CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

이 프로토콜을 통해 연구자들은 B 세포에서 유전자를 정밀하게 제거하여 해당 유전자의 기능 상실 효과를 연구하거나 연구 또는 치료 목적으로 사용할 수 있는 안정적인 트랜스 유전자 발현을 위해 트랜스 유전자를 삽입할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 높은 효율로 B 세포를 쉽고 정확하게 엔지니어링할 수 있는 범용 플랫폼을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 B 세포가 재조합 항체 또는 효소를 발현하도록 엔지니어링한 다음 이러한 B 세포를 전달하여 감염을 치료하거나 효소병증을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.

시작하려면 섭씨 37도의 수조에서 B 세포를 해동합니다. 기다리는 동안 예열된 FBS 2밀리리터를 멸균된 15밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. B cell이 완전히 해동되면 즉시 예열된 FBS 1ml를 샘플에 적방울 주입합니다.

실온에서 1분 동안 배양합니다. 부드럽게 피펫팅하여 샘플을 다시 현탁시키고 전체 부피를 2밀리리터의 예열된 FBS가 들어 있는 원뿔형 튜브로 떨어뜨려 옮깁니다. 멸균 PBS로 부피를 15ml로 가져온 다음 튜브를 덮고 두세 번 부드럽게 뒤집습니다.

400배 G에서 5분 동안 샘플을 원심분리한 다음 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버립니다. 펠릿을 1ml의 사전 평형 B-세포 확장 배지로 재현탁시키고 세포를 계수합니다. 총 셀 수는 약 10 내지 7번째 셀이어야 합니다.

세포를 20ml의 사전 평형 B-세포 확장 배지를 함유한 플라스크로 옮깁니다. 세포의 최종 농도는 밀리리터당 5번째 세포에서 약 5배 10이어야 합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 플라스크를 수직으로 배양합니다.

transfection 반응당 1μg의 chemically modified sgRNA와 1.5μg의 chemically modified streptococcus pyogenes Cas9 nucleus mRNA를 혼합하여 CRISPR/Cas9 transfecting 기질을 준비합니다. 제어를 위해 sgRNA 대신 1마이크로리터의 TE 완충액을 8개의 튜브 스트립으로 구성된 0.2ml 튜브에 추가합니다. 전기천공기를 켜고 핵 감염 시약을 준비합니다.

transfection 반응당 100만 개의 B cell을 계수하여 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 멸균 PBS와 400배 G에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 부피를 15ml로 가져옵니다. 원심분리 후 상층액을 버리십시오.

10ml의 멸균 PBS와 원심분리기로 400배 G로 세포를 5분 동안 재현탁시킨 다음 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 완전히 폐기합니다. 세포 펠릿에 B 세포 100만 개당 화학적으로 변형된 GFP mRNA 0.5마이크로그램을 추가합니다. B 세포 100만 개당 20마이크로리터의 일차 세포 형질주입 시약으로 펠릿을 재현탁하고 5-6회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

transfection 반응당 20.5μl를 CRISPR/Cas9 시약이 들어 있는 0.2ml 튜브로 전달합니다. 피펫을 위아래로 한 번 당겨 전체 부피를 혼합하고 transfection 큐벳으로 옮깁니다. 벤치의 큐벳 뚜껑을 덮고 가볍게 두드려 액체가 큐벳 바닥을 덮도록 합니다.

transfection을 위해 electroporator에서 human primary B-cell protocol을 사용합니다. 전기천공된 세포를 큐벳에 넣고 실온에서 15분 동안 휴지시킵니다. 그런 다음 80 μl의 pre-equilibated B-cell expansion medium을 큐벳의 transfection reaction으로 옮깁니다.

큐벳을 조직 배양 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다. 헤드를 몇 번 부드럽게 파이프하여 큐벳에서 샘플의 전체 부피를 혼합하고 1ml의 B 세포 확장 배지가 포함된 48웰 조직 배양 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다. 세포의 최종 농도는 밀리리터당 100만 개의 세포가 되어야 합니다.

유전자 넉인(knock-in) 실험을 수행하여 500, 000 다중의 감염으로 재조합 아데노 관련 6형 바이러스 벡터를 전기천공된 세포를 포함하는 적절한 웰로 전달합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 습도가 있는 5%의 이산화탄소에서 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. knockout 실험에서 B 세포 수는 전기천공 후 24시간 후에 대조군과 CD19 녹아웃 샘플 모두에서 세포 회수율이 약간 감소한 80% 이상의 생존 가능한 세포를 보여주었습니다.

B 세포는 유세포 분석 및 조수 분석을 위해 transfection 후 5일째에 수집되었습니다. 대조군 및 녹아웃 샘플의 대표적인 산점도는 각각 14 및 95% CD19 음성 세포를 보여주었으며, 이는 녹아웃 샘플에서 CD19 발현의 현저한 감소를 보여주었습니다. 게놈 염기서열분석의 크로마토그램은 CD19 knockout B 세포에서 이중 피크를 보여주었으며, 이는 CRISPR/Cas9 매개 이중 가닥 절단 후 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 나타냅니다.

knockout 샘플의 크로마토그래프에 대한 Indel 분석은 CD19 유전자 자리에서 높은 indel 형성 비율을 보여주었으며, 이는 유세포 분석으로 검출된 CD19 단백질 손실 비율과 일치합니다. knock-in 실험의 B 세포는 엔지니어링 후 12일째에 수집되었습니다. 산점도는 RNP와 함께 재조합 아데노 관련 6형 바이러스 벡터를 투여한 샘플에서 EGFP 양성 세포의 64%를 보여주었지만, 대조군 및 벡터만 있는 샘플에서는 EGFP 양성이 각각 관찰되지 않았거나 최소였습니다.

접합부 PCR 증폭은 knock-in 샘플에서 1.5 킬로염기 쌍 앰플리콘을 보여주었으며 대조군 또는 벡터만 있는 샘플에서 PCR 산물이 관찰되지 않았습니다. 세포 계수는 엔지니어링 공정이 대조군 또는 벡터만 있는 샘플보다 knock-in 샘플의 세포 회수에 더 많은 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 그러나 모든 샘플은 엔지니어링 후 3일 이내에 빠르게 회복되었습니다.

이 절차는 또한 B-세포 게놈에서 단일 포인트 돌연변이를 유도하거나 교정하기 위해 단일 염기쌍을 변경하기 위해 염기 편집기 에이전트를 도입하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 조기 정지 코돈을 도입하거나 접합 부위를 변경하여 염색체 전좌의 위험 없이 여러 유전자 녹아웃을 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술이 개발되기 전에는 인간 B 세포를 엔지니어링하기 위해 더 까다로운 다른 유전자 엔지니어링 접근 방식의 사용을 요청했습니다.

이 기술은 더 쉽고 저렴하며 빠른 대안입니다. 또한 임상용으로 세포 치료 제품을 합성하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.