Name: 3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 NICO-1 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 방법을. 이 기법은 종양 미세환경 재구성 및 혈관형성 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 일본 문부 과학문화부의 과학 연구 C 보조금(K.N.에 대한 보조금 번호 19K09834)의 지원을 받았습니다.

모든 절차는 인간 복지 윤리위원회가 승인 한 의정서에 따라 수행되었습니다. 모든 환자는 샘플의 연구 사용에 대한 서면 동의서를 제출했으며,이 연구를위한 조직의 수집 및 사용은 테이 쿄 대학의 인간 게놈, 유전자 분석 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 레벨 2 생물안전 캐비닛에서 난소암 및 복수 환자의 난소암 줄기세포(OCSC) 분리 및 배양
<ol><li>천자를 통해 얻은 인간 난소 암 복수에서 암 줄기 세포를 분리합니다. 충분한 수의 암 줄기 세포를 채취하기 위해 환자로부터 최소 100-250mL의 복수를 수집하십시오. 추가적으로, 암 줄기 세포 마커 (즉, EpCAM, 칼레티닌, CD133, CD44, CD45, ALDH1, 및 Oct4) 및 난소암 마커 (pAX-8, WT-1)의 발현 프로필을 유세포분석에 의해 평가한다.<ol><li>복수 흡인 후 24시간 이내에 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 인간 난소암 복수를 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 제거하고 OCSC 배지 2mL와 30% 히스토덴츠/인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 용액 8mL를 추가합니다.</li>
		<li>OCSC 배지 준비: 스템프로 hESC 보충제, L-글루타민(글루타맥스 배지), 25% BSA, 100μM 2-메르캅토에탄올, 8ng/mL FGF 염기성, 10μM 인슐린 및 20μM Y-27632가 포함된 DMEM⁄F-12.</li>
		<li>15mL 튜브의 1.1.2단계의 세포 용액에 2mL의 OCSC 배지를 조심스럽게 오버레이하고 제동 없이 스윙 버킷 로터에서 실온에서 20분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>OCSC 층(간기에서 방해받지 않음)을 전사 피펫으로 새 15mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.</li>
		<li>PBS로 최대 15mL까지 채웁니다. 실온에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 상청액을 제거한다.</li>
		<li>세포 펠릿을 OCSC 배지에 재현탁하고 초저 부착 배양 접시에 시드합니다. 배양물은 5%CO2에서 37°C에서 유지되어야 한다.</li>
		<li>3 일마다 매체를 교체하십시오. 배양 접시를 약 1 분 동안 조심스럽게 서서 상청액의 일부를 버리고 새로운 배지를 첨가하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>CSC의 통과<ol><li>15mL 튜브에 OCSC를 수집하고 실온에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 제거하고, PBS로 채우고, 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.</li>
		<li>상청액을 제거하고, 단백질 분해 및 콜라겐분해 효소(예: AccuMax)로 구성된 세포 분리 용액 1mL를 추가하고, 37°C에서 10분 동안 배양한다.</li>
		<li>피펫팅으로 잘 혼합하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포가 단일 현탁액에 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>피펫팅으로 잘 혼합하고 PBS로 채우고 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 제거하고 세포 펠렛을 OCSC 배지에 재현탁시켜 초저 부착 배양 접시에 후속 시딩하고 5%CO2에서 37°C에서 유지한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HUEhT-1 내피 세포 배양
<ol><li>HUEhT-1 세포의 통과<ol><li>HUEhT-1 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한다.</li>
		<li>0.025% 트립신 1mL를 넣고 실온에서 3분간 배양합니다.</li>
		<li>내피 세포 성장 배지 2 5mL를 추가하고 15mL 튜브에 세포를 모은 다음 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 HUEhT-1 배지에 재현탁하고, 콜라겐이 코팅된 배양 접시에 세포를 시드한 다음, 5%CO2에서 37°C에서 유지하였다.</li>
		<li>3 일마다 매체를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. HUEhT-1 세포를 이용한 튜브 형성 분석을 위한 NICO-1 공동배양 플레이트의 제조
<ol><li>NICO-1을 조립하고 세포외 기질계 하이드로겔(Matrigel Matrix)로 코팅한다.<ol><li>제조업체의 지침에 따라 NICO-1의 한쪽을 조립하고 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>NICO-1의 표면을 300 μL의 차가운 PBS로 덮은 다음 완충액을 제거합니다.</li>
		<li>냉각된 세포외 기질 기반 하이드로겔 300μL를 추가하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.</li>
		<li>평형을 이루려면 필터를 100% 에탄올에 담근 다음 13mm ICCP 필터(0.6μm)를 PBS로 1분 동안 세척합니다.</li>
		<li>본체 부품 A(오른쪽 챔버) 및 B(왼쪽 챔버)를 포함한 NICO-1을 O 링 및 평형 필터와 함께 조립합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. HUEhT-1 세포 및 CSC를 NICO-1 시스템에 파종
<ol><li>세포 단층을 트립신화하고 세포를 2% 우태아 송아지 혈청으로 내피 세포 성장 배지에 재현탁하여 HUEhT-1 세포 현탁액을 준비합니다.</li>
	<li>1.2 mL의 세포 현탁액(1.5 x 105 세포)을 각 세포외 기질 기반 하이드로겔 코팅 웰에 추가합니다.</li>
	<li>5일 동안 배양한 OCSC 1.5mL를 다른 웰에 추가합니다.</li>
	<li>NICO-1을 5%CO2 중 37°C에서 인큐베이션하고; 튜브 형성은 가지의 수를 통해 측정 된 세포 외 기질 기반 하이드로 겔에서 현미경 및 네트워크 형성으로 관찰 할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%2C+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+fate+in+cancer+growth%2C+progression+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+selfrenewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>Ohata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+stem-like+cell+regulator+CD44+by+Rho+kinase+inhibition+contributes+to+the+maintenance+of+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+in+vitro+model+of+ovarian+cancer+stem-like+cells+with+an+enhanced+proliferative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity.</a> Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Zong, X., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+role+in+metastasis+and+opportunity+for+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).</li>
<li>Lizárraga-Verdugo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+its+role+in+angiogenesis+and+vasculogenic+mimicry+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers.</a> Frontiers in oncology. 10, 413(2020).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell-mediated+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation.</a> Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li>
<li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell%2Fmesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li>
<li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration%2C+proliferation%2C+and+collagen+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+%26+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li>
<li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li>
<li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+targets+the+tumour+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A%3A+a+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li>
</ol>

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제시된 프로토콜은 시험관 내 설정에서 OCSC의 종양 미세 환경을 모방하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 주요 구성 요소는 간접 Transwell 공동 배양 시스템인 NICO-1 시스템을 사용하여 얻은 재현성이 높은 공동 배양 모델을 구성합니다. 현재 이용 가능한 많은 공동 배양 모델은 공동 배양 된 세포 집단 12,13,14,15,16,17,18에 대한 직접적인 세포-세포 접촉의 효과를 조사합니다. 공동배양의 효과를 조사하는데 사용될 수 있는 가장 간단한 모델은 2개의 세포 유형의 직접 혼합에 의해 재현될 수 있고,...

난소암은 전 세계적으로 여성에게 8번째로 흔한 악성 종양으로, 매년 약 300,000건의 새로운 진단과 약 180,000명의 사망이발생합니다1. 초기 진단에서 난소 암은 종종 심각한 증상을 나타내며 환자의 약 75 %가 이미 III-IV 기에 있습니다. 이에 따라 부인암2 중 5년 생존율이 <30%, 사망률이 가장 높으며, 난소암의 치료 효율은 용적폐 수술의 성공적 성취, 항암에 대한 내성, 초기 치료 후 재발 등의 임상적 요인에 크게 의존한다.
난소암 조직은 계층적으로 구성되어 있으며 모든 종양 구성 요소가 동등하게 자손을 생성할 수 있는 것은 아닙니다. 자가 재생하고 이질적인 종양 세포 집단을 생성할 수 있는 유일한 세포는 암 줄기 세포(CSC)를 나타내는 것으로 간주됩니다3. CSC 자가 재생 및 종양 개시는 지지적 틈새를 유지하기 위한 목적으로 종양 미세환경을 리모델링하기 위한 혈관신생의 촉진을 동반한다. 그러나 이전 모델은 다중 계대 배양 후 스페로이드의 파괴로 인해 임상 샘플에서 파생된 CSC 배양의 재현성이 제한적이기 때문에 시험관 내 분석에 활용할 수 없었습니다. 보다 최근에, 환자로부터 CSC를 배양하기 위한 실험적 방법이여러 응용 4,5,6,7을 위해 개발되었다. 특히, 배양된 줄기세포는 무혈청 배지로 초저 부착판에서 스페로이드를 형성하여 성장하는 CSC의 특성을 이용함으로써, 다계통 분화 가능성이 있는 정상 종양세포에서는 발현되지 않는 줄기세포 표면 마커를 발현하도록 유도한다(8,9).
최근 데이터에 따르면 복막에서 전파로 시각화 된 휴면 난소 (O) CSC의 지속성은 재발 성 종양10으로 재생되는 것과 관련이 있습니다. 따라서 OCSC의 분자 및 생물학적 특징을 이해하면 이러한 세포를 효과적으로 표적화하고 박멸하여 잠재적인 종양 완화를 초래할 수 있습니다. 특히, 혈관신생11에서 CSCs 역할의 세포 및 분자 기계론적 특징에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 따라서, 본 프로토콜에서는 임상 환경에서 전이 부위에서 CSC 및 내피 세포의 종양 미세 환경을 모방 할 수있는 공동 배양 모델을 사용하여 내피 세포의 혈관 신생 특성을 조사하기 위해 시험관 내 설정에서 환자 유래 OCSC를 사용했습니다. 궁극적으로 신생혈관형성은 종양 성장과 전이를 지원하는 데 필요한 중요한 과정을 구성하기 때문에 그 메커니즘을 더 잘 이해하면 전이 부위에서 OCSC에 대한 새로운 표적 요법을 개발할 수 있습니다.
여기에서는 CSC를 둘러싼 신생혈관화 단계를 시간 경과 방식으로 시각화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 장점은 3D 공동 배양 시스템인 NICO-1을 사용하여 완전히 재현 가능한 조사를 허용하여 내피 세포 혈관신생 동안 OCSC 유래 종양 개시 능력이 환자에 미치는 영향을 관찰할 수 있다는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.025% 트립신&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet</td><td>Thermo</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>1250 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>QSP</td><td>T112XLRS-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Nunc</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 피펫 팁</td><td>QSP</td><td>T110RS-NEW</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Thermo</td><td>170366N</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>AccuMAX</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>BioCoatTM Collagen I 60mm Dish</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>KUBOTA</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium 2&nbsp;</td><td>프로모셀</td><td>C-22011&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>WAKO</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>SIGMA</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>HUEhT-1 cell</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB1458</td><td></td></tr><tr><td>ICCP Filter 0.6 &micro; m</td><td>긴레이 연구실</td><td>2525-06</td><td></td></tr><tr><td>인슐린, 인간</td><td>SIGMA (Roche)</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO MX-flad</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Yokogawa</td><td>CQ-1</td><td></td></tr><tr><td>NICO-1</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2501-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPlate-96</td><td>PerkinElmer</td><td>6005290</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td>전송 Pipet</td><td>FALCON</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>와코</td><td>253-00513</td><td></td></tr></tbody></table>

3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 nico-1

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

암 줄기 세포 (CSC)는지지 틈새 시장에 상주하여 인접한 기질 세포, 혈관 및 세포 외 기질로 구성된 미세 환경을 구성합니다. 내피 발달에 참여하는 CSC의 능력은 종양 발생 및 종양 전이의 메커니즘에 대한 일반적인 이해에 직접적으로 기여하는 중요한 특성을 구성합니다. 이 연구의 목적은 난소암 줄기세포(OCSC)의 종양 개시 능력을 조사하기 위한 재현 가능한 방법론을 확립하는 것입니다. 본 발명에서는 시험관 내 공동 배양 모델 NICO-1을 사용하여 내피 세포와 OCSC 사이의 신생혈관형성 메커니즘과 내피 세포의 형태학적 변화를 조사했습니다. 이 프로토콜은 OCSC를 둘러싼 신생 혈관 단계를 시간 경과 방식으로 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 종양 전이에서 OCSC의 혈관 신생 특성에 관한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

스페로이드에 대한 장기간 안정적인 배양을 수행하기 위해 수술 또는 천자 중 진행성 난소암 환자로부터 얻은 복수액을 수집했습니다. 여기에서는 CSC1 및 CSC2라고 하는 난소 CSC의 장기 스페로이드 배양 사례를 제시합니다. 두 세포주 모두 동일한 진단 및 조직 학적 프로파일을 가지고 있습니다. OCSC를 둘러싼 내피 세포의 신생 혈관을 유도하는 데 필요한 내피 세포와의 상호 작용의 기초가되는 OCSC의 기계 론적 역할은 아직 알려지지 않았습니다. 따라서 우리는 전이 부위에서 CSC 혈관 틈새 발달 과정을 명확히하는 것을 목표로했습니다. 우리는 시험관 내 공동 배양 모델 NICO-1을 사용하여 내피 세포 (HUEhT-1)와 OCSC 간의 상호 작용을 조사했습니다. 도 1은 CSC1 및 CSC2에 의해 유도된 튜브 형성 활성의 비교를 나타낸다. 형성된 혈관 튜브의 수는 CSC2와의 공동 배양에서 시간이 지남에 따라 극적...

난소암 줄기세포(OCSC)는 암 시작, 재발, 치료 내성 및 전이를 담당합니다. OCSC 혈관 틈새는 OCSC의 자가 재생을 촉진하여 화학 내성을 유발하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 재현 가능한 OCSC 혈관 틈새 모델을 구축하기 위한 기초를 제공합니다.

3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

난소암은 부인과 악성 종양 환자 중 사망률이 높습니다. 난소암 줄기세포와 그 혈관 틈새는 종양 미세환경을 리모델링할 수 있습니다. 그러나 이전의 난소암 줄기세포 모델은 재현성이 제한되어 있어 상세 분석이 불가능했습니다.당사 프로토콜의 장점은 3D 공동 배양 시스템의 재현성을 포함하며, 이는 혈관 신생 중 환자에서 난소암 줄기 세포 유래 종양 시작 능력의 영향에 대한 연구를 용이하게 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 연구원인 Yuko Miyagawa가 맡을 것입니다. 천자를 통해 얻은 인간 난소암 복수에서 암 줄기세포를 분리하기 위해 100-250ml의 환자 복수를 수집하고 획득 후 24시간 이내에 샘플을 원심분리합니다.펠릿을 2mL의 OCSC 배지에 재현탁시키고 PBS에 8ml의 30% 비이온 밀도 구배 배지를 각 샘플에 추가합니다. 세포 현탁액을 개별 15mL 튜브로 옮기고 각 튜브의 세포 용액에 2ml의 추가 OCSC 배지를 조심스럽게 층을 이룹니다. 밀도 구배 원심분리로 세포를 분리하고 계면에서 OCSC를 새로운 15ml 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.수집된 세포를 전체 부피의 PBS로 세척하고 펠릿을 새로운 OCSC 배지에 재현탁합니다. 세포를 초저 부착성 배양 접시에 파종하고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 5일간의 배양 후 원심분리를 통해 플레이트당 15ml 튜브 1개에 세포를 수집합니다.PBS에서 두 번째 원심분리 후, 1ml의 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 세포 분리 용액에 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 재현탁합니다. 배양이 끝나면 피펫팅으로 잘 혼합하고 세포를 37로 되돌려 5분 더 보냅니다. 배양이 끝나면 피펫팅으로 세포를 다시 혼합하고 원심분리로 세척하기 위해 튜브에 PBS를 채웁니다.그런 다음 펠릿을 OCSC 배지에 재현탁시키고 새로운 초저 부착 배양 접시에 세포를 파종합니다. HUEhT-1 내피 세포 배양을 설정하려면 PBS로 HUEhT-1 세포를 세척하고 실온에서 3분 동안 0.025% 트립신으로 세포를 처리합니다. 세포가 분리되면 5ml의 내피 세포 성장 배지 2로 반응을 중지하고 원심분리를 위해 15ml 튜브에 세포를 수집합니다.그런 다음 펠릿을 HUEhT-1 배지에 1.5 x 10에서 5 농도로 재현탁시키고 콜라겐이 코팅된 배양 접시에 세포를 시딩합니다. 튜브 형성 분석을 위한 대화형 공동 배양 플레이트를 설정하려면 제조업체의 지침에 따라 NICO-1 장치를 조립하고 시스템을 얼음 위에 놓습니다. 300마이크로리터의 차가운 PBS로 어셈블리를 세척한 후 300마이크로리터의 냉각 세포외 기질 기반 하이드로겔을 장치에 추가하여 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다.배양이 끝나면 멸균 13mm 필터를 100% 에탄올에 담근 다음 PBS에 1분 동안 담급니다. 배양이 끝나면 O-링과 평형 필터를 어셈블리 본체의 적절한 챔버에 놓습니다. 장치가 조립되면 HUEhT-1 세포를 1.25 x 10에서 2%태아 송아지 혈청 농도가 보충된 내피 세포 성장 배지의 밀리리터당 5번째 세포에 재현탁시키고 잘 코팅된 각 세포외 기질 기반 하이드로겔에 1.2ml의 세포를 추가합니다.그런 다음 5일 배양 OCSC 1.5ml를 웰 하나에 넣고 NICO-1 시스템을 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 튜브 형성은 광학 현미경으로 관찰할 수 있으며 세포 외 기질 기반 하이드로겔의 형성 세포 네트워크는 시간이 지남에 따라 공동 배양 내에서 형성되는 분기의 수를 정량화하여 측정할 수 있습니다. 여기서, 두 개의 서로 다른 CSC에 의해 유도된 튜브 형성 활성의 비교를 관찰할 수 있습니다.이 분석에서 형성된 혈관의 수는 두 번째 CSC 집단과의 공동 배양 기간 동안 시간이 지남에 따라 극적으로 증가했습니다. 이 이미지에서 CSC2 공동 배양 없이 혈관 내피 성장 인자 치료 후 HUEhT-1의 혈관신생 특성을 양성 대조군으로 관찰할 수 있습니다. NICO-1 시스템을 사용한 이 OSCS 내피 세포 공동 배양 모델에서 HUEhT-1 세포를 CSC2와 20시간 동안 공동 배양했습니다.타임랩스 비디오 이미징을 통해 관찰된 바와 같이, HUEhT-1 세포는 20시간의 CSC 공동 배양 과정에서 혈관을 형성했습니다. 최근의 발견으로 상동 재조합 복구에 결함이 있는 난소암에 대한 PARP 억제제와 항혈관신생 베바시주맙(bevacizumab)의 임상적 사용이 이루어졌습니다. 3D 공동 배양 시스템을 사용하는 당사의 프로토콜은 종양 전이에서 난소암 줄기세포의 혈관신생 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

그들의 입체적인 맥락에서 정상 세포의 문화 세포 변형 및 tumorigenesis에 필요한 초기 이벤트를 연구하는 다른 방법을 나타냅니다. 이 방법은 난소암 형성 초기에 이벤트를 연구 정상 난소와 oviductal 세포를 성장하는 데 사용됩니다.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

시험관 분야 분석법은 암 줄기세포를 식별하는 데 일반적으로 사용됩니다. 여기에서는 단일 분석과 다중 세포 기반 구체 분석을 비교합니다. 더 힘든 단일 세포 기반 분석 또는 메틸셀룰로오스 보충제는 더 정확한 결과를 제공하는 반면, 액체 배지에서 수행되는 다중 세포 기반 분석은 세포 밀도의 영향을 크게 받을 수 있습니다.

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

종양 개시 세포(TIC)는 재발성이 높고 치명적인 질병인 난소암 치료를 위한 실행 가능한 치료 표적이 될 수 있습니다. 우리는 이 고도의 종양 형성 세포 집단을 풍부하게 하는 배양 조건에 대한 프로토콜을 제시합니다.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

여기에서는 난소암 세포의 부착, 침습 및 증식을 조사하기 위한 도구로서 일차 인간 중피 세포와 세포외 기질로 층을 이룬 섬유아세포로 구성된 복막강 내막의 3차원 체외 모델을 구성하는 프로토콜을 제시합니다.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

골수 혈관 틈새의 시험관 내 모델은 중간엽 및 내피 세포를 프리캐스트 3D PEG 하이드로겔에 파종하여 설정됩니다. 틈새의 내피 네트워크, ECM 성분 및 ALP 활성은 사용된 성장 인자에 따라 다릅니다. 이 플랫폼은 진행된 암 모델에 사용할 수 있습니다.

이미징 마이크로플레이트에서 프리캐스트 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 하이드로겔을 사용하여 혈관화된 골수 틈새의 간단한 설정

우리는 기질이 풍부한 난소 분획에서 마우스 난소 체세포를 분리하고, 스캐폴드 없는 접근법을 사용하여 마우스 난소 체세포 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

난소 미세환경 탐구: 마우스 난소 체세포의 분리, 2D 배양 및 오가노이드 배양 방법

배우세요 3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 방법을. 이 기법은 종양 미세환경 재구성 및 혈관형성 연구에 활용됩니다.

3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 NICO-1

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