Name: 환경 DNA 응용을 위한 종별 정량PCR 분석의 개발 및 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 환경 DNA 분석을 위한 종별 정량PCR 분석 설계 및 최적화 방법을. NCBI 데이터베이스 활용, 서열 정렬, 프라이머 설계, 특이성 및 효율성 검증을 포함한 전체 프로토콜을 통해 정확한 종 검출 및 보전 생물학 연구에 활용하세요.

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우리는 프라이머 개발 및 테스트에 도움이 알비 와두드와 트루디 프로스트 감사합니다. 이 연구에서 보고된 분석 설계에 대한 자금은 국방부 전략 환경 연구 개발 프로그램(RC19-1156)에 의해 제공되었습니다. 무역, 제품 또는 회사 이름을 사용하는 것은 설명적인 목적으로만 사용되며 미국 정부의 승인을 의미하지는 않습니다. 이 연구 기간 동안 생성된 데이터는 USGS 데이터 릴리스 https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 사용할 수 있습니다.

<ol><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology. 10, 5(1992).</li>
<li>Mauvisseau, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+accuracy%2C+repeatability+and+detection+probability+in+the+reliability+of+species-specific+eDNA+based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches.</a> Scientific Reports. 9 (1), 580(2019).</li>
<li>Hernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60+specific+eDNA+qPCR+assays+to+detect+invasive%2C+threatened%2C+and+exploited+freshwater+vertebrates+and+invertebrates+in+Eastern+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+DNA%22%5BJournal%5D)">60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada.</a> Environmental DNA. , (2020).</li>
<li>Klymus, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+the+limits+of+detection+and+quantification+for+environmental+DNA+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+DNA%22%5BJournal%5D)">Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays.</a> Environmental DNA. , (2019).</li>
<li>Thalinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validation+scale+to+determine+the+readiness+of+environmental+DNA+assays+for+routine+species+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Helbing, C. C., Hobbs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+Standardization+Needs+for+Fish+and+Wildlife+Population+Assessments+and+Monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22CSA+Group%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring.</a> CSA Group. , (2019).</li>
<li>Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Environmental+DNA+Methods+Ready+for+Aquatic+Invasive+Species+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management.</a> Trends in Ecology & Evolution. , (2020).</li>
<li>Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+is+a+PCR+efficiency+estimate%3A+Recommendations+for+precise+and+robust+qPCR+efficiency+assessments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).</li>
<li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA%3A+the+importance+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS One. 8 (3), 59520(2013).</li>
<li>Prediger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+design+primers+and+probes+for+PCR+and+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22IDT%22%5BJournal%5D)">How to design primers and probes for PCR and qPCR.</a> IDT. , Available from: 
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<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).</li>
<li>Owczarzy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDT+SciTools%3A+a+suite+for+analysis+and+design+of+nucleic+acid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers.</a> Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).</li>
<li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoCalc%3A+an+online+oligonucleotide+properties+calculator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).</li>
<li>Taylor, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ultimate+qPCR+Experiment%3A+Producing+Publication+Quality%2C+Reproducible+Data+the+First+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time.</a> Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (134), 11(2012).</li>
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<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
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<li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+Vol.+6894%22">Bio-Rad Vol. 6894</a>. , Bio-Rad (2020).</li>
<li>Eurogentec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eurogentec.+Vol.+0708-V2%22">Eurogentec. Vol. 0708-V2</a>. , ed Eurogentec (2020).</li>
<li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+primer+design+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li>
<li>Hoorfar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+design+of+internal+amplification+controls+for+diagnostic+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).</li>
<li>Goldberg, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+considerations+for+the+application+of+environmental+DNA+methods+to+detect+aquatic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).</li>
<li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+%28eDNA%29+Assays+for+Invasive+Populations+of+Black+Carp+in+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Fisheries+Society%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America.</a> Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).</li>
<li>Mosher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+molecular+detection+studies+require+clear+communication+among+diverse+research+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Ecology+and+the+Environment%22%5BJournal%5D)">Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners.</a> Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).</li>
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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 자금 지원은 연구의 디자인에 아무런 역할이 없었다; 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고의 글에서; 또는 결과를 게시하기로 결정합니다.

어떤 연구와 마찬가지로, 해결될 질문을 정의하는 것은 첫 번째 단계이고 eDNA 분석의 디자인은 연구 결과에 따라 다릅니다26. 예를 들어, 연구 또는 조사의 목적이 하나 또는 몇 가지 종을 검출하는 경우, 표적 프로브 기반 분석이 가장 좋습니다. 그러나, 목표는 더 큰 제품군 또는 종의 조립을 평가하는 것입니다 경우, 높은 처리량 시퀀싱 메타바코딩 분석이 더 적합합니다. 어떤 접근 방식을 취해야 할지 결정되면 분석 설계, 테스트 및 최적화를 포함한 파일럿 연구가 권장됩니다.24. 분석 설계는 에 설명된 대로 종 목록으로 시작됩니다. 그림 1. 이 목록은 분석이 특이성과 적용될 수 있는 지리적 범위측면에서 얼마나 잘 수행되는지 를 이해하는 기초가 될 것입니다.6,10. 특정 지리적 영역에 대한 분석기를 설계하여 설계하여 설계자가 해당 지역의 다른 종에 대한 상호 반응성에 대한 분석방법을 더 잘 테스트할 수 있으며, 표적 종이 발생할 수 있는 다른 지역으로 분석영역을 확장하는 데 있어 한계를 인식하는 것이 좋습니다.24. 목록이 완료되면 공개 유전 데이터베이스에서 시퀀스를 다운로드할 수 있습니다. 이러한 데이터베이스가 불완전하기 때문에27, 하나는 분석 설계에 사용되는 시퀀스의 로컬 참조 데이터베이스를 완료하기 위해 집에서 가능한 한 많은 종을 순서해야합니다. 이들은 증폭할 가능성이 가장 높은 비 표적이기 때문에, 밀접하게 관련되는 종을 공동 발생하는 우선순위를 정합니다. 대상 종과 같은 속 또는 가족 내의 모든 종에 초점을 맞추는 것은 시작하기에 좋은 장소입니다. 밀접하게 관련 된 종과의 비교는 대상 종에 고유한 서열 영역을 식별하는 데 도움이됩니다. 이렇게 하면 다른 시스템이나 위치에서 분석이 어떻게 수행되는지 알 수 있습니다. 미토콘드리아 영역은 종개발의 일반적인 선택이며, 생명 프로젝트의 바코드에 사용된 미토콘드리아 유전자에서 보다 다양한 종의 서열 정보를 사용할 수 있기 때문에, 미토콘드리아 DNA는 핵 DNA보다 사본/세포에 훨씬 더 큰 농도로 존재하기 때문이다.24,28,29. 여러 유전자 영역은 유전 저장소 데이터베이스에서 분류사 마다 서열 엄호가 변화하기 때문에 추가 분석 발달을 위해 평가되어야 합니다. 참조 시퀀스의 이 로컬 데이터베이스가 생성되면 정렬된 시퀀스 데이터와 컴퓨터 소프트웨어 프로그램의 수동 시각화가 결합되어 프라이머/프로브 분석방법을 디자인하는 데 사용됩니다. 하나는 테스트 할 분석방법을 결정하기 위해 소프트웨어에 엄격하게 의존해서는 안됩니다. 프라이머와 프로브가 대상과 비대상에 앉아 있는 정렬을 시각적으로 확인하여 PCR에서 어떻게 행동할지 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 마지막으로 분석 검사 및 최적화는 세 가지 수준을 포함 (실리코에서, 시험관 내 및 시투에서)6,7,24,25. 실리코 디자인 및 테스트는 성공 가능성이 좋은 짧은 분석 목록을 생성하는 데 중요하지만 경험적 (시험관 내) 테스트는 최상의 실제 성능으로 분석기를 선택하는 데 중요합니다. 시험관 내 최적화 및 분석 테스트에는 반응 효율을 측정하고 분석의 민감도 및 특이성을 정의하는 것이 포함됩니다. 검출 및 정량화의 한계는 분석 개발에서 간과되는 두 가지 매개 변수이지만 데이터 해석에 중요합니다. 분석에 대한 표준 곡선의 여러 복제를 실행함으로써 LOD 및 LOQ를 쉽게 측정할 수 있습니다.1,5,30. 분석의 LOD 또는 LOQ와 관련하여 결과를 논의하는 연구는 거의 없지만, Sengupta 외(2019)는 분석의 LOD 및 LOQ를 데이터 해석 및 그래픽에 통합하여 결과를 보다 명확하게 이해하기 위한 것입니다.31. 내부 양수 컨트롤도 설계된 분석서에 멀티플렉션되어야 합니다. 샘플에서 PCR 억제에 대한 테스트없이, 거짓 네거티브가 발생할 수 있습니다24,32. 우리는 PCR 억제 테스트를위한 가장 쉬운 방법으로 대상 분석과 멀티 플렉스 IPC 분석의 사용을 제안23. 마지막으로, 환경 샘플에서 표적 증폭이 발생하는지 확인하기 위해 현장 및 실험실 에서 수집된 샘플의 분석 현장에서 분석이 필요합니다.24.
eDNA 샘플을 사용하여 종별 프로브 기반 qPCR 분석기의 사용에 대한 제한이 존재합니다. 예를 들어, 테스트를 위한 여러 분석서의 설계는 시퀀스 가용성에 의해 제한될 수 있으며 분석 성능측면에서 타협이 필요할 수 있습니다. 이러한 선택은 연구의 목표에 의해 인도되어야하며 결과26과함께보고해야합니다. 예를 들어, 희귀 종을 검출하는 것이 목표이고 몇 가지 양성이 예상되는 경우, 모든 검출이 시퀀싱에 의해 확인될 경우 불완전한 특이성(즉, 비표적 종의 증폭)을 가진 분석이 사용될 수 있다. 목표가 종의 지리적 범위를 모니터링하고 eDNA 농도 데이터가 필요하지 않은 경우 불완전한 효율성을 가진 분석이 사용될 수 있으며 데이터는 백분율 검출으로만 보고될 수 있습니다. 더욱이, 모든 잠재적인 동특이성이 실험실에서 시험되지 않는 한, 거의 가능하지 않습니다, 하나는 절대적으로 확실하게 분석의 진정한 특이성을 알 수 없습니다. 예를 들어, 분석은 클린치 강의 여러 담수 홍합 종에 대해 설계 및 테스트되었습니다. 다른 강 시스템에서이 분석서를 사용하려면 새로운 위치에있는 종의 제품군에 대해 테스트해야합니다. 분석 발달 도중 시험되지 않는 종 또는 인구 내의 유전 변이는 또한 특이성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 분석이 높은 기술적 성능을 가지고 있는지 확인된 경우에도 현장에서 작업할 때 조건이 바뀝니다. 물 흐름, pH 및 동물 거동과 같은 비 분석 관련 조건은 상이한 eDNA 수집 및 추출 프로토콜을 사용할 수 있는 바와 같이 eDNA 검출가능성을 바꿀 수 있다. 최적화되고 잘 설명된 분석에 사용하면 이러한 매개 변수가 eDNA 검출에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 됩니다.
eDNA 분야는 탐색 분석 단계를 넘어 방법과 기술의 표준화를 증가시키기 위해 성숙하고 있습니다. 이러한 발전은 eDNA 기술, 능력 및 한계에 대한 이해를 향상시킬 것입니다. 위에서 설명하는 최적화 프로세스는 분석의 민감도, 특이성 및 재현성을 향상시킵니다. eDNA 방법의 이 정제 및 표준화의 궁극적인 목표는 eDNA 데이터를 기반으로 추론을 하는 연구원의 능력을 향상시키고 최종 사용자 및 스테이크 보유자의 결과에 대한 신뢰를 높이는 것입니다.

연구원과 관리자는 점점 종 검출을 위한 환경 DNA 연구약의 사용에 관심을 지고 있습니다. 3년 동안, 정량적 또는 실시간 PCR(qPCR/rtPCR)은 핵산1,2의서열 특이적 검출 및 정량화를 위해 수많은 분야에서 사용되어 왔다. eDNA 연구의 비교적 새로운 분야 내에서, 이러한 검사의 사용은 부피 또는 eDNA 샘플의 무게당 표적 DNA의 사본을 정량화하기 위한 표준 곡선을 가진 이 애약의 사용이 이제 일상적인 사례가 되었습니다. 미토콘드리아 DNA 서열은 일반적으로 미토콘드리아 게놈이 세포당 수천 개의 사본에 존재하기 때문에 eDNA 분석은 일반적으로 표적으로 하지만 핵 DNA 또는 RNA 서열에 대한 분석은 또한 가능하다. eDNA 샘플에 대한 출판 된 소가 항상 성능과 동일하지 않다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 표적 종의 DNA(즉, 특이성)만 검출하고 표적 DNA(즉, 감도)의 검출에 대한 분석의 신뢰성은 분석이 설계, 선택, 최적화 및 테스트된 방식의 차이로 인해 상당히 달라질 수 있다. 분석 성능의 정량적 측정을 보고하는 것은 이전에 크게 간과되었지만, 최근 분석 개발의 투명성을 개선하기 위한 표준이3,4,5,6,7,8로부상하고있다.
eDNA 조사 결과의 연구 설계 및 해석에 대한 분석 성능 보조 제의 최적화 및 보고. 비표적 종 DNA와 교차 반응하는 분석은 거짓 양성 검출으로 이어질 수 있으며, 민감성이 좋지 않은 분석법은 샘플(거짓 네거티브)에 존재하는 경우에도 표적 종 DNA를 감지하지 못할 수 있습니다. 분석 민감도 및 선택성에 대한 이해는 희귀 종을 검출하는 데 필요한 샘플링 노력을 알리는 데 도움이 됩니다. eDNA에 변화의 많은 자연적인 소스가 있기 때문에, 연구는 완전히 최적화하고 eDNA 분석3을특성화포함, 가능한 한 변이의 제어 가능한 소스를 제한해야합니다.
분석기의 특이성 또는 감도에 직접적인 영향을 주는 조건은 분석기의 성능을 변경합니다. 이것은 다른 실험실 조건 (즉, 다른 시약, 사용자, 기계 등)에서 발생할 수 있습니다. 따라서 새 조건에서 분석서를 적용할 때 이 프로토콜을 다시 검토해야 합니다. 문헌에서 잘 특징지어지는 소법조차도 새로운 실험실에서 채택하거나 다른 시약(예를 들어, 마스터 믹스 용액)을 사용할 때 테스트및 최적화되어야 한다5,9. 분석 특이성은 상이한 지리적 영역에 적용될 때 변경될 수 있으며, 분석이 시험되지 않은 비표적 종을 포함할 수 있는 새로운 바이오틱 커뮤니티로부터의 샘플에 적용되고 있기 때문에 표적 종의 유전적 변화가 발생할 수 있다. 다시 말하지만, 분석은 새 위치에서 사용할 때 다시 평가되어야 합니다. 현장 PCR 억제제는 샘플에 존재할 가능성이 높기 때문에 현장 조건은 실험실 조건과 다릅니다. PCR 억제제는 증폭 반응에 직접적인 영향을 미치고 따라서 분석 성능에 영향을 미칩니다. 이러한 이유로, 내부 긍정적인 제어 는 eDNA 분석 기 개발 시 필요.
마지막으로, 필드에 있는 환경 조건은 DNA 분해, 수송 및 보존을 통해 표적 종의 DNA 분자 및 그들의 포착에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, DNA 수집 및 추출을 위한 다른 프로토콜은 DNA를 유지하는 그들의 효율성 그리고 기능에 변화합니다. 그러나 이러한 프로세스는 eDNA의 검출 가능성에 영향을 미치지만 분자 적 약의 성능은 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 현장 샘플에서 표적 종으로부터의 DNA의 검출성은 qPCR 분석의 기술적 성능뿐만 아니라 현장 조건 및 수집, 저장 및 추출 프로토콜의 기능이다. 잘 특징적이고 성능이 높은 분석서를 사용하는 경우 사용자는 분석의 기능에 자신감을 느낄 수 있습니다. 연구원은 지금 eDNA 탐지에 영향을 미치는 외부 분석 요인 (즉, 환경 변수, 포획 또는 추출 프로토콜의 차이)를 이해하는 데 집중할 수 있습니다.
여기서우리는 엄격한 설계와 최적화를 통해 분석 기술 성능에 특히 중점을 둡니다. 우리는 미국 클린치 강에서 샘플링 된 물에서 담수 홍합, 머킷(액티논아 인대)의검출을 위해 개발 된 프로브 기반 분석법을 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 최근 탈링거 외 (2020)는 표적 eDNA 검사의 검증을 위한 지침을 제출했습니다. 우리의 프로토콜에 따라 분석 디자인은 탈링거 등의 레벨 4플러스 레벨 56을향한 추가 단계에 대한 분석서를 가져올 것이다. 이 시점에서 분석의 기술 성능이 최적화될 것이며 실험실 및 현장 응용 분야에서 정기적으로 사용할 준비가 될 것입니다. 실험실, 중소균 및 현장 실험에서 분석법의 추가 사용은 eDNA 검출 및 검출가능성에 영향을 미치는 요인, 레벨 5 유효성 검사6의최종 단계에 관한 질문을 해결할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>96 커버 포함 리버서블 랙</td><td>Globe Scientific</td><td>456355AST</td><td></td></tr><tr><td>깨끗한 장갑(예: 라텍스, 니트릴 등)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 2.0mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2681332</td><td></td></tr><tr><td>하드쉘 96-웰 PCR 플레이트, 로우 프로파일, 얇은 벽, 스커트, 흰색/ 투명</td><td>Bio-Rad</td><td>#HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>IPC 정방향 및 역방향 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>없음</td><td>맞춤형 제품</td></tr><tr><td>IPC PrimeTime qPCR 프로브</td><td>통합 DNA Technologies, Inc.</td><td>없음</td><td>맞춤형 제품</td></tr><tr><td>IPC Ultramer DNA Oligo 합성 템플릿</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>사용자</td><td>정의 제품</td></tr><tr><td>Labnet MPS 1000 PCR 플레이트용 소형 미니 플레이트 스피너 원심분리기</td><td>Labnet</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>기계 다양한</td><td>-</td><td>1.5mL 및 2.0mL 튜브를 담을 수 있는 모든 마이크로 원심분리기는 일반적으로 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 물(DEPC 처리 안 됨)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 GP LTS 1000 &micro; L F 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389272</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 GP LTS 20 &마이크로; L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389274</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 GP LTS 200 &마이크로; L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Rainin</td><td>다양</td><td>실험실의 선호도에 따라 수동 또는 전동 피펫을 다양한 최대 용량으로 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>TaqMan 환경 마스터 믹스 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4396838</td><td></td></tr><tr><td>타겟 정방향 및 역방향 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>없음</td><td>맞춤형 제품</td></tr><tr><td>Target PrimeTime qPCR 프로브</td><td>통합 DNA Technologies, Inc.</td><td>없음</td><td>맞춤형 제품</td></tr><tr><td>대상 합성 gBlock 유전자 단편</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>없음 맞춤형 제품. qPCR 표준 희석 시리즈에 사용</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td><td>Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td></td></tr></tbody></table>

환경 dna 응용을 위한 종별 정량pcr 분석의 개발 및 시험

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

수산 및 야생 동물 보호 관리를 돕기 위해 종의 존재를 감지하고 모니터링하기위한 새로운 비침습적 방법이 개발되고 있습니다. macrobiota를 검출하기 위한 환경 DNA(eDNA) 샘플의 사용은 급속히 인기를 끌고 국가 관리 프로그램에서 구현되고 있는 방법의 한 개이다. 여기서 우리는 프로브 기반 정량 PCR (qPCR) 응용 프로그램에 대한 종 별 표적 분석의 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 프로브 기반 qPCR을 사용하면 프라이머만으로도 가능한 것보다 더 큰 특이성을 제공합니다. 더욱이, 샘플에서 DNA의 양을 정량화하는 능력은 eDNA의 생태학과 현장에서 eDNA 검출 패턴의 해석에 유용할 수 있다. 환경 샘플에서 대상 종을 검출하는 민감도 및 특이성을 보장하기 위해 이러한 아세의 개발 및 테스트에 주의 깊은 고려가 필요합니다. 이 프로토콜에서 우리는 표적 종의 검출을 위한 프로브 기반 분석서를 설계하고 테스트하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 시퀀스 데이터베이스, 분석 설계, 분석 선택 및 최적화, 테스트 분석 성능 및 필드 유효성 검사를 포함합니다. 이러한 단계를 수행하면 자신있게 사용할 수 있는 효율적이고 민감하며 구체적인 분석결과를 달성하는 데 도움이 됩니다. 우리는 미국 클린치 강에서 발견되는 담수 홍합 종인머켓(액티논나이아스 인대)의인구를 위해 고안된 분석으로 이 과정을 시연합니다.

환경 DNA 분석법은 현장 데이터 수집이 시작되기 전에 엄격한 설계, 테스트, 최적화 및 검증이 필요합니다. 여기서, 우리는 환경 샘플에서 표적 종 DNA의 검출 및 정량화를 위한 종별, 프로브 기반 qPCR 분석의 각 단계를 통해 사용자를 취할 프로토콜을 제시한다.

환경 DNA 응용을 위한 종별 정량PCR 분석의 개발 및 시험

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

잘 최적화된 분석은 환경 DNA 데이터의 적절한 해석에 필수적입니다. 이 프로토콜은 이러한 분석을 개발하는 데 필요한 설계 및 테스트 단계를 설명합니다. 일반적으로 환경 DNA는 특정 종 또는 종 군을 검출하기 위한 비침습적 방법입니다.기존 조사 방법에 비해 비용을 절감하고 더 민감할 수 있습니다. 이 방법은 관심 종의 DNA를 감지하여 보존 및 야생 동물 관리를 도울 수 있으며, 이를 통해 표본 지역에서 해당 종의 존재를 잠재적으로 추론할 수 있습니다. 정량적 PCR의 민감도가 높기 때문에 오염이 쉽게 발생할 수 있으며, 오염이 유입된 단계를 식별하기 위해 음성 대조군이 필요합니다.eDNA는 전문 용어와 약어로 가득 찬 분야입니다. 분자 생물학 또는 qPCR에 익숙하지 않은 사람들의 경우, 시각적 시연은 개념화에서 데이터 생성에 이르기까지 실험 설계를 계획하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 생물학자인 Dannise Ruiz Ramos와 학생 실험실 보조원인 Trudi Frost입니다.시작하려면 NCBI의 뉴클레오티드 데이터베이스를 사용하여 여러 유전자 영역에서 관심 종의 염기서열을 검색하고 다운로드합니다. 사양과 일치하는 모든 시퀀스를 선택하고 다음으로 보내기를 선택합니다. 전체 기록, 파일, 다운로드 형식을 GenBank 또는 FASTA로 선택한 다음 파일 생성을 선택합니다. 이제 이러한 시퀀스가 컴퓨터에 저장됩니다.관심 있는 모든 종에 대해 이 단계를 반복합니다. 각 유전자 영역에 대한 염기서열은 별도로 분석되므로 별도의 파일에 보관하십시오. 각 유전자 영역의 염기서열을 개별적으로 정렬하려면 다운로드한 염기서열 파일을 Geneious Prime 소프트웨어와 같은 염기서열 정렬 프로그램으로 가져옵니다.각 유전자 영역에 대해 별도의 폴더를 만든 다음 한 유전자 영역의 염기서열을 포함하는 폴더 내의 모든 염기서열을 선택합니다. Multiple Alignment 도구를 사용하여 선택한 염기서열의 Geneious 또는 MUSCLE과 같은 뉴클레오티드 정렬을 생성합니다. 정렬된 염기서열 데이터의 시각화를 통해 분석 설계를 위한 유망한 영역을 선택할 수 있습니다.관심 종에 사용할 수 있는 염기서열 데이터가 많고, 종 간에 매우 다양하며, 종 변동이 적은 지역을 선택합니다. 다음으로, 분석 프라이머와 프로브를 설계합니다. qPCR 분석 설계 소프트웨어를 사용하여 5세트의 qPCR 분석을 설계할 수 있습니다.선택한 시퀀스를 시퀀스 엔트리(Sequence Entry) 상자에 붙여넣습니다. 정렬로 인해 공백이 생성된 경우 시퀀스에서 해당 공백을 삭제합니다. Choose Your Design(설계 선택) 옵션에서 qPCR 2 프라이머 프로브를 선택한 다음 권장 분석을 다운로드합니다.첫 번째 분석의 전방 프라이머에서 염기서열을 복사하고 이전에 생성된 정렬에서 이 프라이머 염기서열을 검색합니다. Geneious Prime을 사용하는 경우 Annotate Predict 도구를 사용하여 프라이머 영역을 정렬에 추가합니다. 모든 프라이머 및 프로브 조합에 대해 이 작업을 수행합니다.이러한 정렬 영역을 검사하여 대상 종 내에서와 동시에 발생하는 종 내에서의 변동이 있는지 확인합니다. NCBI의 Primer-BLAST를 통해 인실리코(in silico)로 프라이머를 테스트하십시오. Primer Parameters 아래에 있는 내 자신의 프라이머 상자를 사용하도록 프라이머를 붙여넣습니다.Primer Pair Specificity Checking Parameters 옵션에서 NR을 Database로 선택하고 Organism 상자에 관심 유기체의 분류학적 순서 또는 패밀리를 입력합니다. 선택한 프라이머가 비표적 종을 증폭할 가능성이 없는지 확인합니다. 표준 곡선을 생성하여 in vitro에서 분석 효율을 테스트하고 곡선의 효율성과 선형 범위를 측정합니다.표적 염기서열을 포함하는 합성 DNA 표준물질을 반응당 약 1-100만 복제로 최소 6배 희석하여 테스트합니다. qPCR 소프트웨어를 사용하여 Y축에 각 표준물질의 CQ 값을 플로팅하고 X축에 초기 표준물질 농도의 log base 10을 반응당 사본 단위로 표시합니다. qPCR 소프트웨어는 선형 회귀를 자동으로 실행해야 합니다.회귀 분석의 기울기에서 효율성을 계산합니다. 표준 곡선에 편향 또는 성능 저하가 있는지 효율성과 R 제곱 값으로 측정한 결과를 육안으로 검사합니다. 내부 양성 대조군을 사용하여 실제 현장 샘플의 PCR 억제를 테스트하면 민감도 감소 및 위음성이 발생할 수 있습니다.각 분석에 대한 검출 및 정량화의 한계를 결정합니다. 비표적 종으로 어세이를 테스트하여 특이성을 확인하고 어세이가 IPC 멀티플렉싱에서 잘 수행되는지 확인합니다. 감도, 특이성 및 효율성이 우수한 분석은 다음 단계로 진행할 수 있습니다.분석의 현장 검사를 수행하려면 여러 개의 물 샘플을 채취하여 qPCR용으로 처리합니다. 정량적 PCR 분석을 실행하고 eDNA 농도 및 검출 빈도를 알려진 부위 발생 및 존재량 차이와 비교합니다. 시퀀싱을 통해 모든 탐지를 확인합니다.클린치 강(Clinch River)에 있는 모든 Unionidae 종의 사용 가능한 염기서열을 다운로드하여 정렬했습니다. 여러 분석을 설계한 후 시각적 평가를 위해 5세트의 프라이머와 프로브를 얼라인먼트에 추가했습니다. 프라이머 및 프로브 세트는 in silico 및 in vitro에서 테스트되었습니다.실험실에서 모든 분석은 특이성을 확인하기 위해 사용 가능한 27개 종의 DNA 추출을 사용하여 테스트되었습니다. 한 가지 분석법은 표적 종만 성공적으로 증폭했습니다. 우수한 효율성과 R 제곱 값을 가진 성공적인 분석이 여기에 나와 있습니다.선택한 분석에 대한 LOD 및 LOQ는 모두 반응당 5개 복제였습니다. 대조적으로, 효율성이 낮은 표준 곡선을 생성한 분석은 폐기되었습니다. 고품질 qPCR에서 표준 희석액은 농도의 10배 차이마다 약 3.3 사이클의 균일한 간격의 사이클 정량화 값으로 증폭됩니다.qPCR이 불량한 경우, 표준물질은 희석 간 cycle quantification 값에서 불균일한 변동을 보일 수 있습니다. 미지 샘플에 대한 IPC 증폭은 음성 템플릿 제어 IPC의 결과와 비교해야 합니다. 샘플에 억제제가 없는 경우, 모든 IPC 증폭은 플롯에서 밀접하게 그룹화되어야 하며, cycle quantification 값은 템플릿 없음 대조군과 거의 동일해야 합니다.분석의 현장 테스트를 위해 위치 사이트에는 하천의 홍합 바닥 바닥, 해안 근처의 근육 바닥 바닥, 하천의 침대 하류 100m, 하천의 바닥 500m 하류, 해안 근처 바닥의 500m 하류가 포함되었습니다. 환경 DNA에 대한 정량적 PCR 분석은 침입종과 멸종위기종을 모두 모니터링하는 데 도움이 될 수 있을 뿐만 아니라 개별 유기체를 물리적으로 포획하지 않고도 종 검출의 공간적, 시간적 변화에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

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Research

연구

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Environment

환경

여기에 제시된 직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 식물과 동물 조직의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게한다.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

이 비디오에서는 두 개의 서로 다른 유전자 마커를 동시에 검출하는 데 유용한 기존 PCR 기술을 변형한 ddPCR(duplex digital PCR) 기술을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적으로 증폭되는 나노리터 크기의 유화 액적으로 분할되며, 액적 분획에서 서로 다른 색상의 형광 증폭 신호를 검출하는 것은 표적 염기서열의 초기 농도를 계산하는 데 사용됩니다.

이중 유전자 마커의 동시 정량을 위한 Duplex Digital PCR

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

이 원고를 동시에 엔테로 종을 정량화하는 데 사용할 수있는 이중 디지털 PCR 분석. 레크리에이션 바다에서 일반과 인간의 관련 분변 오염의 지표로 HF183 유전자 마커를 설명합니다.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

실시간 PCR을 통해 해안 퇴적물의 박테리아 16S rRNA 유전자 및 전사체를 정량화하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법론에는 DNA와 RNA의 공동 추출이 포함됩니다. DNA가 없는 RNA의 제조; 및 표준 곡선 구조를 포함한 RT-q-PCR을 통한 16S rRNA 유전자 및 전사체 정량화.

실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

이 프로토콜은 gRNA 유도 Cas9 분열 및 DNA 수리 에 따른 표적 부위에서 비균성 최종 결합(NHEJ) 이벤트의 식별 및 정량화를 위한 분석을 포함하여 디지털 물방울 PCR(ddPCR)에 대한 실험용 설정에 DNA 추출에서 단계를 제공합니다. 이 방법의 그밖 용도는 다형성 검출 및 유전자 편집 이체 확인과 같은 응용을 포함합니다.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

신뢰할 수 있고 정확한 현장 배치 가능한 DNA 분석은 많은 산업에서 매우 중요합니다. 본 논문은 현장에서 환경 미생물 분석을 위한 두 가지 방법을 제시합니다: 1) 생물학적 추출 필드 키트를 이용한 환경 샘플에서 미생물 DNA를 분리하는 방법, 2) 현장 qPCR 유닛을 통한 DNA 분석.

생물학적 추출 필드 키트와 현장 qPCR 유닛을 이용한 현장 내 미생물 DNA 분석

이 프로토콜은 고래 관찰 선박에서 고래류 환경 DNA(eDNA) 샘플을 수집하는 표준화된 작업 흐름을 설명합니다. 연구자와 훈련된 시민 과학자의 실현 가능성을 우선시하며, 환경 조건, 여과 시간, 탁도, 그리고 실내적 물류가 적용의 실질적 한계를 정의합니다.

고래류 모니터링을 위한 고래 관찰 선박에서 채취한 환경 DNA 샘플

잡초 개체군에서 제초제 저항성을 확인하기 위한 강력하고 유연한 접근 방식이 제시됩니다. 이 프로토콜을 통해 제초제 저항성 수준을 추론하고 약간의 적응으로 광범위한 잡초 종 및 제초제에 적용할 수 있습니다.

다른 잡초 종의 강력한 제초제 저항 테스트를위한 프로토콜

학습하세요 환경 DNA 분석을 위한 종별 정량PCR 분석 설계 및 최적화 방법을. NCBI 데이터베이스 활용, 서열 정렬, 프라이머 설계, 특이성 및 효율성 검증을 포함한 전체 프로토콜을 통해 정확한 종 검출 및 보전 생물학 연구에 활용하세요.

환경 DNA 응용을 위한 종별 정량PCR 분석의 개발 및 시험

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