Name: CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9를 이용한 1차 인간 B 세포의 유전자 편집 방법으로 CD19 녹아웃 및 녹인을 수행하고 효율적인 유전자 기능 연구와 B 세포 치료제 개발에 활용하세요.

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이 작품은 어린이 암 연구 기금 (CCRF)과 NIH R01 AI146009에서 B.S.M에 의해 지원되었습니다.

건강한 기증자로부터 류카페레시스 샘플을 현지 혈액 은행에서 수득하였다. 여기에 설명된 모든 실험은 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 연구를 면제하기로 결정하고 미네소타 대학의 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 모든 실험은 멸균/무균 기술과 적절한 생물안전 수준-2 장비로 혈중 병원체에 대한 보편적인 예방 조치에 따라 수행되었습니다.
1. B 세포 확장 매체에 대한 보충제 를 준비
<ol><li>CpG 올리고뉴클레오티드를 1 mg/mL의 농도로 재구성합니다.</li>
	<li>CD40 리간드(CD40L)를 100 μg/mL의 농도로 재구성합니다.</li>
	<li>재구성 인간 IL-10 (rhIL-10) 50 μg/mL의 농도.</li>
	<li>재조합 인간 IL-15(rhIL-15)를 10 μg/mL의 농도로 재구성한다. 참고: 각 보충제를 -20°C ~ -80°C에서 최대 6개월 동안 작은 알리쿼트에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 기저 매질 준비
<ol><li>B 세포 기저 배지를 체외 면역 세포 확장(예를 들어, CTS 면역 세포 SR) 및 1% (v/v) 페니실린 및 연쇄상 구균신을 위한 배지 보충제를 결합합니다.</li>
	<li>0.22 μm 필터 어댑터를 사용하여 기저 배지를 살균 된 병에 필터 로 살균합니다.</li>
	<li>기초 매체를 최대 1개월 동안 4°C로 유지합니다.</li>
</ol>3. B 셀 팽창 매체 준비
<ol><li>5 × 105 세포/mL에서 B 세포를 배양하기 위해 기저 배지의 필요한 양을 멸균 용기로 이송한다.</li>
	<li>1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10, 및 10 ng/mL rhIL-15로 기저 배지를 보충합니다.</li>
	<li>0.22 μm 필터를 사용하여 B 셀 팽창 매체를 필터링합니다.</li>
	<li>37°C에서 조직 배양 인큐베이터에서 B 세포 팽창 배지를 평형화하고, 5%CO2를 사용 전에 최소 30분 동안 습도를 갖는다. 참고: 신선한 B셀 팽창 매체를 준비하여 하루 동안 사용할 수 있습니다. 며칠 동안 사용할 B 셀 팽창 매체를 준비하지 마십시오. 이 미디어 레시피는 메모리 B 세포의 증식과 1차 인간 B 세포의 활성을 장려합니다.</li>
</ol>4. 인간 B 세포 정화 및 확장
참고: 제조업체의 지시에 따라 온도 조절 냉동 용기에 99-100% 이소프로필 알코올을 추가하고 4.1단계를 시작하기 전에 4°C에서 냉동 용기를 식힙니다.
<ol><li>백혈구 샘플에서 PBMC를 분리
	<ol>
<li>백혈병 시료(약 8-10mL)를 멸균 50mL 원추형 튜브로 옮는다.</li>
		<li>멸균 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 35mL로 볼륨을 키우십시오.</li>
		<li>밀도 그라데이션 배지의 15mL에 35mL 백혈병 샘플을 조심스럽게 층.</li>
		<li>500× g에서 25분 동안 브레이크없이 원심분리기, 버피 코트(PBMC 층)를 방해하지 않고 플라즈마 층을 제거하고, 인터페이스에서 PBMC를 수집하고, 새로운 멸균 50mL 원문 튜브로 이송한다.</li>
		<li>PBMC를 50mL로 1배 PBS로 키우세요.</li>
		<li>500 × g의 원심분리기는 브레이크 없이 5분 동안. 빨간색으로 나타날 수 있는 PBMC 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다.</li>
		<li>7mL의 암모늄 염화물 칼륨 용해 버퍼, 파이펫3번을 넣고 잘 섞어 주며, 실온(RT)에서 3분 동안 배양합니다.</li>
		<li>1배 PBS로 50mL로 볼륨을 올래세요.</li>
		<li>400 × g의 원심분리기는 5분 동안 저저항 브레이크를 장착합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. 펠릿은 분홍빛이 도는 또는 흰색으로 보일 것입니다. 참고: 새로 분리된 B 세포를 계속 배양하려면 B 세포 분리(Step 4.2)를 시작하기 전에 B 세포 팽창 매체를 준비한다.</li>
	</ol></li>
	<li>인간 1차 B세포 음성 격리 키트를 사용하여 PBMC로부터의 B세포 절연
	<ol>
<li>격리 버퍼에서 PBMC를 5× 107 셀/mL의 농도로 재연한다. 참고: 총 PBMC 수가 5× 107셀 미만인 경우 격리 버퍼의 부피를 축소하여 5× 10 7셀/mL을 유지합니다. 셀 서스펜션의 최소 및 최대 볼륨은 각각 0.25 mL 및 8 mL입니다.</li>
		<li>최대 8mL(5 × 10 7셀/mL)을 캡이 있는 멸균, 폴리프로필렌, 라운드 하단 튜브로 옮길 수 있습니다.</li>
		<li>50 μL/mL의 칵테일 인핸서를 PBMC에 추가합니다.</li>
		<li>50 μL/mL의 격리 칵테일을 PBMC에 추가하고 튜브를 캡하고 혼합하려면 2-3번 반전합니다.</li>
		<li>5 분 RT에서 인큐베이션; 인큐베이션의 4분에서, 적어도 30 s에 대한 소용돌이 자기 마이크로 비드.</li>
		<li>PBMC 1mL당 자기 마이크로비드 50μL을 옮기고 튜브를 캡하고 혼합하려면 2-3회 반전합니다.</li>
		<li>격리 버퍼로 최대 10mL를 위로 하고 2~3회 위아래로 부드럽게 파이펫을 올로 합니다.</li>
		<li>튜브를 자기 스테이션에 놓고 RT에서 3 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>자석과 튜브를 함께 잡고 한 번의 동작으로 자석과 튜브를 함께 반전하여 세포 현탁액을 새로운 튜브에 붓습니다. 오래된 튜브를 폐기합니다.</li>
		<li>4.2.8을 반복하고(잠복기 시간을 2분으로 줄이면) B세포 현탁액을 깨끗한 원문 튜브에 붓습니다.</li>
		<li>농축된 B 셀은 사용할 준비가 되어 있습니다. 세포가 즉시 사용되는 경우 4.3(인간 B 세포 확장)을 계속합니다. 유동 세포측정(선택 사항)에 의해 격리된 B 세포의 순도를 확인합니다. 사용 전에 세포를 동결해야 하는 경우 4.2.12 단계를 계속합니다.</li>
		<li>B 세포를 동결하려면 원심분리기가 400 g에서 5분 동안 ×, 펠릿을 방해하지 않고 상퍼탄을 폐기한다.</li>
		<li>107 세포/mL에서 동결 배지에서 세포를 다시 중단하고, 알리쿼트 1 mL/극저온.</li>
		<li>냉장 냉동 용기에 냉동 을 놓고 하룻밤 -80 °C에 보관하십시오. 이어서, 냉동 극저온을 액체 질소 탱크로 이송; 냉동 셀을 최대 1년까지 유지합니다. 참고: 격리된 B 셀의 예상 수율은 총 PBMC의 2%-8%이며, 95%-99%의 생존율이 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>인간 B 세포 확장 참고: 새로 분리된 B 셀을 사용하는 경우 4.3.1-4.3.5 단계를 건너뜁니다. 세포를 계산하고 필요한 수의 세포를 멸균 원문 튜브로 옮기고 4.3.6 단계로 계속합니다.<ol>
<li>B 세포를 해동하기 전에 수조에서 전따뜻한 태아 소 혈청 (FBS). B세포 팽창 배지 20mL를 준비하고, T25 플라스크로 이송하고, 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2,습도)에서 배지를 미리 평형화하여 사용하기 최소 15분 전에 준비한다.</li>
		<li>37°C 수조에서 B 세포를 해동합니다. 기다리는 동안, 멸균 15 mL 원문 튜브로 미리 따뜻워진 FBS의 2mL를 전송합니다.</li>
		<li>B 세포가 완전히 해동된 후 즉시 1mL의 미리 따뜻하게 된 FBS를 샘플에 드롭 와이즈로 추가합니다. 1 분 동안 RT에서 인큐베이션.</li>
		<li>부드럽게 파이펫을 사용하여 시료를 다시 중단하고 전체 부피를 드롭와이즈로, 미리 데워진 FBS 2mL가 들어있는 원적 튜브로 옮킨다.</li>
		<li>멸균 1x PBS, 캡으로 15mL로 볼륨을 가져와 튜브를 부드럽게 2-3번 반전시면 됩니다.</li>
		<li>원심분리기 400 × g에서 5분 동안.</li>
		<li>셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리고, 미리 평형된 B 세포 팽창 배지의 1mL로 세포 펠릿을 재보설하고, 세포를 계산한다. 총 세포 수는 약 107개의 세포여야 합니다.</li>
		<li>미리 평형된 B-셀 팽창 배지의 20mL를 포함하는 플라스크로 세포를 전송한다. 세포의 최종 농도는 약 5 x 105 세포/mL이어야 한다.</li>
		<li>플라스크를 조직 배양 인큐베이터에서 수직으로 배양합니다.</li>
		<li>B 세포의 전체 부피를 멸균 원성 튜브로 이송하고 4.3.6-4.3.9 단계를 반복하여 2일마다 확장 배지를 완전히 새로 고칩니다. 참고: T25 플라스크는 10~20mL의 매체를 보유할 수 있습니다. T75 플라스크는 최대 20-60mL의 매체를 보유할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 1차 인간 B 세포 공학
<ol><li>최적의 결과를 위해 확장/활성화 후 48 ± 2h의 엔지니어 B 셀. B세포 팽창 배지, 알리쿼트 1mL의 배지를 48웰 조직 배양 판으로 준비하고, 사용하기 최소 15분 전에 조직 배양 인큐베이터에서 미리 평형화한다. 참고: 관심 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 sgRNA를 설계할 때 아래에 설명된 단계를 따르십시오. - 온라인 도구(11)를사용하여 sgRNAs를 설계합니다. - 단백질의 모든 동소 형태에 공통적인 엑폰에 sgRNA를 디자인합니다. - 평판 좋은 회사에서 화학적으로 변형 된 sgRNA를 주문합니다. - sgRNA는 일반적으로 lyophilized 형태로 온다; 멸균 DNase/RNase-free Tris-EDTA(TE) 버퍼에서 sgRNA를 1 μg/μL의 농도로 재구성합니다.</li>
	<li>화학적으로 변형된 연쇄상 구균 표진 Cas 9(S.p. Cas9) 핵을 트랜스페션 반응당 1.5 μL(1 μg/μL)로 화학적으로 변형한 sgRNA의 1μL(1 μg/μL)을 혼합하여 CRISPR/Cas9 횡단 기판을 준비한다. 제어를 위해 sgRNA 대신 TE 버퍼 1μL을 사용합니다. 참고: CD19 sgRNA유전자 KO 실험에 사용되는 경우, 결과에 대한 그림 2를 참조하십시오. AAVS1 sgRNA가 유전자 KI 실험에 사용되는 경우, 결과에 대한 그림 5를 참조하십시오.<ul>
<li>모든 구성 요소를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ul></li>
	<li>부드럽게 혼합하고 0.2 mL 8 튜브 스트립의 튜브로 반응 당 기판을 변형 CRISPR / Cas9의 2.5 μL을 전송; RT에 따로 설정합니다.</li>
	<li>핵포펙터(electroporator)를 켜고 표 1에도시된 바와 같이 형질 전환 시약을 준비한다. 참고: 필요한 경우 모든 시약을 얼음에 올려 놓음으로써 일시 중지를 위한 좋은 단계입니다. 실험을 다시 시작할 준비가 되면 모든 시약을 얼음에서 제거합니다. S.p. Cas9 단백질을 사용하는 경우, 조사관은 S.p. Cas9 단백질의 5 μg와 1 μg sgRNA를 혼합하여, 거품을 피하고, 최적의 결과를 사용하기 전에 RT에서 혼합물을 배양하여 사전 복합적인 CRISPR/Cas9-sgRNA 리보뉴클레오프로틴을 사용해야 합니다.</li>
	<li>수축 반응당 106B 세포를 멸균 원문 튜브로 카운트 및 이송한다.</li>
	<li>멸균 1x PBS로 15mL로 볼륨을, 원심분리기는 400 × g에서 5분 동안 드물다. 기다리는 동안 1차 세포 형질 전환 시약을 준비하고(표 2)RT에 따로 둡니다.</li>
	<li>셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.</li>
	<li>멸균 10mL의 멸균 1x PBS및 원심분리기의 10mL로 세포 펠릿을 400 g에서 5분 동안 ×.</li>
	<li>셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 완전히 버리십시오.</li>
	<li>106B 세포당 화학적으로 변형된 GFP mRNA(transfection 리포터로서)의 0.5 μg를 세포 펠릿(선택 사항)으로 이송한다.</li>
	<li>106 B 세포 당 20 μL 1 차 세포 형질 전환 시약으로 세포 펠릿을 다시 일시 중단; 5-6회 파이프팅으로 부드럽게 섞으세요. CRISPR/Cas9 경질 기판의 2.5 μL을 포함하는 8튜브 스트립의 0.2 mL 튜브로 경질 반응당 20.5 μL을 전송한다.</li>
	<li>파이펫을 한 번 위아래로 위아래로 사용하여 전체 부피(23 μL)를 배분 큐벳으로 혼합하고 전송합니다. 뚜껑을 덮고 벤치에 있는 큐벳을 가볍게 눌러 액체가 큐벳 바닥을 덮도록 합니다.</li>
	<li>형질 전환에 대한 핵혈에 인간 1 차 B 세포 프로토콜을 사용합니다. 참고: 핵포펙터(electroporator)를 배치하고 조직 배양 후드 외부에 사용할 수 있다. 큐벳을 캡하여 멸균을 보장합니다.</li>
	<li>15 분 동안 RT에서 큐벳에 전기 폴레이션 된 세포를 휴식.</li>
	<li>조직 배양 판에서 구형 B세포 팽창 배지의 80 μL을 큐벳내의 형질 반응으로 옮기다. 조직 배양 인큐베이터에 큐벳을 30분 동안 배치합니다.</li>
	<li>큐벳으로부터 샘플의 전체 부피를 혼합하여 B-세포 팽창 배지의 1mL를 포함하는 48웰 조직 배양 플레이트의 적절한 우물로 몇 번 부드럽게 파이펫을 한다. 세포의 최종 농도는 106 세포/mL이어야 한다.</li>
	<li>유전자 KI 실험을 수행하는 경우, 500,000개의 복합감염에서 rAAV6 벡터를 전기화 세포를 적절히 함유하는 적절한 우물으로 이송(약 45분 전극 후 전자기분). 도 4A에서예제 rAAV6 벡터 구문 어를 참조하십시오. 참고: 예를 들어, 제어 샘플은 CRISPR/Cas9 또는 rAAV6 벡터 없이 전기포게됩니다. 벡터 전용 샘플은 CRISPR/Cas9 없이 전극된 다음 rAAV6 벡터로 변환됩니다. KI 샘플은 CRISPR/Cas9로 전포된 다음 rAAV6 벡터로 변환됩니다. rAAV6에는 HDR용 대상 DSB 사이트의 상류 및 하류에 동생병 이 포함되어야 합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C, 습도가 5%CO2에 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	<li>셀을 계산하고 1 일째 에 생존력을 기록합니다.</li>
	<li>세포를 계산한 다음 세포의 전체 부피를 깨끗한 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 이송하여 2 일마다 B 세포 팽창 배지를 새로 고칩니다. 원심분리기 는 400 × g에서 5 분 동안, 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 폐기하십시오. 신선한 B 세포 팽창 배지의 100 μL로 세포를 다시 중단하고 24웰 조직 배양 판의 우물로 옮김합니다. 5 × 105 세포/mL에서 최종 세포 농도를 달성하기 위해 중간 부피를 키우십시오. 참고 : 48 웰 플레이트는 최대 1 mL 중간 / 우물을 보유 할 수 있습니다; 24웰 플레이트는 최대 2mL 중간/웰을 보유할 수 있습니다. 12웰 플레이트는 최대 4mL 중간/웰을 보유할 수 있으며, 6웰 플레이트는 최대 8mL 중간/웰을 보유할 수 있습니다.</li>
	<li>유동 세포 분석, TIDE 분석 및 접합 PCR과 같은 다운스트림 분석을 수행하기 전에 엔지니어링 된 셀을 최소 5 일 동안 확장할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

M.J.J. K.L., B.S.M를 발명자로 사용하여 게놈 편집 B 세포를 만들고 사용하는 방법에 대한 특허가 출원되었습니다. B.S.M 는 임무소프트의 주식을 컨설턴트로 운영하고 있으며, B.S.M 연구소에서 연구를 후원하고 있습니다.

1차 인간 B 세포에 있는 정확한 게놈 공학은 최근9,10까지도전적이고 있습니다. 우리는 이전에 CRISPR / Cas9를 사용하여 기본 인간 B 세포9을설계하는 프로토콜을 발표했습니다. 여기서는 CD19의 효율적인 KO 또는 노크인 EGFP를 위해 B-셀 격리, 확장 및 엔지니어링을 위한 향상된 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
여기서 우리는 우리의 확장 프로토콜이 7 일(그림 1)에서최대 44 배 의 확장에 대한 배양B 세포의 급속한 확장을 허용한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 Johnson 외9 및 Hung 외. 10에 의해 보고된 것보다 더 빠른 확장...

B 세포는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 림프구 계보의 하위 그룹이다. 그(것)들은 면역 도전1에응하여 항체의 다량을 생성하여 적응성 유머 면역 계통에 있는 중요한 역할을 능력을 발휘합니다. B세포는 또한 기억 B 세포의 전구체이며 말단 분화되고 수명이 긴 혈장 세포로, 지속적인 유머 면역2를제공한다. 플라즈마 세포, 특히, 년 또는 수십 년 동안 생존하는 동안 특정 항체의 다량을 생산하는 능력에 면역 세포 중 고유3. 또한, 말초 혈액으로부터의 분리의 용이성은 B 세포 혈통을 새로운 세포 기반 치료에 대한 우수한 후보로 만든다4.
이전에는 렌티바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포슨을 사용하는 것과 같은 임의의 통합 방법이 트랜스진 전달 및 발현5,6,7,8을위해 B 세포를 설계하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이들 접근법의 비특이적 특성은 B 세포에서 특정 유전자의 생물학적 기능을 연구하기가 어렵게 만들고 치료 환경에서 삽입 돌연변이 발생 및 가변 적인 유전자 발현 및/또는 침묵의 본질적인 위험을 수반한다.
CRISPR/Cas9 시스템은 연구원이 수많은 종의 다양한 세포의 게놈을 정확하게 편집할 수 있는 강력한 게놈 엔지니어링 도구입니다. 최근에는 우리 자신을 포함한 두 그룹이 1차 인간 B 세포의 전 생체 확장 및 표적 게놈 공학을 위한 방법을 성공적으로 개발하였다9,10. 우리는 백혈구 샘플에서 1 차적인 인간 B 세포를 정화하는 과정을 설명할 것입니다. 그 후, 우리는 B 세포 확장 및 격리 된 B 세포의 활성화를위한 업데이트 된 프로토콜을 설명 합니다. 그런 다음 CD19 sgRNA와 함께 CRISPR/Cas9 mRNA를 활성화된 B 세포로 도입하기 위해 전기화에 의한 특정 B 세포 수용체 및 B 세포의 특징인 분화 19(CD19)의 클러스터를 노크하는 과정을 설명할 것입니다.
Cas9 mRNA는 변환되고 CRISPR/Cas9-sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 형성하기 위해 CD19 sgRNA에 결합한다. 이어서, 복합체내의 sgRNA는 Cas9를 이끌고 유전자의 엑슨 2에 대한 표적 서열에서 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. 세포는 뉴클레오티드를 도입하거나 삭제하여 "비 동종 종결합"에 의해 DSB를 복구하여 프레임 시프트 돌연변이로 이어지고 유전자가 기절하게 합니다. 그런 다음 유동 세포측정에 의한 CD19의 손실을 측정하고 분해(TIDE) 분석을 통해 인델 형성을 추적하여 인델 형성을 분석합니다.
그런 다음 CRISPR/Cas9를 재조합 AAV6 벡터(rAAV6, 상동성 지향 수리(HDR)를 위한 기증자 템플릿)을 사용하여 아데노 관련 바이러스 통합 사이트 1(AAVS1) 유전자에서 향상된 녹색형광단백질(EGFP)의 사이트별 삽입을 중재하는 과정을 설명합니다. AAVS1 유전자는 알려진 생물학적 기능 없이 활성 궤적이고 인간 게놈에 AAV 바이러스 통합 부위; 따라서 게놈 공학을 위한 "안전한 항구"로 간주됩니다. 여기서, B 세포의 팽창 및 활성화는 배양7일에서 최대 44배의 확장을 허용했다는 것을보고합니다(그림 1). B 세포의 전기기화는 24시간 후 형질전환에서 전체 세포건강(도 2A)의경미한 감소를 보였다. CD19마커(도 2B)의분산 플롯 분석은 편집된 셀(도2C)에서최대 83% 감소하는 것으로 나타났다.
크로마토그래프(도3A)의조류 분석은 %인델이 혈류 세포측정(도3B)에의한 %의 단백질 손실과 유사하다는 것을 밝혔다. KI 실험의 유동 세포 분석분석은 RNP와 함께 AAV벡터(도 4)를받은 세포가 최대 64% EGFP 양성 세포(도5A)까지표현되고 나중에 접합 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)(도5B)에의해 성공적인 통합을 표시한 것으로 나타났다. 셀 카운트는 모든 샘플이 엔지니어링 후 3일 이내에 신속하게 회수된 것으로나타났습니다(그림 5C).

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 단백질, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>더 작은 크기도 사용 가능</td></tr><tr><td>Amaxa P3 일차 세포 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>암모늄-염화-칼륨 (ACK) 용해 완충액</td><td>품질 생물학</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap 화학적으로 변형된 Cas9 mRNA</td><td>Trilink 생명공학</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>다양한 크기 사용</td></tr><tr><td>가능 Cryostor CS10, 100 mL</td><td>STEMCELL Technology</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep human B cells isolation kit</td><td>STEMCELL Technology</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>엑셀레레이트 B 세포 배지, 무제계 R</td><td>& D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-cell 기초 매체</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11550</td><td>B 세포 전용</td></tr> 해동용 <tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&reg; 개별 돔 캡이 부착된 8-Strip 0.2 mL PCR 튜브</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) 또는 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector 코어 유닛</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40 Ligand</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>동결 세포용</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>더 작은 크기는 또한</td></tr><tr><td>유효합니다 rAAV6 SA-GFP pakaging (우리의 SA-GFP 카세트에, 숫자 4를 보십시오.)</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>대규모 패키징, 1e13 GC/mL, 500mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-10 단백질 250ug</td><td>R& D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>다양한 크기 사용 가능</td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-15 단백질 25 ug</td><td>R& D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>다양한 크기 사용</td></tr><tr><td>가능 Big Easy EasySep 자석</td><td>STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>다양한 크기 사용 가능</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9를 사용하여 1차 인간 b 세포의 게놈 공학

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B 세포는 조혈 줄기 세포에서 파생된 림프구이며 적응성 면역 계통의 유머 팔의 핵심 성분입니다. 그(것)들은 말초 혈액에서 고립의 그들의 용이성 때문에 세포 기지를 둔 치료를 위한 매력적인 후보자, 시험관에서 확장하는 그들의 기능 및 생체 내의 그들의 장수 때문에. 또한, 그들의 정상적인 생물학적 기능-많은 양의 항체를 생산 하는-감염 을 싸우는 재조합 항체 와 같은 치료 단백질의 매우 많은 금액을 표현 하기 위해 활용 될 수 있다, 또는 효소 의 치료를 위한 효소. 여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 1 차인간 B 세포를 격리하고 시험관 내에서 고립된 B 세포를 활성화/확장하는 상세한 방법을 제공합니다. 그런 다음 B 세포에서 내인성 유전자의 사이트 별 KO를 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 데 관련된 단계를 시연합니다. 이 방법은 관심있는 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 다양한 유전자의 효율적인 KO를 허용합니다. 그런 다음 CrispR/Cas9 시스템을 B 세포에서 트랜스진 발현 카세트의 효율적인 현장 별 통합을 위한 재조합, 아데노 관련, 바이러스(rAAV) 벡터와 함께 사용하는 단계를 시연합니다. 이 프로토콜은 유전자의 생물학적 기능뿐만 아니라 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 1 차 인간 B 세포에서 사용할 수 있는 단계별 엔지니어링 플랫폼을 제공합니다.

업데이트된 확장 및 활성화 프로토콜은 7일 만에 최대 44배까지 B 셀의 급속한 확장을 가능하게하였다(그림 1;n=3 기증자). KO 실험에서, Trypan 블루 염색을 이용한 B 세포 수는 24시간 전기포화에서 대조군 과 CD19 KO 샘플 모두에서 세포 회수가 약간 감소하는 80% 이상의 실행 가능한 세포를보였다(도 2A;p ≥ 0.05, n=3 기증자). 이 결과는 전기기분해가 전반적인 B 세포 건강에 약간 영향을 미쳤다는 것을 나타냅니다. B 세포는 유동 세포측정 및 TIDE 분석을 위해 5일째 에 배혈 후 를 수집하였다. 대조군 및 KO 샘플의 대표적인 분산 플롯은 각각 14% 및 95% CD19-음수 세포를나타냈다(도 2B). 유동 플롯의 양은 대조군(도2B;p ≤ 0.0001, n=3 기증자)에 비해 KO...

여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

이 프로토콜을 통해 연구자들은 B 세포에서 유전자를 정밀하게 제거하여 해당 유전자의 기능 상실 효과를 연구하거나 연구 또는 치료 목적으로 사용할 수 있는 안정적인 트랜스 유전자 발현을 위해 트랜스 유전자를 삽입할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 높은 효율로 B 세포를 쉽고 정확하게 엔지니어링할 수 있는 범용 플랫폼을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 B 세포가 재조합 항체 또는 효소를 발현하도록 엔지니어링한 다음 이러한 B 세포를 전달하여 감염을 치료하거나 효소병증을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.시작하려면 섭씨 37도의 수조에서 B 세포를 해동합니다. 기다리는 동안 예열된 FBS 2밀리리터를 멸균된 15밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. B cell이 완전히 해동되면 즉시 예열된 FBS 1ml를 샘플에 적방울 주입합니다.실온에서 1분 동안 배양합니다. 부드럽게 피펫팅하여 샘플을 다시 현탁시키고 전체 부피를 2밀리리터의 예열된 FBS가 들어 있는 원뿔형 튜브로 떨어뜨려 옮깁니다. 멸균 PBS로 부피를 15ml로 가져온 다음 튜브를 덮고 두세 번 부드럽게 뒤집습니다.400배 G에서 5분 동안 샘플을 원심분리한 다음 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버립니다. 펠릿을 1ml의 사전 평형 B-세포 확장 배지로 재현탁시키고 세포를 계수합니다. 총 셀 수는 약 10 내지 7번째 셀이어야 합니다.세포를 20ml의 사전 평형 B-세포 확장 배지를 함유한 플라스크로 옮깁니다. 세포의 최종 농도는 밀리리터당 5번째 세포에서 약 5배 10이어야 합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 플라스크를 수직으로 배양합니다.transfection 반응당 1μg의 chemically modified sgRNA와 1.5μg의 chemically modified streptococcus pyogenes Cas9 nucleus mRNA를 혼합하여 CRISPR/Cas9 transfecting 기질을 준비합니다. 제어를 위해 sgRNA 대신 1마이크로리터의 TE 완충액을 8개의 튜브 스트립으로 구성된 0.2ml 튜브에 추가합니다. 전기천공기를 켜고 핵 감염 시약을 준비합니다.transfection 반응당 100만 개의 B cell을 계수하여 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 멸균 PBS와 400배 G에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 부피를 15ml로 가져옵니다. 원심분리 후 상층액을 버리십시오.10ml의 멸균 PBS와 원심분리기로 400배 G로 세포를 5분 동안 재현탁시킨 다음 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 완전히 폐기합니다. 세포 펠릿에 B 세포 100만 개당 화학적으로 변형된 GFP mRNA 0.5마이크로그램을 추가합니다. B 세포 100만 개당 20마이크로리터의 일차 세포 형질주입 시약으로 펠릿을 재현탁하고 5-6회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.transfection 반응당 20.5μl를 CRISPR/Cas9 시약이 들어 있는 0.2ml 튜브로 전달합니다. 피펫을 위아래로 한 번 당겨 전체 부피를 혼합하고 transfection 큐벳으로 옮깁니다. 벤치의 큐벳 뚜껑을 덮고 가볍게 두드려 액체가 큐벳 바닥을 덮도록 합니다.transfection을 위해 electroporator에서 human primary B-cell protocol을 사용합니다. 전기천공된 세포를 큐벳에 넣고 실온에서 15분 동안 휴지시킵니다. 그런 다음 80 μl의 pre-equilibated B-cell expansion medium을 큐벳의 transfection reaction으로 옮깁니다.큐벳을 조직 배양 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다. 헤드를 몇 번 부드럽게 파이프하여 큐벳에서 샘플의 전체 부피를 혼합하고 1ml의 B 세포 확장 배지가 포함된 48웰 조직 배양 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다. 세포의 최종 농도는 밀리리터당 100만 개의 세포가 되어야 합니다.유전자 넉인(knock-in) 실험을 수행하여 500, 000 다중의 감염으로 재조합 아데노 관련 6형 바이러스 벡터를 전기천공된 세포를 포함하는 적절한 웰로 전달합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 습도가 있는 5%의 이산화탄소에서 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. knockout 실험에서 B 세포 수는 전기천공 후 24시간 후에 대조군과 CD19 녹아웃 샘플 모두에서 세포 회수율이 약간 감소한 80% 이상의 생존 가능한 세포를 보여주었습니다.B 세포는 유세포 분석 및 조수 분석을 위해 transfection 후 5일째에 수집되었습니다. 대조군 및 녹아웃 샘플의 대표적인 산점도는 각각 14 및 95% CD19 음성 세포를 보여주었으며, 이는 녹아웃 샘플에서 CD19 발현의 현저한 감소를 보여주었습니다. 게놈 염기서열분석의 크로마토그램은 CD19 knockout B 세포에서 이중 피크를 보여주었으며, 이는 CRISPR/Cas9 매개 이중 가닥 절단 후 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 나타냅니다.knockout 샘플의 크로마토그래프에 대한 Indel 분석은 CD19 유전자 자리에서 높은 indel 형성 비율을 보여주었으며, 이는 유세포 분석으로 검출된 CD19 단백질 손실 비율과 일치합니다. knock-in 실험의 B 세포는 엔지니어링 후 12일째에 수집되었습니다. 산점도는 RNP와 함께 재조합 아데노 관련 6형 바이러스 벡터를 투여한 샘플에서 EGFP 양성 세포의 64%를 보여주었지만, 대조군 및 벡터만 있는 샘플에서는 EGFP 양성이 각각 관찰되지 않았거나 최소였습니다.접합부 PCR 증폭은 knock-in 샘플에서 1.5 킬로염기 쌍 앰플리콘을 보여주었으며 대조군 또는 벡터만 있는 샘플에서 PCR 산물이 관찰되지 않았습니다. 세포 계수는 엔지니어링 공정이 대조군 또는 벡터만 있는 샘플보다 knock-in 샘플의 세포 회수에 더 많은 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 그러나 모든 샘플은 엔지니어링 후 3일 이내에 빠르게 회복되었습니다.이 절차는 또한 B-세포 게놈에서 단일 포인트 돌연변이를 유도하거나 교정하기 위해 단일 염기쌍을 변경하기 위해 염기 편집기 에이전트를 도입하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 조기 정지 코돈을 도입하거나 접합 부위를 변경하여 염색체 전좌의 위험 없이 여러 유전자 녹아웃을 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술이 개발되기 전에는 인간 B 세포를 엔지니어링하기 위해 더 까다로운 다른 유전자 엔지니어링 접근 방식의 사용을 요청했습니다.이 기술은 더 쉽고 저렴하며 빠른 대안입니다. 또한 임상용으로 세포 치료 제품을 합성하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 인간 T 세포에서 유전자 편집을 수행하는 방법을 보여줍니다. 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체와 결합되어 knockout을 위한 특정 유전자를 표적으로 합니다. 전기천공법(electroporation) 시 sgRNA는 Cas9을 타겟 DNA 염기서열로 유도하여 정밀한 절단을 생성합니다. 그런 다음 이러한 절단은 세포의 비상동 말단 결합 메커니즘에 의해 복구되어 유전자 녹아웃으로 이어집니다.

T 세포의 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

B세포 치료제 연구를 위해 CRISPR/Cas9 및 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6을 이용하여 일차 붉은털원숭이 B세포를 배양하고 유전자를 편집하는 방법을 제시합니다.

일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집

이 프로토콜은 시험관내에서 조립되고 전기천공법으로 전달되는 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포에서 게놈 편집 절차를 설명합니다.

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

배우세요 CRISPR/Cas9를 이용한 1차 인간 B 세포의 유전자 편집 방법으로 CD19 녹아웃 및 녹인을 수행하고 효율적인 유전자 기능 연구와 B 세포 치료제 개발에 활용하세요.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

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