마우스 뇌의 수평 해마 조각

이 프로토콜은 다양한 과학 응용 분야에서 사용하기 위해 수평 해마 뇌 절편을 쉽게 준비할 수 있습니다. 이 기술은 반구의 단일 슬라이스 내에서 모든 해마 섬유 경로의 무결성을 보존합니다. 이 슬라이스 프로토콜은 치상회(dentate gyrus)에서 발생하고 나타나는 뇌 병리학에서 발생하는 신경학적 변화를 평가하는 데 이상적으로 적합합니다.

이 프로토콜의 가장 중요한 측면은 가능한 한 빠른 실행과 뇌 조직의 부드러운 처리의 균형을 찾는 것입니다. ACSF 1리터를 준비하려면 적절한 양의 황산마그네슘과 염화칼슘을 천천히 떨어뜨리기 전에 자기 교반 막대로 계속 저어주면서 물 800ml에 표시된 대로 모든 고체 화학 물질을 천천히 혼합합니다. 그런 다음 증기압 삼투압계를 사용하여 305에서 315밀리오스몰 사이의 삼투압을 검증하고 실온에서 탄소로 ACSF 용액을 지속적으로 버블링하여 pH를 7.3에서 7.4 사이로 설정합니다.

250 밀리리터의 고 자당 슬라이스 용액을 준비하려면 표에 표시된대로 25 밀리리터의 미리 슬라이스 된 용액에 화합물을 추가하고 삼투압이 320에서 325 밀리오스몰 사이인지 확인하십시오. 그런 다음 고자당 슬라이스 용액을 탄소로 10-15분 동안 거품을 일으켜 pH를 7.3 및 7.4 사이로 설정하고 고자당 슬라이스 용액을 섭씨 영하 80도에서 부분적으로 얼 때까지 20-30분 동안 보관합니다. 해부를 위한 작업 공간을 준비하려면 회수 챔버에 발암성 ACSF 용액을 채우고 챔버를 섭씨 32도의 수조에 놓습니다.

비브라톰을 적절한 절단 프로그램으로 설정하고 홀더에 얼음을 채우고 비브라톰에 장착하고 비브라톰 암에 블레이드를 부착합니다. 주걱을 사용하여 이질적인 슬러시가 얻어질 때까지 부분적으로 동결된 고자당 슬라이스 용액을 으깨고 섞습니다. 그런 다음 용액에 탄수화물을 거품을 일으키고 용액을 사용하여 식힌 90mm 배양 접시 위에 여과지 조각을 수화시키고 얼음 위에 35mm 배양 접시를 채웁니다.

뇌를 적출하려면 해부 가위를 사용하여 2주에서 6주 된 수컷 쥐의 두피를 자르고 시상 봉합선을 따라 갈바리아를 엽니다. 구부러진 집게를 사용하여 후각구를 포함한 뇌 전체가 보일 때까지 두개골을 제거하고 주걱을 사용하여 손상되지 않은 뇌 조직을 조심스럽게 퍼냅니다. 35mm 배양 접시에 뇌를 넣고 고자당 슬라이스 용액으로 채워진 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직에서 머리카락이나 혈액 입자를 부드럽게 제거합니다.

주걱을 사용하여 청소한 뇌를 물에 적신 여과지 조각에 옮기고 칼날을 사용하여 뇌를 세로로 반으로 자릅니다. 갓 자른 내측에 양쪽 반구를 놓고 칼날을 사용하여 각 반구의 등쪽 상단을 평행하게 잘라 각 뇌 부분의 등쪽 영역을 제거합니다. 뇌의 복부 부분이 위를 향하도록 갓 자른 등쪽에 양쪽 반구를 놓고 표본 플레이트에 슈퍼 접착제 한 방울을 놓습니다.

피펫 팁을 사용하여 두 조직 조각을 모두 수용할 수 있도록 접착제를 넓은 영역에 펴고 여과지 스트랩 조각을 한쪽 반구의 복부 쪽에 만집니다. 다른 여과지 스트랩을 사용하여 뇌의 등쪽을 조심스럽게 반건조시키고 반구의 등쪽을 표본 플레이트의 접착제 위에 아래로 놓습니다. 두 개의 추가 여과지 스트랩을 사용하여 방금 시연한 대로 두 번째 반구를 접착제에 배치하고 표본 플레이트를 슬라이싱 챔버에 놓습니다.

그런 다음 빠르지만 조심스럽게 접시를 얼음처럼 차가운 고자당 슬라이스 솔루션 슬러시로 덮습니다. 뇌 조직의 일부를 얻으려면 비브라톰 블레이드를 반구의 내측 앞에 놓고 비브라톰 테이블을 들어 올려 블레이드가 현재 위를 향하고 있는 반구의 복부 쪽과 같은 높이에 있도록 합니다. vibratome 컨트롤을 사용하여 블레이드를 등 방향으로 600미크론 더 낮추고 처음 두 조각이 두 반구에서 완전히 분리될 때까지 조직을 자릅니다.

처음 두 개의 조직 절편을 얻었을 때 절단 방향을 반대로 하고 날을 300미크론 더 낮추고 다시 자릅니다. 해마가 보이면 넓어진 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 조각을 모아 수조의 회수 챔버로 옮깁니다. ACSF가 채워진 회수 챔버에 슬라이스를 1시간 동안 그대로 둔 다음 조직 샘플의 전기생리학적 기록을 수행하기 전에 회수 챔버를 실온에 30분 동안 둡니다.

여기서, 저품질 슬라이스와 고품질 슬라이스에서 각각 대표적인 음의 장과 양의 흥분성 시냅스 후 전위 기록을 관찰할 수 있습니다. 네거티브 예시 트레이스는 자극된 뉴런 파이버의 탈분극 시 실제 fEPSP 진폭보다 훨씬 높은 큰 파이버 발리 진폭을 나타내는 반면, 고품질 트레이스는 작은 파이버 발리 대 fEPSP 비율과 높은 fEPSP 진폭을 보여줍니다. 뇌 절편의 생존 가능성은 섬유 발리 진폭에 대한 필드 흥분성 시냅스 후 전위 기울기를 플로팅하여 분석할 수도 있습니다.

슬라이스 품질을 결정하는 데 일반적으로 사용되는 입력/출력 곡선은 뇌 슬라이스에 증가하는 전류 자극을 적용하고 후속 fEPSP 반응을 모니터링하여 얻을 수 있습니다. 제대로 보존되지 않은 뇌 조직의 차선의 전도 특성으로 인해, 품질이 낮은 뇌 절편은 입력/출력 곡선이 감소된 것을 보여줍니다. 생존 가능한 뇌 절편은 안정적인 시냅스 전달 기준선을 가지고 있는 반면, 불안정한 기준선을 가진 뇌 절편은 뇌 회로의 시냅스 가소성을 연구하기 위한 추가 조절 프로토콜에 사용할 수 없습니다.

fEPSP 기준선 기록은 시냅스 전달 자체에 대한 약물 효과를 모니터링하는 데에도 유용할 수 있습니다. 또한 뇌 절편을 칼슘 지시약과 함께 사용하여 형광 이미징 기록을 획득하고 다양한 절편 조건 또는 치료에서 칼슘 유입을 연구할 수 있습니다. 희생 후 1.5분 이내에 뇌 해부가 수행되도록 하고 이는 여전히 뇌 조직이 냉각 및 산소 공급 없이 잠깐만 수행된다는 것을 보장합니다.

해마 뇌 절편은 분자 생물학 기술에서 전기 생리학에 이르기까지 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 절차는 해마의 해부학적 구조와 신경학적 과정에 대한 집중적인 조사를 용이하게 합니다.