Name: 실험실 간 비교를 통해 수성 매체의 금 나노 입자의 나노 입자 추적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 배우세요 수성 매체에서 금 나노입자의 유체역학적 직경을 측정하는 나노입자 추적 분석법을 실시간 영상 분석과 최소한의 시료 준비로 정확하고 재현성 있는 결과를 얻는 방법입니다.

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저자는 H2020 자금 지원 프로젝트에서 재정 지원을 인정: ACEnano (보조금 계약 없음 720952). 또한 산업통상자원부가 지원하는 국제협력R&D 프로그램(보조금 번호 N053100009, '호라이즌2020+2020+ACEnano 툴박스')의 컨소시엄에 한국 파트너들의 참여를 가능하게 했다.

여기에 설명된 방법론은 실험실 간 비교의 세 번째 라운드에 사용되었다.
1. 샘플 준비
<ol><li>0.02 μm 주사기 필터를 통해 물을 필터링합니다. 물 여과는 시료 희석을 위해 사용하기 전에 오염 입자를 제거하는 데 필요합니다.</li>
	<li>새로 준비된 시료를 분석하기 위해 여과된 초순수수에서 60nm 금 콜로이드 분산의 샘플을 50배의 비율로 희석시켰다. NTA 분석을 위한 제안된 농도는 mL 당 1 x 107 - 1 x 109 입자입니다.</li>
</ol>2. 측정 수행
<ol><li>시스템 전환<ol>
<li>NTA 기기, 주사기 펌프 및 컴퓨터를 연결합니다. 하드웨어 및 소프트웨어를 켭켜보겠습니다. 관련 소프트웨어(재료 표참조)는 모든 하드웨어 통신이 실행 되고 라이브 온도 판독이 표시되도록 합니다.</li>
		<li>NTA에서 레이저 모듈을 제거하고 조직 및 압축 공기를 사용하여 유리 표면과 낮은 부피 유량 셀(LVFC) 내부 채널, 튜브 및 유체 포트를 완전히 건조시합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜빙 프라이밍<ol>
<li>초순수 물로 입구 유체 튜브를 헹구면 입자를 제거하고 측정을 방해하는 기포의 가능성을 줄입니다. 헹구기 위해 기기 케이스 내부의 입구 튜브 의 끝이 폐기물 용기에 배치됩니다.</li>
		<li>루어 포트에 여과된 물의 1mL 주사기(바늘 없이)를 삽입하고 백압이 허용하는 한 빨리 입구 튜브를 통해 액체의 ~900 μL을 밀어 넣습니다. 주사기를 방지하기 위해 부착 된 나머지 액체가 들어있는 주사기를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사기 펌프 튜브 연결<ol>
<li>레이저 모듈에 LVFC를 조립하여 도 1에서볼 수 있는 샘플 챔버를 만듭니다. 콘센트 튜브를 LVFC의 오른쪽 포트에 부착합니다. 참고: 입구와 콘센트 튜브는 직경이 다르며 입구는 콘센트보다 직경이 작습니다. 입구 출구 튜브 연결을 교환하면 흐름 셀을 압박하고 누출될 수 있습니다.</li>
		<li>인렛 튜브에서 주사기를 분리하고 여과된 물 1mL가 들어있는 새로운 주사기교환을 통해 액체대액체 접촉을 보장합니다. 입구 튜브를 LVFC의 왼쪽 포트에 연결합니다. 천천히 샘플 챔버에 유체의 ~ 500 μL을 소개합니다. 적재 중에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 최종 튜빙 구성은 그림 2에표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig1v2.jpg"> 그림 1: 레이저 모듈에 장착된 저부피플로우셀 어셈블리. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig02.jpg"> 그림 2: 낮은 볼륨 흐름 셀 튜브 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="4"><li>레이저 모듈 로딩 및 시스템 검사<ol>
<li>레이저 모듈에 채워진 물으로 LVFC를 계측기로 삽입하고 제자리에 고정하십시오.</li>
		<li>주사기를 주사기 펌프 요람에 넣고 안전하게 보호합니다. 소프트웨어 인터페이스에서 카메라 시작을 클릭하여 카메라를 초기화합니다. 인터페이스의 하드웨어 탭에서 분산을 클릭하여 참조 위치를 이동합니다.</li>
		<li>카메라 레벨을 16으로 설정하고 포커스를 수동으로 조정하여 모든 파티클에 대한 희석제를 확인합니다. 주 보기 창을 클릭하고 마우스를 사용하여 위아래로 드래그하여 파티클을 확인하여 뷰 위치 필드를 조정합니다. 시야에 3개 이상의 입자가 있는 경우, 이는 수질 순도 또는 세척 과정에 문제가 있음을 의미하므로 세척 공정을 반복하거나 물을 교체하거나 여과해야 합니다.</li>
		<li>기기에서 레이저 모듈을 제거합니다.</li>
		<li>인렛 튜브에서 주사기를 분리하고 공기만 가득 찬 주사기로 교체하십시오. 천천히 내부액체를 제거하기 위해 샘플 챔버에 공기를 도입한다. 레이저 모듈에서 LVFC를 제거하고 튜브를 분리합니다. LVFC의 유리 표면과 레이저 모듈의 광학 유리를 물로 청소하고 조직과 압축 공기로 건조시다. 압축 공기로 튜브를 건조. LVFC를 레이저 모듈에 다시 조립하고 튜빙을 연결하여 시료 적재를 준비합니다. 참고: 이 단계는 항상 필요한 것은 아니지만,이 경우 가능한 변형을 더 줄이기 위한 추가 예방 조치로 추가되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>로딩 샘플<ol>
<li>2.2.2단계를 반복합니다. 60nm 금 나노입자 분산의 1mL를 함유한 주사기를 루어 포트에 1.1단계에서 연결한다. 기포가 도입되지 않도록 기기 외부에서 볼 수 있는 레이저 모듈로 입구 튜브를 통해 샘플의 750 μL을 LVFC에 천천히 주입합니다.</li>
		<li>레이저 모듈을 NTA 기기에 다시 로드하고 소프트웨어 인터페이스에서 카메라 시작을 클릭하여 카메라를 초기화합니다. 인터페이스의 하드웨어 탭에서 분산을 클릭하여 참조 포커스 위치로 이동하여 파티클의 선명한 이미지를 제공하기 위해 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다.</li>
		<li>레이저 빔 위치와 관련하여 시야가 중앙으로 설정되어 있는지 확인합니다. 소프트웨어의 주 보기 창을 클릭하고 마우스가 위아래로 드래그하여 왼쪽으로 조정합니다.</li>
		<li>자동 설정 기능을 실행하여 최적의 이미지 품질을 달성할 수 있도록 초점 및 카메라 레벨을 자동으로 최적화합니다. 참고: 자동 카메라 및 포커스 매개 변수는 사용자 독립적이므로 서로 다른 랩 간에 더 많은 일관성을 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 분석<ol>
<li>표준 측정, SOP 탭에서 측정 스크립트를 작성하여 60s의 반복 비디오를 느리게(파티클은 화면의 한쪽에서 약 10s로 통과해야 합니다)와 일정한 흐름(보충파일 1)을얻습니다. 참고: 전체 샘플을 더 잘 표현하여 측정을 위해 흐름이 표시되도록 하는 것이 좋습니다. 시료에 느린 흐름이 전달될 때 농도 측정의 정밀도와 반복성이 크게 향상되어 더 많은 수의 새로운 입자가 측정 영역을 통해 흐르고 실험 중에 분석됩니다. 비디오 길이는 프로파일 분포와 분석 시간 동안의 변수에 따라 달라집니다. 60초의 동영상 5개는 일반적인 측정 지속 시간으로 간주됩니다.</li>
		<li>실험 파일 이름과 데이터의 위치를 설정하고 실행을 시작합니다. 설명된 절차에 따른 분석은 호라이즌 2020 ACEnano 프로젝트17의7개 실험실에 의해 수행되었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 분석
참고: 모든 데이터 분석은 v 3.4 소프트웨어(재료 표참조) 내에서 수행되었으며 추가 수동 변환이나 계산이 사용되지 않습니다. 입자 크기 조정 데이터는 히스토그램 분포로서 원시 형태로 제시되며 스토크스-아인슈타인 방정식을 사용하여 입자의 위치의 측정된 변화로부터 계산됩니다. 이 소프트웨어는 x 및 y 평면의 각 파티클에서 이동되는 평균 거리를 결정합니다. 이 값을 통해 입자 확산 계수(D)가 결정될 수 있으며, 샘플 온도 T 및 용매 점도 η 알려져 있는 경우, 입자의 동등한 구형 유체 역학 반경, RH,입자의 계산될 수 있다. 샘플의 온도는 NTA에 의해 자동으로 기록됩니다. 소프트웨어가 사용하는 기본 샘플 점도는 물에 대한 것이며 위에 표시된 측정 스크립트에 포함되어 있지만 측정 전이나 후에 다른 샘플 희석제를 사용할 때 점도를 수정할 수 있습니다.
<ol><li>슬라이더 막대를 드래그하거나 +를 클릭하여 DT(검출 임계값)를 설정하고 - 감지 임계값아래 소프트웨어의 버튼, 이는 시각화된 입자의 최적 추적을 위한 분석 매개 변수입니다, 사이 2 과 20. 선택한 DT 값이 가능한 한 많은 표시되는 파티클을 식별하고 추적해야 합니다(소프트웨어 이미지 화면에서 빨간색 십자가로 자동으로 표시됨).<ol>
<li>검출 임계값을 설정하기 위한 지침으로, 이미지에서 확인된 입자의 수는 약 30-80의 범위에 있어야 하며, 10개 이하의 적십자가는 관찰자가 입자로 간주되지 않는 사이트에 대응해야 합니다. 5개 이상의 파란색 십자가(노이즈를 나타내는)가 관찰되지 않아야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig03.jpg"> 그림 3: 임계값 설정 관측값입니다. 나쁜(왼쪽) 및 양호한(오른쪽) 검출 임계값 설정 관찰. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>소프트웨어의 프로세스 버튼을 눌러 파티클 추적 분석 비디오를 자동으로 처리합니다. 모든 처리 매개 변수를 자동으로 설정하고 전체 파티클 크기 분포와 측정 설정을 설명하는 추가 메타데이터가 있는 .csv 형식 결과 파일로 데이터를 내보냅니다. 측정 품질을 확인하려면 소프트웨어의 분석 탭을 보거나 경고 메시지 또는 경고에 대한 .csv 출력 파일을 확인합니다. PDF 결과 보고서의 예는 보충 파일 2에 표시됩니다.
</li>
	<li>모드 크기 결과 및 PDF 보고서의 관련 표준 편차를 읽어보십시오. 참고: 모드 크기 결과는 7개의 실험실 사이에서 얻은 크기를 비교하는 데 사용되었으며 섹션 5에 표시되고 논의됩니다.</li>
</ol>4. 청소 및 건조
<ol><li>사용 후, 깨끗한 물로 시스템을 철저히 플러시하여 튜브 및 광학 표면에서 샘플의 모든 흔적을 제거하십시오. 경전 시야에서 입자의 양을 관찰하여 세척 효과를 모니터링할 수 있습니다.</li>
	<li>NTA 기기에서 레이저 모듈을 제거합니다.</li>
	<li>튜브와 LVFC를 비우기 위해 시스템을 통해 공기 주사기를 적재합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxidative+toxicity+of+Ag+and+ZnO+nanoparticles+towards+the+aquatic+plant+Spirodela+punctuta+and+the+role+of+testing+media+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science-Processes+and+Impacts%22%5BJournal%5D)">The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters.</a> Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).</li>
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</ol>

저자 조 설리반, 아그니에슈카 시우파, 폴린 카넬 모리스와 미셸 카르보니는 이 기사에서 사용되는 악기를 제조하는 말번 파날리티컬(Malvern Panalytical Ltd.)의 직원입니다.

라운드 1 ILC에서 얻은 일관되지 않은 결과는 오래된 시스템에 대한 계측기 건강 검사의 필요성뿐만 아니라 보다 상세한 SOP의 개발, 실습 교육의 필요성 및 측정 및 분석 설정에 대한 더 나은 이해를 강조하여 다양한 실험실에서 보다 일관된 결과를 보장합니다. 실제로 Hole et al.은 NTA 시스템을 사용하고 샘플을 준비하는 방법에 대한 공유 지침이 없는 것으로 나타났으며, 이는 상대적으로 단분산된샘플(16)에서도실험실 전반에 걸쳐 가변성을 초래했다. 따라서 모든 ILC 참가자들은 시스템 운영 및 측정 조건에 대한 모범 사례를 다루는 교육 워크샵에 참석했으며 특정 NTA 기기에 대한 청소 및 유지 보수 지침을 포함했습니다. 모든 참가자는 또한 후속 ILC 라운드에 대한 자신의 실험실에서 동일한 기기에 측정을 수행했다. 이 절차는 먼저 라텍스 표준 샘플(ILC 라운드 2)에서 ILC를 실행하여 각 실험실에서 시스템을 로컬로 테스트한 라운드를 수행한 후 파트너가 금 측정(ILC Round 3)을 반복하는 데 사용되었습니다. NTA를 통해 이러한 금 샘플을 측정하는 목적은 나노 안전 유도 프로토콜에 영향을 미치는 데 필요한 나노 물질 위험 평가 방법 및 관행에 자신감과 명확성을 도입하는 것이었습니다.
NTA는 입자의 유체역학 구형 동등한 직경을 측정할 수 있고 입자에 의해 입자에 사용할 수 있는 기술이며, 입자에 의해 입자에 사용할 수 있으며, 10nm - 50nm, 약 1000nm 크기에 이르는 다분산 시스템의 실시간 시각적 분석(샘플 특성 및 계측 구성에 따라 다름)에 사용된다. 최소한의 샘플 준비가 필요합니다. 최소한의 샘플 준비에도 불구하고,이 단계는 프로토콜에 매우 중요하며 샘플을 희석하고 희석제를 선택할 때 세심한주의를 기울여야합니다. 구형 등가물 크기 측정을 획득하고 비구형 입자가 덜 정확한 크기 값을 가지기 때문에 모양은 NTA와 관련하여 제한 요인이 될 수 있습니다.
NTA 기술의 경우 전체 샘플에서 대표 샘플만 관찰하므로 일부 결과 변형이 항상 예상됩니다. 모든 결과는 파티클 크기 조정에 대한 ISO 19430 표준을 충족합니다. 제공하는 최적의 농도는 일반적으로 30-60초 분석 시간 내에 약108개의 입자/ml이다. 입자 농도가 낮은 샘플의 경우 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 분석 시간이 길어집니다. 109 입자/mL보다 큰 입자의 농도를 포함하는 샘플의 경우, 추적 문제의 가능성이 더 높으며 시료는 NTA 측정에 적합한 범위로 희석되어야 합니다.
전반적으로3라운드 ILC의 결과는 NTA를 통해 금 나노입자 측정의 좋은 재현성을 보여 주며 정확도와 반복성이 향상되었습니다. 모든 NTA 측정은 자동 카메라 레벨 및 초점 설정을 사용하여 소프트웨어의 자동 설정 기능에 의해 선택된 이미지를 조정했습니다. 소프트웨어가 설정한 카메라 레벨은 매우 일관되었으며, 모든 경우에 카메라 레벨이 10 또는 11로 설정되어 예상대로 프로세스가 더 일관성을 얻을 수 있음을 보여 줍니다. 크기 조정 결과는 TEM이 결과를 재현할 수 있음을 나타내는 TEM을 통해 제조업체가 얻은 것과 비교할 수 있었지만, TEM이 유체 역학 직경을 결정하지 않기 때문에 다른 기술로부터 최소한의 차이가 예상되어야 한다. 결과의 일관성이 크게 향상되면 계측기 유지 보수, 상세한 SOP, 모범 사례 업데이트, 사용자 지식 및 NTA용 응용 측정 자동화의 중요성과 이점을 보여줍니다. 결론적으로 ILC는 이 특정 NTA SOP를 검증하고 따라서 이 특정 나노 물질 위험 평가 방법에 대한 신뢰와 명확성을 도입했습니다.

나노 물질(NM)은 물리적 및 화학적 특성 모두에서 다양하여 차례로 행동, 안정성 및 독성1,2,3,4,5에영향을 미칩니다. 주요 어려움 중 하나는 NM 특성, 위험 및 행동에 대한 철저한 이해를 개발할 때 물리적 및 화학 적 나노 물질 특성에 대한 재현 가능한 정보를 얻을 수있는 능력입니다. 이러한 물리적 특성의 예로는 입자 크기 및 크기 분포6,7,8이포함됩니다. 이들은 유럽 위원회의 (EC) 용어'나노'9의정의의 핵심 측면이기 때문에 중요한 매개 변수입니다.
정확한 입자 크기 측정을 달성하는 것은 NM6,10의운명과 독성 효과를 이해하는 것 외에도 많은 다른 산업 및 연구 응용 프로그램 및 공정에도 중요합니다. NM의 크기를 정확하고 안정적으로 측정할 수 있는 잘 확립된 방법을 갖추는 것이 중요합니다. 더욱이, 보고된 정보는 예를 들어, 크기 파라미터의 유형(예를 들어, 실제 크기 또는 유체역학적 크기)뿐만 아니라 샘플 조건(예를 들어, NM이 존재하는 특정 매체) 및 상이한 매체에서 안정적으로 수행하는 방법을 나타내는 등 사용되는 기술에 대한 깊은 이해를 제공해야 한다. 크기를 측정하기 위해 전자 현미경 검사법(EM), 동적 광 산란(DLS), 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(spICP-MS), 차동 원심 퇴적물(DCS), 스캐닝 프로브 현미경(SPM), 소형 앵글 X선 산란(SAX) 산란(SAX) 분석 등 다양한 기술을 사용할 수 있습니다.
NTA는 최근 몇 년 동안 잘 진보된 비교적 새로운 기술로, 환경 관련성과 같은 복잡한 수성 매체에서 구형 NM의 유체 역학적 직경을 안정적으로 측정하는 것으로 나타났습니다( 예: 담수 시스템) 등이 있습니다. 유체 역학 직경은 '측정되는 입자와 동일한 방식으로 확산되는 가상 하드 구의크기'11; 실용적인 용어와 수성 매체에서 이것은 약한 정전기력에 의해 입자의 표면에 보유된 분자층(주로 물)을 포함하는 입자 자체의 직경보다 더 큰 직경을 설명합니다. 입자의 유체 역학 직경은 다른 매체에서 달라지며 측정되는 미디어의 이온 강도가 높아짐에 따라 작아집니다.
NTA 기술의 또 다른 중요한 특징은 분석가가 EC 나노 물질 정의의 맥락에서 필요한 수중 크기 측정을 달성할 수 있다는 것입니다. 고해상도, 입자별 분석으로 인해 이 기술은 입자 처리량10,12의높은 비율로 이질적인 테스트 샘플에 존재할 때 응집제 또는 더 큰 입자로 인한 간섭에 덜 수반된다.
측정 절차는 시료 희석이 필요한 시료의 적절한 현탁액을 준비하는 것으로 구성되며, 그 다음에입자의 브라우니아 동작 동작 및 비디오 분석을 비디오 녹화합니다. 샘플 챔버에서 레이저 빔이 전달되고 레이저 빔의 경로에 있는 서스펜션 입자가 빛을 분산시켜 장착된 카메라로 광학 현미경을 사용하여 시각화로 이어집니다. 카메라는 브라우니아 운동 아래 움직이는 입자에서 흩어진 레이저 빛의 비디오 파일을 캡처합니다. 많은 입자가 개별적으로 추적하여 확산 계수를 결정하고 그들의 유체역학 적 직경은 스토크스-아인슈타인 방정식을 사용하여 계산될 수 있다: d = kT/3πθD 어디 d는 유체 역학 직경, K는 볼트만 상수, T는 온도, η 점성 및 D는 확산계수(10)이다. NTA는 또한 일반적으로 콜로이드불안정입자의 집계 거동(입자는 측정 시간 척도에 걸쳐 콜로이드적으로 안정되어야 한다)13,14를추적하는 데 사용될 수 있다. NTA는 절대적인 방법이며 이 작업에 사용되는 계측기에서는 시스템 교정이 필요하지 않습니다. 사용자가 시스템 성능을 확인하려는 경우 원하는 만큼 크기 표준 재료를 측정하여 쉽게 수행할 수 있습니다.
NTA 계측기는 빠른 분석 시간(샘플당 10분 미만)으로 조작이 용이합니다. 데이터 반복성과 재현성이 우수한 고품질 측정을 위해 시료 준비와 계측기 작동 모두에서 여러 가지 요소를 고려해야 합니다. 이러한 요인을 신중하게 고려하지 않으면 다른 실험실 및 작업자에서 동일한 재료에 대한 측정을 알 수 없거나 제대로 정량화되지 않은 불확실성의 대상이 될 수 있습니다. NP 특성화 동안, 자체 개발한 모범 사례를 사용하는 것이 DLS기술(15)에대해 Roebben 등에서 알한 바와 같이 항상 다른 실험실과의 일관성을 보장하지는 않는다.
사실, 다른 실험실, 사용자 및 악기 사이의 초기 (첫 번째 라운드) NTA ILC는 일관성없는 결과를 밝혔다. 주요 문제 중 하나는 정기적인 서비스 나 교정 검사가 없었던 다양한 오래된 레거시 악기의 사용뿐만 아니라 방법 해석의 차이였습니다. Hole et al.에 의한 NTA ILC 연구는 시스템을 사용하고 샘플을 준비하는 방법에 대한 공유 지침이 없는 상태에서 상대적으로 단분산 된샘플(16)에서도실험실 간 가변성이 클 수 있음을 발견했습니다. 이는 ILC의 첫 번째 라운드의 결과와 함께 좋은 계측기 유지 보수뿐만 아니라 방법 교육 및 잘 개발 된 표준 운영 절차 (SOP)의 필요성을 강조합니다. 후자는 좋은 관행을 준수하고 문서화하는 강력한 도구 역할을합니다. 잘 상세한 경우, 표준 운영 절차 (SOP)는 명확성, 설명, 이해, 표준화 및 품질 보증을 제공 할 수 있습니다.
따라서 ILC 연구를 채택하는 것이좋습니다. ILC 운동은 이 특정 NTA SOP를 검증하기 위하여 행동하고 그러므로 이 특정 나노 물질 위험 평가 방법에 신뢰 그리고 명확성을 소개했습니다. 3라운드가 진행되었습니다. 라운드 1은 훈련 전에 각 참가자의 자신의 기기에 60 nm 금 나노 입자를 분석했다. 라운드 2는 악기가 올바르게 설정되어 사용자가 악기를 사용하는 방법에 대한 좋은 지식을 가지고 있는지 확인하기 위해 간단한 테스트로 일반적인 구성과 함께 새로운 악기를 사용하여 100 nm 라텍스를 분석하는 것을 포함했다. 3라운드는 훈련 후 공통구성을 가진 새로운 기기에서 60nm 금 나노입자의 분석을 포함했다. ILC의 참가자들은 7개의 다른 실험실에서 왔으며, 호라이즌 2020 ACEnano 프로젝트17의모든 컨소시엄 멤버.
이 문서의 목적은 60 nm 금 NP가 상세한 교육 및 SOP 개발에 따라 7 개 파트너에 의해 다시 분석 된 NTA 기술에 대한 벤치 마킹의 세 번째 라운드에서 방법과 결과를 논의하는 것입니다. ILC의 첫 번째 라운드에서 얻은 결과에 대한 비교 및 참조도 이루어질 것입니다. ILC 의 3 라운드에서 모든 분석은 405 nm 레이저와 고감도 sCMOS 카메라와 함께 제공되는 동일한 구성의 동일한 악기 (재료의 표참조)를 사용하여 수행되었다. 벤치마킹은 샘플에서 기술의 성능을 평가하므로 '모범 사례' 프로토콜의 개발로 이어집니다. 따라서, 이 문서는 국제 표준에 따라 IlC를 지휘하고 평가함으로써 조화를 이룬 이 ILC에 사용되는 기기에 대한 NTA 방법을 공유하고 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>60nm 금 콜로이드 분산액</td><td>BBI 솔루션 OEM Ltd.</td><td>제품 EM. GC60, 배치 번호 024650</td><td></td></tr><tr><td>0.02 &마이크로; m 주사기 필터 - Whatman Anotop 25 멸균 주사기 필터</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA68092102</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 소프트웨어 v3.4</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>v3.4</td><td></td></tr><tr><td>주사기 PP/PE 바늘 없는 루어 슬립 팁, 중앙, 용량 1&nbsp; mL, 눈금, 0.01&nbsp; mL, 멸균</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z230723</td><td></td></tr></tbody></table>

실험실 간 비교를 통해 수성 매체의 금 나노 입자의 나노 입자 추적 분석

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

나노 기술 분야에서 분석 특성화는 나노 물질 (NMs)의 행동과 독성을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 특성화는 철저해야 하며 선택된 기술은 결정될 특성, 분석되는 재료 및 존재하는 매체에 적합해야 합니다. 또한, 계측기 작동 및 방법론은 데이터 수집 오류를 피하기 위해 사용자가 잘 개발하고 명확하게 이해해야 합니다. 적용된 방법 이나 절차의 불일치는 얻어진 데이터의 차이와 불량 재현성으로 이어질 수 있습니다. 이 논문은 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 통해 금 나노 입자의 유체 역학 적 직경을 측정하는 방법을 명확히하는 것을 목표로합니다. 이 연구는 표준 수술 절차의 성능과 재현성을 검증하기 위해 7개의 다른 실험실 중 실험실 간 비교(ILC)로 수행되었습니다. 이 ILC 연구에서 얻은 결과는 자세한 표준 운영 절차(SOP), 모범 사례 업데이트, 사용자 지식 및 측정 자동화의 중요성과 이점을 보여줍니다.

다양한 NTA 계측기 구성을 사용한 라운드 1 ILC 결과는 도 4에나와 있다. Lab 6을 제외하고 5캡처 반복 간의 반복성은 좋았지만 여러 랩에서 예상보다 높은 모드 크기를 기록했습니다. Lab 6 결과는 반복성이 좋지 않으며 측정된 모드 크기가 훨씬 높은 것으로 나타났습니다. 조사 후, 가장 큰 크기 변동을 보고하는 시스템이 권장대로 유지되지 않았거나 분석이 샘플 준비의 불일치에 의해 영향을 받았으며, 이에 따라 희석 단계는 다른 파이펫팅 장비, 사용자 작동 및 기술 및/또는 측정 설정으로 인해 다양한 파이펫팅 장비, 사용자 작동 및 기술, 및/또는 측정 설정등 다양한 파이펫팅 장비에 의한 변동을 생성할 수 있고, 잘못된 카메라 레벨이 사용되고, 이미지가 제대로 집중되지 않고, 분석 문턱을 잘못 설정하였다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig4v2.jpg"> 그림 4: ILC 라운드 1 모드 크기 결과. 모드 크기는 다른 NTA 기기에서 수행된 라운드 1 60 nm 금 나노 입자 분산에 대한 모든 NTA 벤치마킹 파트너의 결과(x 축에서 축약).
3라운드의 NTA 결과 정확도는 동일한 SOP 및 계측기 설정을 구현하는 모든 실험실에 의해 향상되었습니다. 이 ILC 라운드 3에 대해 얻은 모드 크기 결과는 그림 5에서볼 수 있습니다. 모든 실험실의 평균 모드는 62.02 ± 1.97 nm였습니다. 3라운드의 모든 측정 된 결과는 제조업체가 언급한 대로 배치에 대한 60.5 nm 평균 크기의 10 % 이내의 결과가 잘 떨어지는 첫 번째 단계 결과보다 더 일관되게 일치했습니다. 제조업체가 언급한 금 샘플의 변동 계수는 ≤8%였다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig5v2.jpg"> 그림 5: ILC 라운드 3 모드 크기 결과. 모드 크기는 동일한 NTA 기기에서 분석된 60nm 골드 ILC 라운드 3의 모든 NTA 벤치마킹 파트너의 결과입니다. 모든 실험실의 평균 모드는 62.02 ± 1.97 nm였습니다.
제조자가 제공한 입자 크기를 확인하기 위해, 입자의 소수(N=82)는 전송 전자 현미경검사(TEM)에 의해 분석되었다. 희석되지 않은 분산의 약 10 μl은 200 kV에서 분석 TEM에서 이미징하기 전에 탄소 코팅 된 Cu TEM 그리드에 캐스팅되고 공기 중건조되었다. 보충 도 1과 같은 이미지는 입자가 겹치는 영역에서 가져와 반자동 이미지 분석 프로세스를 사용하여 분석했습니다. 이 공정의 분리된 입자 및 공물에 자동 분수령 방법을 적용하였으며, 에지입자(18)에서도제외되었다. 평균 직경은 주축 및 소축(61± 7nm)에서 평균또는 구형 입자를 가정하는 측정 영역(62± 6nm)에서 변환된 것으로 계산하였다. 파티클은 평균 종횡비 1.1을 가진 구형인 것처럼 보입니다. TEM 결과는 제조업체 값(60.5nm)보다 약간 높은 직경을 나타내지만 공차 수준 내에 있습니다. 또한, 유체 역학 직경의 NTA 파생 값과 매우 좋은 계약이있다.
보조 도 1: 60 nm 골드 나노 입자의 TEM 이미지. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 측정 스크립트. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/Measurement_script.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: PDF 결과 보고서의 예입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/PDF_results_report.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서 설명된 프로토콜은 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 수성 물질에서 구형 나노 입자, 보다 구체적으로 금 나노 입자의 유체역학적 직경을 측정하는 것을 목표로 한다. 후자는 브라우니아 운동으로 인한 입자의 움직임을 추적하고 유체 역학 직경을 얻기 위해 스토크스 - 아인슈타인 방정식을 구현하는 것을 포함한다.

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

이 프로토콜은 나노 입자 추적 분석을 사용하여 관심 나노 물질의 유체역학적 직경에 대한 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 측정을 수행합니다. 이 방법은 빠르고 쉽게 수행할 수 있으며, 입자별 실시간 시각적 분석과 최소한의 시료 준비를 통해 입자의 유체역학적 구형 등가 직경을 쉽게 측정할 수 있습니다. 측정을 수행하기 전에 0.02 미크론 주사기 필터를 통해 분석에 사용할 초순수의 부피를 여과하십시오.샘플을 여과된 물에 적절하게 희석하십시오. 이 60나노미터 금 콜로이드 분산 샘플의 경우 부피 측정으로 50배 희석합니다. NTA 기기, 주사기 펌프 및 컴퓨터를 연결하고 하드웨어와 소프트웨어를 켭니다.시스템에서 레이저 모듈을 제거하고 티슈와 압축 공기를 사용하여 유리 표면과 LVFC 내부 채널, 튜브 및 유체 포트를 완전히 건조시킵니다. LVFC를 레이저 모듈에 놓고 대각선으로 조이는 4개의 나사로 고정합니다. 콘센트 튜브를 셀 오른쪽의 포트에 연결합니다.주입구 튜브를 폐기물 병에 삽입하고 배압이 허용하는 한 빨리 900마이크로리터의 세척 용액을 세척합니다. Inlet 튜빙에 부착된 주사기를 1mL의 여과수가 들어 있는 새 주사기로 교체하고 Inlet 튜빙을 플로우 셀의 왼쪽 포트에 연결합니다. 그런 다음 약 500마이크로리터의 유체를 시료 챔버에 천천히 주입하고 로딩 중에 기포가 유입되지 않도록 주의합니다.레이저 모듈을 로드하려면 물이 채워진 LVFC를 기기에 삽입하고 셀을 제자리에 잠급니다. 주사기와 주사기 펌프 크래들을 고정하고 소프트웨어 인터페이스에서 카메라 시작을 클릭하여 카메라를 초기화합니다. 하드웨어 탭에서 Scatter를 클릭하여 참조 위치를 이동하고 카메라 레벨을 16으로 설정합니다.초점을 수동으로 조정하여 희석제에 입자가 있는지 확인하고, 메인 보기 창에서 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 드래그하여 시야 위치를 조정하여 입자가 있는지 확인합니다. 시스템을 청소하려면 주사기를 공기로만 가득 찬 주사기로 교체하고 챔버의 물을 공기로 천천히 교체하십시오. 기기에서 레이저 모듈의 셀을 제거하고 튜브 조각을 분리합니다.레이저 모듈의 광학 유리와 LVFC의 유리 표면을 물로 청소하고 티슈와 압축 공기로 건조시킵니다. LVFC와 레이저 모듈을 재조립하고 튜브를 프라이밍한 후 60나노미터 금 나노입자 현탁액 1밀리리터가 들어 있는 주사기를 하단 포트에 연결하고 750마이크로리터의 샘플을 LVFC 챔버에 천천히 주입합니다. 레이저 모듈을 로드하고 카메라를 초기화한 후 Scatter(산란)를 클릭하여 참조 초점을 위치로 이동하고 초점이 올바르게 설정되어 입자의 선명한 이미지를 제공하는지 확인합니다.레이저 빔 위치를 기준으로 시야각이 중앙으로 설정되어 있는지 확인하고 자동 설정 기능을 실행하여 초점과 카메라 레벨을 자동으로 최적화하여 최적의 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 샘플을 분석하려면 표준 측정 표준 작동 절차 탭을 열고 느리고 일정한 흐름에서 5개의 60초 비디오를 획득하도록 기기를 설정합니다. 그런 다음 데이터의 파일 이름과 위치를 설정하고 실행을 시작합니다.데이터를 분석하려면 Detection Threshold(감지 임계값) 탭에서 슬라이드 바를 드래그하여 가능한 한 많은 가시적 입자가 감지되고 추적되도록 감지 임계값을 설정합니다. 소음을 나타내는 파란색 십자가가 5개 이상 관찰되지 않는지 확인하십시오. 입자 추적 분석 비디오를 자동으로 처리하려면 설정, 확인을 클릭하고 모든 처리 매개변수를 자동 설정으로 둡니다.데이터 처리가 완료되면 데이터를 CSV 양식 결과 파일로 내보냅니다. 여기에서는 다양한 나노입자 추적 분석 장비 구성을 사용하여 얻은 1차 실험실 간 비교 결과를 보여줍니다. 6번 실험실을 제외하고, 여러 실험실에서 예상보다 높은 모드 크기를 기록했음에도 불구하고 5번의 캡처 반복 간의 반복성은 양호했습니다.3차의 나노 입자 추적 분석 결과 정확도는 모든 실험실에서 62.02 플러스 또는 마이너스 1.97 나노미터의 평균 모드로 동일한 표준 운영 절차 및 기기 설정을 구현한 모든 실험실에 의해 개선되었습니다. 입자의 평균 직경은 입자 크기, 형태 및 종횡비를 검증하기 위해 NTA에 대한 보완 기술로 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 계산할 수 있습니다. 이 분석에서 입자는 평균 종횡비가 1.1인 대부분 구형으로 나타납니다.사용 전에 저용량 플로우 셀(flow cell)을 잘 세척하고, 시료를 적절하게 희석하고, 충분히 로드하고, 집중시키고, SOP를 준수하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 방법은 엑소좀 및 바이러스를 포함한 다른 모든 나노 입자 특성 분석에 사용하여 안정성 연구 및 품질 관리 프로세스를 지원할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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