뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

여기에 설명된 프로토콜은 신경 변성의 발병기전에서 희소돌기아교 결함에 대한 향후 연구를 촉진할 것으로 예상됩니다. 이는 단 3-4주 만에 기능적 인간 희소돌기아교세포 계통 세포를 생성하고, 뉴런 희소돌기아교구 연결을 모델링하기 위한 공동 배양 시스템을 구축하는 데 사용할 수 있는 개선된 방법입니다. 이 프로토콜은 알츠하이머병뿐만 아니라 뉴런 희소돌기아교세포 상호 작용의 다른 질병 관련 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

먼저 각 T75 플라스크에 약 100만 개의 HEK293T 세포를 플레이트화하여 40%의 포화도를 달성한 다음, 테트라사이클린 유도성 NGN2 및 퓨로마이신 내성 테트라사이클린 트랜스액tivator 유전자를 발현하는 플라스미드와 3개의 도우미 플라스미드로 형질주입합니다. 형질주입을 위해 PEI를 사용합니다. 16시간 후에 미디어를 교체하십시오.

Harvest는 매일 배양 배지를 수집하고 3일 동안 새로운 배지로 교체하여 바이러스 입자를 방출했습니다. 정제를 위해 수집된 매체를 풀링한 다음 0.22 마이크로미터 필터를 통해 바이러스를 필터링하고 90분 동안 49, 000회 G로 원심분리합니다. 원심분리 후 펠릿을 적절한 부피의 PBS 포도당에 다시 현탁시킵니다.

시판되는 H1 인간 ES 세포를 사용하여 뉴런 유도를 수행합니다. ESL 유지 배지로 코팅된 6-well 플레이트로 코팅된 세포외 매트릭스 용액에서 세포를 배양하고 섭씨 37도에서 플레이트를 5% 이산화탄소로 배양합니다. 분화 유도 2일 전에 세포 박리 용액 1ml를 첨가하여 ES 세포를 분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

세포를 튜브로 옮긴 다음 2ml의 배지로 웰을 세척하고 동일한 튜브에 추가합니다. 세포를 300배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 배지에 다시 현탁시키고 세포를 웰당 5번째 세포에 1 곱하기 10의 좌석 밀도로 매트릭스로 코팅된 6-웰 플레이트에 플레이트합니다.

다음 날, 렌티바이러스를 첨가하여 NGN2와 퓨로를 발현합니다. R, 및 테트라사이클린 트랜스액티베이터와 폴리브레렌을 함께 사용하여 새로운 ES 세포 유지 배지를 제공합니다. 0일차에 모르포겐이 없는 N2가 보충된 DMEM/F-12 배지에 밀리리터 독시사이클린당 2마이크로그램을 추가합니다.

첫날에는 신선한 DMEM/F-12에 함유된 퓨로마이신과 N2 및 독시사이클린을 최종 농도인 밀리리터당 1마이크로그램에 첨가합니다. 최소 24시간 동안 puromycin에서 형질도입된 세포를 선택합니다. 2일차에는 세포 분리 용액으로 분화 뉴런을 분리하고 매트릭스 용액으로 코팅된 24웰 플레이트에 다시 플레이팅합니다.

독시사이클린이 없는 MBA B27 배지로 유지하십시오. 플레이트에서 순수 유도 뉴런을 배양하고 세포 외 기질 기반 솔루션으로 코팅합니다. 신경 전구 세포 생성을 수행하려면 H1 인간 ES 세포를 배양하고 텍스트 원고에 설명된 대로 신경 전구 세포로 형분화합니다.

네거티브 1일째에 ES 세포 유지 배지에 있는 0.5-100만 개의 세포를 성장 인자 감소 매트릭스 용액으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 시딩합니다. 0일차에는 2%DMSO가 보충된 ES 세포 유지 배지로 24시간 동안 세포를 처리합니다. 1일차부터 6일차까지 시판되는 키트의 일부 추가 억제제가 포함된 따뜻한 신경 유도 배지로 전체 배지를 변경합니다.

7일째에 세포 분리 용액을 사용하여 NPC를 계대하고 24웰 플레이트의 웰당 5번째 셀에 1-2배의 좌석 밀도로 플레이팅합니다. 면역조직화학적 염색을 통한 만능 마커의 부재 및 NPC 마커의 존재에 대한 차별화 효율을 분석합니다. 희소돌기아교세포 전구세포를 생성하려면, 상업용 키트의 일부 추가 억제제를 사용하여 따뜻한 신경 유도 배지에 NPC를 플레이트

8일째에 OPC 분화 배지에서 1%DMSO 용액을 준비하고 도금된 NPC를 24시간 동안 처리합니다. 9일째에 배지를 DMSO가 없는 새로운 OPC 분화 배지로 교체한 다음 15일까지 격일로 세포를 공급합니다. 세포가 15일 이전에 합류점에 도달하면, 웰당 5번째 세포에 1-2배 10의 좌석 밀도로 통과시킵니다.

14일째에 OPC 분화 배지의 플레이트 OPC를 24웰 플레이트에서 웰당 10개에서 5번째 셀의 1-2배 밀도로 만듭니다. IHC 염색 또는 qPCR에 의한 OPC 특이적 마커의 존재 여부와 NPC 마커의 부재에 대한 테스트 셀. 15일째에 배지를 OL 성숙 배지로 교체합니다.

격일로 또는 매일 매체를 변경합니다. 세포가 90% confluence에 도달하면 최대 2개의 계대 동안 또는 세포 분열이 상당히 느려질 때까지 1-3개의 비율로 분할합니다. OPC가 너무 빨리 분열하여 3일 이내에 합류점에 도달하는 경우 1-3일 동안 2-5마이크로몰 농도로 Ara-C를 첨가합니다.

14일째에 OPC 분화 배지의 24웰 플레이트에서 웰당 5번째 셀에 1 곱하기 10의 밀도로 IOPC를 플레이트화합니다. 다음 날, 세포 분리 용액으로 유도된 인간 뉴런을 분리하십시오. 배양된 OPC에 뉴런을 추가하고, 웰당 5번째 세포에 10의 2배의 시트 밀도로 도금합니다.

neurobasal A 배지, 2%B27 보충제 및 밀리리터 T3 트리요오드티로닌당 100나노그램을 포함하는 공동 배양 배지를 사용합니다. 다음 날에 매체를 변경하고 격일로 매체를 변경합니다. OPC가 너무 빨리 증식하여 3일 이내에 포화 상태에 도달하면, 2-5마이크로몰 Ara-C를 첨가한다.

시작 인간 만능 줄기 세포가 유도 뉴런 또는 OPC 및 희소돌기아교세포의 성공적인 생성을 위해 높은 수준의 만능성을 나타내는 것이 중요합니다. 따라서 유도 프로토콜 중 하나를 시작하기 전에 OCT-4 및 SOX2와 같은 특정 마커에 대해 세포를 염색해야 합니다. 인간 H1 세포는 유도된 흥분성 전뇌 뉴런을 얻는 데 사용되었습니다.

배양계의 순수 뉴런은 14일에서 16일에 시냅스를 발현하기 시작했습니다. IOPC는 2주 안에 생성되었고 성숙한 희소돌기아교세포는 4-5주 내에 생성되었습니다. DMSO 처리는 더 나은 신호 통합을 위해 초기 G1 단계에서 세포 수를 풍부하게 했습니다.

특정 OPC 마커는 ES H1 세포의 도금 후 2주 이내에 검출되었습니다. 2주째 IOPC 집단은 상당히 균질했으며, 세포의 95% 이상이 04 염색에 양성이었고 다른 마커에 대해서는 높은 수준의 면역 반응을 보였습니다. 희소돌기아교세포 성숙이 시작된 후, 특이적 희소돌기아교세포 마커는 28일째부터 검출되었습니다.

유도 뉴런 및 IOPC에 대한 이상적인 도금 밀도는 적절한 분화를 달성하기 위해 일련의 세포 수 적정으로 측정해야 합니다. 4주 후, 공동 배양에서 IOPC는 MBP와 같은 특정 마커에 대해 양성인 희소돌기아교세포로 적절하게 분화되어야 합니다. 이 공동 배양 시스템은 시냅스의 수를 강력하게 증가시킬 수 있으며, 이는 IOPC가 물리적 접촉 또는 영양 인자의 방출을 통해 신경 세포를 지원한다는 것을 나타냅니다.

이 설명된 절차는 다양한 뇌 세포 유형을 추가하여 더욱 정교해질 수 있습니다. 예를 들어, 줄기세포는 건강과 질병에서 뉴런 신경교세포 상호 작용의 새로운 측면을 모델링하기 위해 인간 성상세포를 파생했습니다.