차세대 시퀀싱을 이용한 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리 분석

이 방법은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 특정 T 및 B 세포의 탐사를 가능하게 하고 따라서 다른 무질서에 있는 림프구 인구 및 다양성 매개변수에 있는 동적 변경을 확인할 수 있습니다. 차세대 시퀀싱의 장점은 고유한 T 또는 B 세포 클론을 식별하고 다른 해부학 적 사이트 또는 다른 개인에서 추적 할 수있는 능력입니다. 이것은 다양한 질병에 있는 새로운 biomarkers의 확인을 위한 잠재력을 가지고 있습니다.

그 절차를 보여주는 나오미 살라몬, 내 실험실에서 연구 조수. 장 생검의 소화와 세포 용해를 수행하여 시작합니다. 새로 수집하거나 음의 20 또는 음의 80섭씨로 저장된 장 생검을 검색합니다.

냉동 생검을 사용하는 경우 얼음에 해동하십시오. 얼음 에 차가운 멸균 1.7 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 핵 용해 용액 600 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 생검을 튜브에 넣고 15~30분 동안 섭씨 65도에서 배양합니다.

밀리리터 당 20밀리그램의 마이크로리터 17.5마이크로리터를 넣고, 부드러운 흔들림으로 밤새 튜브를 55도에서 배양합니다. 인큐베이션 후 샘플을 실온으로 5분간 식힙니다. 혈액에서 DNA 절연을 위해 튜브가 완전히 섞일 때까지 부드럽게 흔들립니다.

그런 다음 세포 용액의 9 밀리리터를 포함하는 멸균 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 혈액을 전달합니다. 실온에서 10 분 잠복기 동안 튜브를 여러 번 반전시면 튜브를 여러 번 반전시십시오. 실온에서 10 분 동안 600g의 원심 분리기.

그런 다음 보이는 흰색 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 폐기하십시오. 튜브를 완전히 다시 중단 할 때까지 15 초 동안 적극적으로 소용돌이. 핵 용해 용액의 3 밀리리터를 여러 번 추가하여 용액이 점성이 됩니다.

단백질 강수 완충을 샘플에 추가합니다. 그런 다음 20 초 동안 적극적으로 소용돌이를 내고 5 분 동안 얼음에 배양하십시오. 16, 000g에서 4분간 원심분리기는 침전된 단백질을 함유한 단단한 펠릿을 형성한다.

펠릿을 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 방해하지 않고 신중하게 초판자를 이송합니다. 상체가 들어있는 튜브에 2 프로판올 1 밀리리터를 넣고 반전하여 부드럽게 섞습니다. DNA는 백색 부동 물질로 보일 것입니다.

16, 000배 g의 원심분리기는 1분간 완전히 제거합니다. 갓 준비된 70%에탄올 1밀리리터를 넣고 튜브를 여러 번 반전시면 됩니다. 원심 분리기는 실온에서 1 분 동안 16, 000g에서.

그런 다음 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. 에탄올 세척을 반복합니다. 그런 다음 DNA 펠릿을 10-15분 동안 공기 건조상태로 둡니다.

DNA에 초순수 수의 50 마이크로리터를 추가하고 텍스트 원고에 설명된 대로 DNA 정량화를 수행합니다. 150 나노그램의 DNA를 사용하여 시퀀싱을 위한 라이브러리를 준비합니다. 파이펫과 팁을 UV 조명으로 후드에 15분간 배치하여 잔류 DNA를 분해합니다.

한편, 다른 인덱스 튜브와 DNA 폴리머라제가 얼음 위를 해동하도록 허용한다. 생물학적 후드에서는 서로 다른 인덱스 튜브에서 45마이크로리터를 PCR 튜브에 추가하여 교차 오염을 방지합니다. 그런 다음 DNA 폴리머라제의 0.2 마이크로리터와 준비된 DNA의 5마이크로리터를 PCR 튜브에 첨가한다.

제조업체의 지침에 따라 사전 설정된 프로그램을 사용하여 PCR을 실행합니다. 과도한 프라이머, 뉴클레오티드 및 효소를 제거하기 위해 마그네틱 구슬을 사용합니다. 구슬을 실온으로 30분 이상 데우고 시료 당 400 마이크로리터에 충분한 신선한 80%에탄올을 준비합니다.

각 PCR 튜브에 구슬을 추가하고 10 번 파이프를 사용하여 혼합합니다. 실내 온도에서 10 분 동안 튜브를 배양하십시오. 혼합 샘플을 자기 스탠드에 5분간 놓습니다.

그런 다음 맑은 액체를 흡인하고 폐기하십시오. 10 마이크로리터 팁을 사용하여 나머지 액체를 흡입합니다. 각 샘플에 80%에탄올의 마이크로리터 200개를 추가하고 30초 동안 배양합니다.

에탄올 195 마이크로리터를 흡인하고 폐기하십시오. 그런 다음 10 마이크로 리터 팁을 사용하여 나머지 액체를 흡인합니다. 에탄올 세척을 반복합니다.

그런 다음 튜브의 뚜껑을 열고 5 분 동안 공기 건조하게하십시오. 5분 후, 마그네틱 스탠드에서 샘플을 제거하고 용출 버퍼 25 마이크로리터를 추가합니다. 균일해질 때까지 파이펫팅으로 섞고 실온에서 2분간 배양합니다.

튜브를 자기 스탠드에 5분간 놓습니다. 그런 다음 22 마이크로리터를 새로운 PCR 튜브로 옮기고 DNA 농도를 측정합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 앰플리시온을 정량화한다.

최종 DNA 농도와 제품 피크의 기본 쌍의 크기를 계산한 후 각 샘플에 대해 새로운 희석 믹스를 준비하고 두 개의 마이크로리터를 새로운 풀 믹스로 옮다. 0.2 일반 수산화 나트륨의 신선한 솔루션을 준비하고 희석 된 라이브러리에 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 실온에서 5분간 배양하여 이중 좌초 된 DNA를 변성시합니다.

그런 다음 키트에서 DNA를 포함하는 튜브에 980 마이크로 리터를 추가하고 잠시 소용돌이를 넣습니다. 최종 라이브러리의 600 마이크로리터를 지정된 카트리지에 로드하고 샘플을 컴퓨터에 배치합니다. 시퀀싱 분석을 수행하려면 시퀀서에서 시퀀싱 메트릭을 다운로드하고 데이터가 적절한 범위 내에 있는지 확인합니다.

기준을 충족하지 않는 샘플에 대한 실행을 반복합니다. 이 프로토콜은 IL10 수용체 결핍과 가혹한 유아 개시 IBD의 역사를 가진 환자의 대표적인 자가 혈액 및 직장 견본의 기본적인 분석을 능력을 발휘하기 위하여 이용되었습니다. 샘플은 TCR 베타 와 IGH 레퍼토리 모두에 대해 분석되었습니다.

모든 클론은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 고유 한 서열에 의해 식별 될 수있다. 이 순서는 공유 클론을 찾아서 또는 다른 해부학 사이트 사이 동일 환자에서 다른 환자 사이에서 비교될 수 있습니다. 각 샘플에 대해 가장 빈번한 5개의 클론은 여기에 표시됩니다.

트리맵 이미지는 레퍼토리에 대한 광범위한 개요를 위해 생성되었습니다. 각 색사각형은 다른 클론을 나타내며 크기는 주파수와 상관관계가 있습니다. 이러한 TreeMap 이미지는 장 내 IGH 레퍼토리에서 클로날 확장을 보여 줍니다.

대조적으로, TCR-베타 레퍼토리에서, 표시된 클로날 팽창은 자가 내장에 비해 혈액에서 관찰된다. 유전자 수준에서, NGS는 유전자, 가족, 또는 유전자의 수준에서 V, D 및 J 사용에 관하여 정보를 제공합니다. 더욱이, 특정 VDJ 조합은 TCR-베타 및 IGH 레퍼토리에 대한 데이터로부터 유추될 수 있으며, 다양한 조건에서 차동 유전자 사용 패턴을 드러냅니다.

이 프로토콜은 DNA와 RNA 둘 다에 적용될 수 있고 TCR 알파, TCR 감마 및 IGL 레퍼토리를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 그것은 또한 약간의 소화 수정 후 다른 기관과 호환됩니다.