M1 및 M2 인간 단세포 유래 세포의 편광 및 진균 결핵 감염에 대한 유동 세포측정을 분석

이 프로토콜은 10가지 색상 유세포 분석을 사용하여 다양한 대식세포 subset에서 녹색 형광 단백질 표지 Mtb의 시각화 및 심층 특성화를 기반으로 인간 단핵구 유래 세포의 면역 분극을 추적할 수 있는 기회를 제공합니다. 이는 감염 전후의 표현형 및 기능 평가를 포함하여 M1 또는 M2 편광 대식세포의 Mtb 감염에 대한 반응을 연구하는 효율적이고 재현 가능한 방법을 나타냅니다. 인간 기증자 버피 코트에서 PBMC를 분리하려면 피펫을 사용하여 50 밀리리터 튜브 측면의 15 밀리리터 버피 코트 혈액을 15 밀리리터의 밀도 구배 배지에 천천히 오버레이하고 원심분리로 세포를 분리합니다.

멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단 플라즈마 층을 제거하고 단핵 세포층을 새로운 50 밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 혈청이 없는 RPMI 배지를 세포에 최종 부피 50ml까지 추가하고 원심분리 전에 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 계수를 위해 20ml의 무혈청 배지에 세포를 재현탁합니다.

대식세포 분화를 시작하려면 세포를 무혈청 배지 농도의 10배에서 6번째 세포로 희석하고 2ml의 세포를 6웰 플레이트의 개별 웰에 시딩합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 2-3시간 동안 놓아 세포가 웰 바닥에 부착되도록 합니다. 배양이 끝나면 세척당 1ml의 무혈청 배지로 웰을 3회 세척하고, 부착 세포의 각 웰에 M1 또는 M2 분화를 위해 각각 GM-CSF 밀리리터당 50나노그램 또는 M-CSF 밀리리터당 50나노그램이 보충된 완전한 RPMI 배지 2밀리리터를 추가합니다.

분극 시작 3일 후, 각 웰에서 추출한 1ml의 상등액을 적절한 성장 인자로 보충된 1ml의 새로운 완전 배지로 조심스럽게 교체하십시오. 배양 6일차에 인터페론 감마 밀리리터당 50나노그램, LPS 밀리리터당 10나노그램을 GM-CSF 처리된 웰에 첨가하고 IL-4 밀리리터당 20나노그램을 M-CSF 처리된 웰에 첨가합니다. 광학 현미경으로 단핵구 유래 세포 배양의 형태를 정기적으로 확인하여 더 작은 단핵구가 더 큰 대식세포 유사 세포로 분화하고 있는지 확인합니다.

Mtb 배양을 설정하려면 생물 안전성 레벨 III 시설에서 1ml의 해동된 박테리아 현탁액과 9ml의 TB 완전 배지를 50ml 여과된 캡 튜브에 혼합하여 세포 배양 incubator의 튜브에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 원심분리로 박테리아를 수집하고 박테리아를 세포 배양 인큐베이터로 되돌리기 전에 새로운 50ml 여과 캡 배양 튜브에 15-20ml의 신선한 TB 완성 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 7-10일의 배양 후, 세척당 35-40ml의 멸균 세척 완충액으로 박테리아를 두 번 세척하고, 두 번째 세척 후 1ml의 무혈청 RPMI 배지에 박테리아를 재현탁시킵니다.

박테리아에 9ml의 무혈청 RPMI 배지를 더 첨가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 Class II 생물 안전 캐비닛의 수조 초음파 처리기에서 박테리아를 초음파 처리합니다. 그런 다음 생물 안전 캐비닛 내부에 배치된 분광 광도계에서 600나노미터 파장에서 1밀리리터의 박테리아 현탁액의 광학 밀도를 측정합니다. 단핵구 유래 세포를 감염시키려면, 박테리아를 무혈청 배지에서 10 밀리리터 농도당 6번째 콜로니 형성 단위의 5배로 희석하고, 6웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 있는 상등액을 웰당 1밀리리터의 신선한 무혈청 배지와 1밀리리터의 박테리아 현탁액으로 교체하여 5의 감염 배수를 얻습니다.

세포 배양 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 후, 세척당 1ml의 멸균 세척 버퍼로 각 웰을 세 번 세척하고, 플레이트를 조심스럽게 기울여 세척할 때마다 웰 모서리에서 완충액의 전체 부피를 제거합니다. 그런 다음 Mtb에 감염된 단핵구 유래 세포를 항생제 없이 2ml의 완전한 배지에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 세포를 염색하려면 감염된 세포를 웰당 0.5밀리몰 EDTA가 보충된 1ml의 FACS 완충액으로 최소 30분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 부드러운 피펫팅으로 분리된 세포를 수집하고 원심분리를 위해 세포를 개별 나사로 덮인 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 약 50마이크로리터의 형광색소 접합 항인간 항체 칵테일 및 관심 생존도 염료에 세포를 재현탁시키고 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 세척 후 갓 준비한 고정 완충액 200마이크로리터로 세포를 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 고정합니다.

고정 및 세척 후 400마이크로리터의 FACS 완충액에 세포를 재현탁시키고 세포를 1밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포를 분석하려면 보상 비드를 사용하여 칵테일의 각 형광 결합 항체에 대한 형광 신호를 보상하고 염색되지 않은 세포를 사용하여 음성 세포 집단에 대한 게이트를 설정합니다. 그런 다음 샘플당 최소 50, 000개의 세포를 확보합니다.

M1 및 M2 단핵구 유래 세포는 모두 Mtb 감염 시 더 높은 입도와 감소된 세포 크기로 수직 이동을 보입니다. 또한 Mtb에 감염된 M1 및 M2 세포에서 감염되지 않은 M0 세포에 비해 5개의 감염 배수로 향상된 세포 사멸이 관찰됩니다. 주목할 점은 감염 4시간 후 M2 세포에서 M1 세포에 비해 상당히 높은 Mtb GFP 발현이 관찰된다는 것입니다.

감염되지 않은 M1 및 M2 세포는 각각 CD64 및 CD86 또는 CD200 수용체 및 CD163 동시 발현으로 특성화될 수 있습니다. Mtb 감염 4시간 후, Mtb GFP 양성 M1 편광 세포에서 CD200 수용체 양성 세포의 빈도 증가가 관찰되는 반면, M2 세포에서는 CD163 발현이 감소합니다. Mtb GFP 박테리아는 컨포칼 현미경 검사에 의해 CD64 양성 M1 세포 및 CD163 양성 M2 세포에서도 관찰될 수 있습니다.

UMAP 분석에 따르면 4시간의 Mtb 감염은 대식세포 분극에 영향을 미치기에 충분하지 않은 반면, 24시간 동안의 감염은 뚜렷한 표면 마커 발현 프로파일을 발현하는 감염되지 않은 M1 및 감염된 M2 세포의 클러스터가 명확하게 분리되는 결과를 낳습니다. 또한, PhenoGraph 분석은 서로 다른 크기의 24개의 서로 다른 클러스터가 M1 및 M2 감염되지 않은 세포와 Mtb 감염 세포 사이에 고유하게 분포되어 있음을 보여줍니다. M1 또는 M2 분극 또는 Mtb 감염성의 효능은 인간 기증자에 따라 크게 다를 수 있습니다.

따라서 실험 변동을 줄이기 위해 각 실험에 최소 두 명의 공여자를 포함하는 것이 좋습니다. 이 모델을 사용하면 유세포 분석, 컨포칼 현미경 검사, mRNA 발현 분석, 용해성 인자의 다중 분석 및 GFP 발현 또는 집락 형성 단위를 사용한 박테리아 정량을 사용하여 인간 대식세포를 동시에 평가할 수 있습니다.