리지"에 놓고, 샘플 삽입 개구부를 향한 열 8을 지정한 "위치 1"에서 컵 홀더를 악기에 부드럽게 밀어 넣습니다. 시스템이 안정화될 때까지 10분 간 기다립니다. 실험용 우물에 라벨을 지정합니다.</li>
	<li>컵 홀더가 지정된 "위치 2"에 될 때까지 샘플 삽입 팔을 밀어 넣습니다. 시스템이 안정화될 때까지 20분 간 기다립니다.</li>
	<li>샘플 삽입 암을 "위치 3"로 밀어 "실행 위치"에 있을 때까지 샘플 삽입 암을 철회합니다. 소프트웨어의 모든 우물을 강조하고 반응 시작 (보충 도 4)을선택합니다.</li>
	<li>열 방출 판독이 0으로 안정적으로 돌아올 때까지 실험을 실행합니다. 참고: 모든 우물이 이 단계 내에서 유사한 작동하는지 확인합니다. 보충 도 5는 우물이 올바르게 로드되면 관찰해야 할 내용을 보여 줍니다. 잘못 로드된 경우 5.2-5.4단계를 반복합니다.</li>
</ol>6. 컵 홀더 제거
<ol><li>소프트웨어에서 정지(보충 도 6)를선택합니다. 그런 다음 소프트웨어는 "확실하다"고 묻고 예 (보충 도 7)를선택하고 데이터 분석을 위해 드라이브 또는 데스크톱에 실험을 저장합니다(보충 도 8).</li>
	<li>샘플 삽입 암을 기기에 완전히 삽입하고 자석을 사용하여 컵 홀더를 검색합니다.</li>
	<li>뚜껑을 풀고, 유리 홀더에 인서트와 유리 홀더를 제거하고 180 °C에서 4 시간 동안 배치한 다음 유리와 뚜껑을 건조기에 배치하여 뚜껑과 바이알이 건조하도록하십시오.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>소프트웨어열기(보충도 9)왼쪽 위 모서리에서 열린 실험을 선택합니다(보충도도 10). 팝업 창에서 관심의 실험을 선택하고 열기(보충 도 11)를누릅니다. 응용 프로그램은 기본 우물 보기(보충 도 12)에서실험을 엽니 다.</li>
	<li>모든 또는 Ctrl+A(보충 그림 13)를 선택합니다.</li>
	<li>기준선 정의를누르면 이 매개 변수는 각 위치에서 데이터를 정규화합니다(추가도 14). 팝업 창에서 지연 단계에 위치한 >30분의 기간을 선택합니다(열 흐름은 0과 10 μW 사이로 낮아야 한다; 보충 도 15). 기본 선 기간을 선택하면 선택한 기준선이 열람에 녹색으로 표시됩니다. 기준선 정의 단면 창을 닫습니다.</li>
	<li>저장 또는 Ctrl +S를 누르고 소프트웨어를 닫습니다(보충 그림 16).</li>
	<li>웹 기반 Symcel Calorimetry 분석 응용 프로그램(https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/)을 엽니다.</li>
	<li>열량 분석 응용 프로그램에 파일을 업로드하려면, 탐색(보충 도 17)을눌러, 실험을 선택하고 열기를 누릅니다 (보충 도 18). 대사 매개 변수는 웹 응용분야(보충 도 19)에서32개의 샘플에 대해 자동으로 계산됩니다.</li>
	<li>Gompertz 및/또는 Richard의 성장 모델에 열 흐름 데이터에 맞게 성장 기능을 클릭합니다. 성장 모델에 맞는 섹션 "누적"에 표시됩니다, 또한 섹션 "흐름"(보충도 20)의원시 데이터와 비교.</li>
	<li>계산된 모든 매개 변수를 다운로드하려면 다운로드 측정값을누릅니다. 파일 위치를 선택하고 저장(추가 그림 21)을누릅니다. 추가 계산을 위해 파일을 스프레드시트로 내보낼 것입니다.</li>
</ol>

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</ol>

이 프로젝트는 calScreener 기술 개발업체인 Symcel과 공동으로 수행되었습니다. 저자는 공개 할 것이 없습니다.

이소더말 미세탈량법은 시간이 지남에 따라 시편에서 방출되는 에너지를 측정하며, 이 에너지 방출은 모든 생물학적, 물리적 및 (바이오) 화학 공정의 결과입니다. 측정된 열 흐름은 신진 대사 활성의 지속적인 실시간 모니터링을 가능하게 하기 때문에 물질의 항균 효과를 평가하거나 결정하기 위해 악용될 수 있다.
분석을 위해 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면 올바른 시동 식민지 형성 유닛(CFU)을 사용하는 각 종 또는 균주에 대해 개별적으로 결정해야 합니다. CFU 수가 너무 낮은 경우, 시스템이 감지할 충분한 열을 생성하는 바이오매스의 임계 량에 도달하는 데 시간이 오래 걸리기 때문에 지연 단계가 연장됩니다. CFU 수가 너무 높은 경우 지연 상이 매우 짧고, 생성된 열의 양은 인접한 센서 셀(참조 및 실험 우물)으로 열 전달을 유발하고 열화상의 왜곡을 유발할 수 있다. CFU의 높은 숫자는 또한 더 빠른 산소 고갈로 이끌어 내고 혐기성 조건으로 전환할 것입니다. 또한 실험의 처음 30분 동안 시스템이 평형화될 때 데이터 수집이 불가능하고 실제 효과 기록이 지연된다는 점을 고려해야 합니다. 또한, 잘못된 CFU 판정은 잘못된 MIC 결정으로 이어지며 궁극적으로 실험에 영향을 미치고관찰된 변화(25). 또 다른 중요 점은 기준선의 올바른 결정입니다. 일반적으로, 기준선 신호는 열 흐름 신호가 0이고 이상적으로, 기준선 정의에 대한 시간 범위는 >30 분일 때 지연 단계 동안 선택됩니다. 그러나, 이것은 박테리아가 열 신호 검출 한계에 도달하는 것을 필요로 하는 시간으로 항상 가능하지 않으며 긴장과 종 사이 다릅니다. 일부 종 또는 균주는 열 신호 감지 한계에 도달하는 데 30 분 이상이 필요하지만 다른 균주 또는 종은 처음 30 분 이내에 도달합니다. 이 경우, 모든 열 신호가 다시 0으로 떨어졌을 때 실험이 끝날 때 기준신호를 선택하고 안정적으로 유지할 수 있다. 양자 택일로, 동일한 세균 성 균주를 가진 다른 실험에서 기준선 사용할 수 있습니다., 그러나 권장 하지 않습니다.
이 시스템을 통해 실험 및 문제 해결의 설계 및 최적화 측면에서 유연성을 확보할 수 있습니다. 사용되는 부피는 플라스틱 인서트없이 티타늄 컵을 사용할 때 플라스틱 인서트와 100-600 μL을 사용할 때 100-300 μL의 범위에 있습니다. 제조업체에서 권장하는 작업 량은 120 μL입니다. 새로운 실험 시리즈를 설정하는 데 다양한 볼륨을 사용하고 측정에 최적의 조건을 찾는 동안 주로 두 매개 변수에 영향을 미칩니다. 낮은 볼륨을 사용 하 여, 필요한 테스트 화합물의 양을 감소 시킬 수 있습니다., 화합물에 대 한 특히 중요 한, 소량에서만 사용할 수 있는. 또한, 사용된 부피는 측정 중에 산소 가용성에 직접적인 영향을 미치며, 적은 부피가 세균 성장에 필요한 산소의 양을 증가시다. 산소 고갈은 실험의 가능한 최대 지속기간에 기여하는 주요 요인 중 하나입니다. 중요한 것은 액체 매체뿐만 아니라 고체 매체를 사용할 수 있다는 것입니다. 이것은 고체와 가스 단계 사이의 인터페이스에 성장이 더 나은 산소 접근을 가능하게 하기 때문에 느린 성장 미생물에 특히 중요합니다9.
IMC는 물리학, 화학 및 생물학 분야에서 알 수없는 프로세스를 발견하는 유용한 분석 도구입니다. 이 방법은 폐쇄 된 시스템 내의 열 교환을 측정하고 기록 된 열 교환의 분석은 항상 표준 방법으로 얻을 수없는 추가 정보를 제공합니다. 미생물학 및 항생제 연구에서 IMC의 가장 큰 장점 중 하나는 표준 탁도 방법을 사용할 수 없는 살아있는, 죽은 및 인내 또는 휴면 세포를 구별하는능력입니다(11). 또한, IMC는 매우 민감하며 104-105셀 9의소수로부터 열 방출을 검출할 수 있다. 또 다른 장점은 실험적인 설정이 빠르고 쉬우며 사용자 간섭없이 연속적이고 실시간 추적을 할 수 있다는 것입니다. 또한 IMC는 비파괴적이며 시료를 추가로 분석할 수 있습니다. 데이터 분석은 정지 단계에서 늦은 기하급수적 또는 초기 고정 단계 및 대사 활동까지 바이오 매스 형성의 분리를 허용합니다.
위에서 언급 한 새롭고 흥미로운 응용 프로그램 기능 외에도이 방법에 대한 단점도 있습니다. 주요 제한 사항은 IMC 계측기가 특정 시스템 내에서 생산되고 방출되는 총 열을 측정한다는 것입니다. 이는 열 흐름9,,20을기록하여 측정되는 열 신호 변화를 평가할 수 있도록 적절한 컨트롤을 사용하여 실험 계획의 중요성을 강조한다.
우리의 손에, IMC는 새로운 천연 제품의 항균 효과를 연구 하 고 효과적인 농도 범위를 결정 하는 중요 한 도구. 세균성 및 박시성 효과를 차별화하는 것 외에도, 대상 식별 연구 및 MoA 결정의 일환으로 미래에 사용될 수 있습니다. 이것은 여기에 표시된 새로운 활성 화합물의 열그램에 다른 항생제 클래스의 열그램을 비교하여 수행 할 수 있습니다. 그러나 측정된 데이터에서 추출할 수 있는 특정 정량화 가능한 매개 변수가 이러한 비교에 충분한지 또는 전체 열도그램을 기반으로 지문을 제공하는 알고리즘에서 작업해야 하는지 여부를 조사해야 합니다. 항생제 연구 분야에서 또 다른 가능한 응용 프로그램은 새로운 항균제의 저항 모드 (MoR)를 해명하는 데 도움이 될 수있는 전체 게놈 시퀀싱과 결합 된 내성 클론에 야생 형을 비교하는 것입니다. 이 방법의 정적 특성 으로 인해 생물막 형성 또는 이미 확립 된 생물막에 대한 새로운 에이전트의 효능에 대한 조사는 생물학적 과정의 더 나은 이해와 사용 된 에이전트가 휴면 상태의 다른 단계에서 미생물에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있습니다. IMC는 열 의 형태로 방출 된 총 에너지를 기록하여 전사학에 결합 될 수있는 활성 물질의 하위 억제 효과를 조사하는 적절한 방법입니다. 이 방법은 또한 임상 설정에서 샘플의 오염을 감지하거나 항바이오그램의 측정을 위해환자(11)의명확한 치료를 신속하게 결정하는 데 사용될 수 있다.

이 방법의 목적은 새로운 항균 화합물의 행동 모드 (MoA) 프로파일링에서 중간 처리량 분석으로 이더실 미세 칼량법 (IMC)을 적용하는 것입니다. 이 방법은 세균성 종에 대한 화합물의 활성에 관한 데이터를 밝히고 화합물 자체의 살균 또는 박테리오정성 특성에 대한 정보를 제공한다.
신흥 항균 저항(AMR)의 상승은 세계적인 문제이며 알려진 항생제1을가진 일반적인 감염의 덜 효과적인 처리로 이어집니다. 그러나, 새로운 화합물 및 알려진된 항생제와 함께 작동 할 수 있는 약물에 대 한 검색 진행 중이며이것은 다양 한 접근에 내장 되어. 천연 제품은 현재 약물 발견 캠페인, 특히 항 감염 약물 발견2의핵심 플레이어입니다. 그러나, 항생제 발달을 위한 새로운 지도 구조물을 확인하는 것은 길고 재정적으로 까다로운 프로세스3입니다. 따라서 발견의 초기 단계는 이미 초기 단계에 있는 대부분의 유망한 비계를 필터링하기 위해 매우 중요합니다. 천연 제품 약물 발견의 초기 단계는 화합물의 구조를 획득, MoA 및 대상 식별과 함께 시험관 내 활성을 결정하는 것을 포함한다. 추가 개발을 받을 자격이 있는 가장 성공적인 화합물은 유리한 활동 스펙트럼(즉, 항균의 경우 광범위한 스펙트럼 활동)과 기존 AMR을 극복할 수 있는 새로운 MoA를 표시해야 합니다. 유망한 발판은 전형적으로 생체 생체 이용률, 독성 및 신진 대사4를포함하는 이차 적인 애약에서 스크리밍됩니다. 재정적 인 문제 외에도 천연 제품 약물 발견은 복합 격리 및 정화와 관련된 비용 및 기술적 어려움에 관한 추가 과제에 직면하고 있으며, 이는 차례로 발견 과정의 초기 단계에서 다중 밀리그램 또는 그램 양을 얻기 가 어려울 수 있습니다5,,6. 따라서, 새로운 천연 제품을 임상 전 개발에 접근할 수 있도록 추가 투자에 대한 정보에 입각한 결정을 내리기 위해 최소한의 화합물 양으로 최첨단 1차 검진을 수행할 수 있도록 천연 제품 연구에서 가장 중요합니다. 항균 프로파일링을 위해 IMC를 사용하면 표준 방법에 비해 필요한 화합물의 양이 현저히 감소합니다. 이 기술은 또한 미생물공동체7과의신약의 상호 작용에 관한 보다 심층적인 정보를 제공한다.
IMC는 생물학적 시스템의 모든 생물학적, 물리적 및 생화학 적 과정 및 반응의 결과로 총 에너지를 측정하는 잘 확립 된 방법입니다. 세균성 에너지 방출은 총 대사반응에비례8. 사용된 마이크로칼로리미터와 같은 폐쇄된 시스템 내에서, 열수준은 마이크로와트 범위에서 측정되어 박테리아9,,10,,11,,12의대사 역학을 연구할 수 있다. 박테리아에 의해 방출되는 열 (에너지)는 그들의 물질 대사의 기초가 되는 세포 기능에 연결되고 그 반드시 세포 biomass에 비례하지 않습니다.
처음에, 미생물 분석학을 위한 isothermal 열량의 적용성은 낮은 처리량 및 높은 시험 부피 때문에 제한되었습니다. 그러나, 사용된 마이크로칼로리미터는 이더스말 열량계의 장점을 처리량 증가 및 낮은 화합물 요구 사항과 결합하여 약물 발견 응용프로그램(10)에유용한 도구입니다. 또한, 이 계측기는 600nm(OD&600)에서 광학 밀도의 측정을 기반으로 하는 표준 탁도 방법과 같은 세균600성장 운동학을 측정하는 대체 방법에 비해 추가적인 이점을 제공한다. OD600을 측정하는 것은 증가된 광학 밀도가 미생물 성장과 동일하다는 가정에 기초하여, 따라서 실행 불가능한 세포의 존재를 소홀히 한다. 이 방법은 또한 작은 식민지 변이체및 persister cells(11)를배제하기 때문에 비판을 받고 있다. 대조적으로, IMC는 실행 가능한 세포의 모든 모형의 실시간 관찰을 허용합니다. 세포가 휴면 상태인 경우, 그들은 여전히 대사 활성을 나타내며 IMC에 의해 검출될 수 있으며, 이러한 현상은 표준 탁도법(11)에의해 검출될 수 없다. IMC의 다른 장점은 샘플7을파괴하지 않고 복잡한 지역 사회에서 약물 상호 작용을 측정하고 표준 분석 방법을 측정, 짧은 항균 감수성 테스트 시간을 포함한다.
IMC 기술은 미생물학에서 열발생 및 암 생물학,13,,14,15,16,,17에이르는 광범위한 연구에서 구현되었다., 미생물 응용 프로그램은 다양한 세균균에 대한 화합물의 최소 억제 농도 (MIC)의 결정을 포함한다. 여러 연구가 수행되었으며 대부분의 세균종에 대한 이더스말 열량에서 얻은 MIC 데이터가 더 빨리 얻을 수 있으며 결과는,MIC결정(12,18,19)에대한 다른 (표준) 방법에 비해 유사하다는 결론을 내렸다., IMC의 추가 응용 프로그램은바이오필름(11)과같은 복잡한 세균공동체와 약물의 상호작용과 약물의 조합을 관찰하는 것을 포함한다. MoA 프로파일링에 초점을 맞춘 연구는 마이크로칼로이미터가 1세대 및 2세대 세팔로스포린의 차이를 감지할 수 있는 반면, 동일한 MoA를 가진 다른 항생제는 서로 유사한 열 흐름 곡선을 나타내고있는 반면, 18.
여기에서는 새로운 비다른 미세 탈량계 계측기를 사용하여 새로운 천연 제품의 MoA 프로파일링을 위한 IMC의 사용을 설명합니다. 이 방법은 효과적인 항생제 농도를 결정하고 살균 또는 박테리오정성 메커니즘의 관점에서 항생제의 특성을 설명하는 데 사용됩니다. 이 방법은 화합물의 MoA 프로파일링에서 광범위하게 구현될 수 있으며 표준 미생물 방법을 대체하거나 적어도 보완할 수 있습니다. 향후 연구에는 표적 메커니즘에 따라 항생제 클래스의 분화를 가능하게 하는 심층 지문 분석이 포함됩니다.

<table><tbody><tr><td>Acinetobacter baumannii </td><td>DSMZ</td><td></td><td>본 연구에 사용된 참조 균주</td></tr><tr><td>calPlate</td><td>Symcel 1220093</td><td></td><td>48웰 플레이트 티타늄 컵 삽입용</td></tr><tr><td>calScreener</td><td>Symcel</td><td>1200001</td><td>등온 미세열량 측정기</td></tr><tr><td>calView 소프트웨어</td><td>Symcel</td><td></td><td>수집 및 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>calWell</td><td>Symcel</td><td>1901004</td><td>마이크로 바이오 등급(비활성) 48웰 플레이트, 티타늄 컵에 삽입되는 플라스틱 인서트</td></tr><tr><td>CASO 한천</td><td>Carl Roth</td><td>X937.1</td><td>미생물 분리 및 배양</td></tr><tr><td>Chloroamphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td>항생제</td></tr><tr><td>큐벳</td><td>브랜드</td><td>759015</td><td>1.5 mL 큐벳</td></tr><tr><td>일회용 접종 루프</td><td>Sarsted</td><td>86.1562.050</td><td>10 &micro; L 접종 루프</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td>, <td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td></tr><tr><td>, Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10428671</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>Sarsted</td><td>62.554.502</td><td>15 mL Falcon tubes</td></tr><tr><td>, Hydrochloride (HCL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10316380</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Hinton Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70192</td><td>항생제 감수성 연구를 위한 액체 배지</td></tr><tr><td>Mueller Hinton Broth II 양이온 조정 배지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90922</td><td>Mueller Hinton Broth 양이온 조정 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</sub로 양이온 조정></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>LABSOLUTE</td><td>7696404</td><td></td></tr><tr><td>피펫 100 - 1000 &마이크로; L</td><td>브랜드</td><td>705880</td><td></td></tr><tr><td>피펫 2 - 20 &마이크로; L</td><td>브랜드</td><td>705872</td><td></td></tr><tr><td>피펫 20 - 200 &마이크로; L</td><td>브랜드</td><td>705878</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 100 - 1000 L</td><td>브랜드</td><td>732032</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 2 - 200 &마이크로; L</td><td>Brand</td><td>732028</td><td></td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0972</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>항생제</td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>170356N</td><td>10 mL Nunc 혈청학 피펫</td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>Eppendorf AG</td><td>6135 000.017</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터</td><td>Minisart</td><td>16534----------K</td><td>0.2 &마이크로; m 기공 크기 멸균 필터</td></tr><tr><td>주사기 50 mL</td><td>NORM-JECT</td><td>22778</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>시그마-알드리치</td><td>87128</td><td>항생제</td></tr><tr><td>티타늄 컵</td><td>Symcel</td><td>1220089</td><td>48웰 티타늄 칼플레이트에 삽입</td></tr><tr><td>됨 티타늄 뚜껑</td><td>Symcel</td><td>1220091</td><td>티타늄 컵에 나사로 조이고 조여짐</td></tr><tr><td>Trimethroprim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7883</td><td>항생제</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Symcel</td><td>1900602</td><td></td></tr></tbody></table>

이더말 미세칼로리메트리를 사용하여 새로운 천연 제품의 박테리시달 또는 박테리오정성 효과를 결정하는 대사 프로파일링

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

항균 저항상승의 글로벌 위협으로 인해 새로운 항생제가 절실히 필요합니다. 우리는 이러한 새로운 화합물의 혁신적인 소스로 Myxobacteria에서 천연 제품을 조사. 프로세스의 한 병목 현상은 일반적으로 행동 모드의 해명입니다. 우리는 최근에 일상적인 프로파일링 파이프 라인의 일환으로 이더실 미세 종량제 측정을 설립했습니다. 이 기술은 바이오매스 형성에서 분리되는 프로세스를 포함하여 총 세균 대사 반응에 대한 항생제 노출의 효과를 조사할 수 있게 합니다. 중요한 것은, 박테리오정성 및 박유병 효과는 측정 중에 사용자 개입 없이 쉽게 구별할 수 있다. 그러나, 이소성 미세탈량법은 다소 새로운 접근법이며 이 방법을 상이한 세균종에 적용하는 것은 일반적으로 적합한 측정 조건의 사전 평가를 필요로 한다. 특정 박테리아의 몇 가지 참조 열화상이 있다, 크게 결과의 해석을 촉진. 기준 데이터 풀이 꾸준히 증가함에 따라, 우리는 방법론이 미래에 점점 더 큰 영향을 미칠 것으로 예상하고 항생제 클래스의 차별화를 가능하게 하는 심층 지문 분석을 허용할 것으로 기대합니다.

새로운 항생제의 행동 모드의 해명은 약물 발견 과정에서 도전적인 작업입니다. 여기에 설명된 방법의 목표는 약물-미생물 상호 작용에 대한 추가적인 통찰력을 제공하기 위해 항균 프로파일링에서 calScreener를 사용하여 이더스말 미세칼량의 적용입니다.

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

새로운 항균 화합물의 행동 모드를 이해하는 것은 중요하지만 어려운 작업입니다. 이 방법은 이러한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며 구현하기 쉽습니다. 이 기술은 추가 견본 분석을 가능하게 하는 비침습적인 방식으로 항균 효력의 실시간 관찰을 허용합니다.미생물 기술로 연습하는 것은 전제 조건이지만 실험은 수행하기 쉽습니다. 처음으로 미세 칼량 분석을 수행 할 때 데이터 분석으로 시간을 보내는 것은 매우 중요합니다. 600 나노미터의 파장에서 분광계를 사용하여 야간 배양의 광학 밀도를 측정합니다.배양을 신선한 MHB 중간 농도의 밀리리터당 5회 10번으로 희석하고 관심의 농도로 항생제의 각 1.5 밀리리터 튜브에 150 마이크로리터의 세포를 첨가한다. 그런 다음 화합물을 소용돌이에 의해 세포와 혼합합니다. 인서트를 준비하려면 각 박테리아 항생제 혼합물의 120 마이크로리터를 48웰 플레이트의 적절한 우물에 개별 플라스틱 인서트에 넣고 핀셋을 사용하여 모든 티타늄 바이알을 홀더에 넣습니다.인서트를 홀더 플레이트의 티타늄 바이알에 부드럽게 옮기고 티타늄 뚜껑을 모든 바이알에 느슨하게 놓습니다. 모든 인서트가 전달되면 홀더를 샘플 스테이션의 지정된 영역에 배치하고 40cm뉴턴 미터로 설정된 토크 렌치를 사용하여 모든 뚜껑을 조입니다. 시스템 소프트웨어에서 새로운 실험을 시작하고 계측기에서 샘플 삽입 암을 철회합니다.컵 홀더를 브리지에 놓고 컬럼 8개가 샘플 삽입 개구부를 향하게 하고 컵 홀더를 1위치에 있는 악기에 부드럽게 밀어 넣습니다. 실험용 우물에 레이블을 지정하기 전에 시스템이 안정화될 때까지 10분 간 기다립니다. 다음으로, 컵 홀더가 2위치에 놓일 때까지 샘플 삽입 암을 밀어 넣습니다.시스템이 20분 동안 안정화될 수 있도록 허용한 후, 시료 삽입 암을 밀어 3개의 위치를 지정하고 실행 위치에 있을 때까지 시료 삽입 암을 철회합니다. 소프트웨어의 모든 우물을 강조하고 반응 시작을 선택한 다음 열 방출 판독이 0으로 안정적으로 돌아올 때까지 실험을 실행합니다. 분석이 끝나면 중지를 선택합니다.소프트웨어는 당신이 확신하는 경우 물어볼 것입니다. 예를 선택하고 데이터 분석을 위해 실험을 저장합니다. 그런 다음 샘플 삽입 암을 기기에 완전히 삽입하고 자석을 참여하여 컵 홀더를 회수합니다.데이터를 분석하려면 소프트웨어를 열고 열린 실험을 선택합니다. 팝업 창에서 관심 있는 실험을 선택하고 열기를 클릭합니다. 모든 것을 선택하고 기준선을 정의하여 각 위치에서 데이터를 정규화합니다.팝업 창에서 지연 단계 내에서 30분 이상의 기간을 선택합니다. 선택 후 열람에 기준선이 녹색으로 표시됩니다. 정의 기준단 창을 닫은 다음 저장을 클릭하고 소프트웨어를 닫습니다.다음으로 웹 기반 SymCel 열량 분석 응용 프로그램을 엽니다. 관심 있는 파일을 업로드하고 실험을 선택하려면 찾아보기를 클릭합니다. 대사 매개 변수는 32개의 샘플에 대해 자동으로 계산됩니다.열 흐름 데이터를 Gompertz 및/또는 Richards Growth 모델에 맞게 하려면 성장 기능을 클릭합니다. 성장 모델은 흐름 섹션의 원시 데이터와 비교하기 위해 누적 섹션에 표시됩니다. 계산된 매개 변수를 다운로드하려면 측정값을 다운로드하고 파일 위치를 선택하고 저장을 클릭합니다.추가 분석을 위해 파일을 스프레드시트로 내보내집니다. 여기서, A.baumannii DSM-30008을 직렬 희석시 시프로플로사신에 노출시킴으로써 얻은 열화상이 표시됩니다. 0.005와 0.1 마이크로몰라 사이의 농도는 A.baumannii 성장과 신진 대사에 최소한의 영향을 미칩니다.그러나 0.5 마이크로몰라 ciprofloxacin으로 세포를 치료하는 것은 지연 단계 지속 시간 지속 시간에 상당한 변화를 일으키고 더 낮은 최대 열 흐름으로 이어집니다. 이 두 가지 변경 사항은 함께 피크 시간에 영향을 미치므로 약 6시간이 증가합니다. 이 그림에서 누적 방출 열은 경사경사에 의해 반사되는 각 농도의 효과와 함께 시간에 대해 플롯됩니다.열화상 경사의 정량화는 0.5 마이크로몰라 ciprofloxacin으로 처리된 세포에서 관찰되는 대사속도의 수반감소와 함께 ciprofloxacin의 존재에 있는 A.baumannii의 최대 신진 대사 속도의 계산을 허용합니다. 리팜피신 치료는 A.baumannii DSM-30008의 열화상에 극적인 영향을 미칩니다. 신진 대사 활동의 감소와 상관 관계가 있는 열 방출의 현저한 감소는 또한 관찰됩니다.시험된 모든 농도에 대해 피크화하는 시간 증가와 일반적으로 bactericidal 효과에 기인하는 모든 농도에 대한 경사의 감소로 인한 신진 대사 속도의 감소를 유의한다. 최적의 결과를 얻으려면 시료를 전송할 때 역파이프를 사용하고 인서트 측에 추가 유체를 방지하여 뚜껑이 제대로 닫혀 있는지 확인합니다.

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연구

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박테리아 배양액을 연속적으로 희석하여 성장 배지가 들어 있는 열량 측정 바이알에 분취량을 추가합니다.밀봉된 바이알을 등온 미세열량계의 멀티웰 플레이트에 넣어 대사열 생성을 측정합니다.이 장치는 감지된 열이 박테리아 대사에서만 발생하도록 일정한 온도로 유지됩니다.박테리아는 영양분을 대사하고 증식하면서 센서가 실시간으로 감지하는 열을 방출합니다.동시에 인큐베이터에서 동일한 바이알을 배양합니다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정하여 박테리아 성장을 모니터링합니다.희석액의 열량 측정 신호를 사용하여 열 활성 곡선을 구성하고 이를 OD 값과 연관시킵니다.날카로운 첫 번째 피크는 기하급수적인 성장 중 유산소 호흡을 나타냅니다.산소가 제한되면 세포는 혐기성 발효로 전환하여 두 번째 날카로운 피크를 생성합니다.정지기에 들어가면 박테리아는 효소를 분비하여 세포외 단백질을 분해하고 신진대사를 유지하여 넓은 피크를 생성합니다.

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