나노 물질에 의해 획득 된 단백질과 대사 산물 코로나특성화를위한 모세관 전기 전구 질량 분광법 접근법

이 프로토콜은 단백질 코로나뿐만 아니라 나노 물질의 대사 산물 코로나의 특성화를 위해 CESI-MS를 구현한 최초의 프로토콜입니다. CESI는 기존 LCMS 방법과 직교 분리를 제공하여 몇 나노리터의 시료만 사용하면서 재현성과 감도가 매우 높습니다. 먼저 인간 혈장 2ml를 대사산물 및 단백질 코로나를 위한 분취액 1ml와 혈장 대사체 특성 분석을 위한 분취액으로 나눕니다.

인간 혈장에서 나노 물질 1밀리리터당 1밀리그램을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하면서 열 혼합기에서 분당 500회전으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음, 4 섭씨 온도에서 15 분 동안 4, 000 번 G로 원심 분리하여 나노 물질을 펠릿화합니다. 대사산물 코로나 분석을 위해 혈장 상등액을 수집하고 단백질 코로나 특성화를 위해 나노물질 단백질 코로나 복합체를 유지합니다.

펠릿을 10X PBS 완충액 1ml에 재현탁시키고 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 2분 동안 격렬하게 와류를 치십시오. nanomaterials를 펠릿으로 만들기 위하여 4개의 섭씨 온도에 15 분 동안 G 4개, 000 시간에 해결책을 분리기하고, 그 후에 펠릿을 교란하지 않고 상등액을 주의깊게 제거하십시오. 펠릿을 1 밀리리터의 ABC 완충액에 재현탁시키고 2 분 동안 격렬하게 소용돌이하여 결합되지 않은 단백질과 결합되지 않은 염을 제거합니다.

원심분리 단계를 반복하고 상층액을 버립니다. 단백질 이황화 결합을 줄이기 위해 10 밀리몰 디티오트레이톨을 함유한 20마이크로리터의 ABC 완충액에 펠릿을 용해시킵니다. 용액을 섭씨 56도에서 30분 동안 배양합니다.

0.1% 계면활성제를 함유한 20마이크로리터의 ABC 완충액에 2마이크로그램의 염기서열분석 등급 트립신을 첨가하고 소화액을 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다. 100 millimolar ABC에 20 μl의 55 millimolar iodoacetamide를 첨가하여 샘플을 알킬화하고 실온에서 20 분 동안 배양합니다. 20마이크로리터의 0.1몰 염산을 첨가하여 계면활성제를 절단하고 샘플을 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.

텍스트 원고에 설명된 대로 C18로 충전된 탈염 피펫 팁을 사용하여 펩타이드를 농축하고 탈염합니다. 그런 다음 샘플을 동결건조하고 분석할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 나노 물질 플라즈마 배양에서 대조군 플라즈마와 상등액을 가져 와서 얼음 위에 놓습니다.

각 샘플에서 50마이크로리터를 별도의 바이알에 분취하고 증류수로 10배 희석합니다. 볼텍싱 후 이 희석된 샘플 50마이크로리터를 새 바이알로 이동합니다. 클로로포름 200마이크로리터, 메탄올 250마이크로리터, 증류수 350마이크로리터를 넣고 2분 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.

20, 800 번 G에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리기. 상등액의 500 마이크로리터를 가지고 가고 10, 4 섭씨 온도에 G 2 시간 동안 3 kilodalton 원심 여과기를 통해서 거른다. 430마이크로리터의 울트라 여과액을 스피드 진공 청소기에서 건조시키고 샘플을 동결합니다.

CESI 기기에 모세관을 설치하기 전에 모세관의 입구와 출구 끝이 손상되지 않았는지, 모세관에 눈에 띄는 파손이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 제조업체 지침에 따라 새로운 중성 코드 모세관을 기기에 배치합니다. 분리 모세관을 100 millimolar hydrochloric acid로 정방향으로 세척한 다음 BGE로, 마지막으로 증류수로 세척하고 텍스트 원고에 설명된 조건을 사용하여

그런 다음 BGE로 분리 및 전도성 모세관을 모두 세척한 다음 증류수, 100밀리몰 염산, 증류수, 마지막으로 BGE로 세척합니다. 나노 스프레이 소스와 어댑터를 사용하여 CESI를 MS에 결합합니다. 단백질 코로나 분석을 위해 동결건조된 샘플을 pH 4에서 20마이크로리터의 50밀리몰 암모늄 아세테이트에 재현탁합니다.

텍스트 원고에 설명된 대로 샘플에 대한 CESI-MS 분석을 수행합니다. 상위 10개 데이터 종속 단편화 획득을 통해 250에서 2, 000m/z 사이의 질량 스펙트럼 데이터를 수집하고 샘플 사이의 모세관을 헹굽니다. 새로운 용융 실리카 모세관을 CESI 기기에 놓습니다.

100% 메탄올을 사용하여 분리 모세관을 순방향으로 세척한 다음 BGE로 분리 및 전도성 모세관을 모두 세척하여 출구 끝단에서 액적 형성을 보장합니다. 그런 다음 모세관을 증류수로 세척한 다음 0.1몰 수산화나트륨, 증류수, 마지막으로 BGE로 세척합니다. 나노 스프레이 소스와 어댑터를 사용하여 CESI를 SEMS에 결합합니다.

대사 산물 코로나 분석을 수행하려면 나노 물질에 노출된 혈장과 노출되지 않은 혈장 샘플을 430마이크로리터의 증류수에 재현탁하고 2분 동안 격렬하게 와류를 일으킵니다. 0.1 마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 샘플을 필터링합니다. 텍스트 원고에 언급된 바와 같이 5마이크로리터의 내부 표준을 95마이크로리터의 여과액과 와류에 격렬하게 추가합니다.

16, 100 곱 G 및 섭씨 4도에서 원심 분리기. 텍스트 원고에 설명된 대로 샘플에 대한 CESI-MS 분석을 수행합니다. 단백질체학 및 대사체 분리 및 검출에 CESI-MS를 사용하면 각 접근법에 대해 두 모세혈관에서 우수한 분리 창이 있음을 보여주어 생체 분자 코로나의 포괄적인 특성 분석을 가능하게 합니다.

단백질체학 CESI-MS 방법은 광범위한 나노 물질 조성에 걸쳐 코로나의 단백질 배열과 단백질 농도를 구별할 수 있으며 각 나노 물질에 대해 고유한 단백질 코로나를 구별할 수 있습니다. 이 CESI-MS 대사체학 접근법은 대사산물 코로나의 정량적 분석을 가능하게 하며, 코로나의 고유한 지문을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근 방식은 나노 물질 대사 산물 코로나를 수동적으로 특성화하지만, 이성질체의 차등 흡수와 같은 생체 분자 코로나에서 대사 산물의 역할에 대한 흥미로운 통찰력을 여전히 발견할 수 있습니다.

이 기술을 사용하면 단백질과 대사 산물 코로나를 모두 특성화할 수 있으므로 완전한 생체 분자 코로나가 세포의 나노 물질 흡수에 미치는 영향에 대한 이해를 높일 수 있습니다.