샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입
November 17th, 2020
이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.
표적 돌연변이 유발은 최근에야 모래파리에 적용되었으며 이러한 매개체 곤충에서 관심 유전자의 역할과 기능을 이해하는 데 중요한 기술입니다. 배아 미세주입은 곤충 게놈 편집에서 매우 중요한 단계이지만, 우리의 경우 모래파리와 같은 작업을 하고 있는 종에 맞게 조정해야 합니다. 다른 곤충 종에 비해 모래 파리 배아는 매우 작습니다.
개발하는 데 오랜 시간이 걸리고 특히 습도 수준에 민감합니다. 주사 5일 전, 일상적인 군체 유지 관리를 위해 암컷 모래파리에게 혈액을 공급합니다. 먹이를 먹은 다음 날, 피를 먹은 암컷을 100-150마리의 그룹으로 측면 포트가 있는 석고 꼬투리로 포획하고 파리에게 30% 자당 용액을 먹입니다.
혈액 수유 후 5일째 되는 날, 촉촉한 흰색 여과지 조각을 알을 낳는 방에 넣습니다. 그리고 입 흡입기를 사용하여 석고 포드에서 약 10마리의 암컷을 모아 알을 낳는 방으로 옮깁니다. 30-60분 후 에깅 챔버에서 페트리 접시와 여과지를 제거합니다.
이를 관리하면 여과지는 촉촉한 상태를 유지하고 이 기간 동안 새로운 그룹의 암컷과 배아를 계속 수집합니다. 모든 배아를 채취한 후, 실체 현미경과 매우 미세한 페인트 브러시를 사용하여 약 50개의 배아를 축축한 검은색 여과지 조각에 조심스럽게 옮기고, 슬라이드당 하나의 커버 슬립을 얹은 현미경 슬라이드에 놓습니다. 각 여과지에 충분한 물을 추가하여 배아가 떠오르거나 커버 슬립 아래로 빨려 들어가지 않도록 촉촉하게 유지하고 배아를 커버 슬립에 맞춥니다.
난자 채취를 시작한 지 2-3시간 후에 해부 현미경 아래에 슬라이드를 놓고 페인트 브러시를 사용하여 여과지 뒤쪽 끝에 물을 조심스럽게 추가합니다. 0.5-1 마이크로 리터의 하중 주입 혼합물을 마이크로 주입 바늘에 다시 로드하고 바늘을 현미경 아래 압력의 평방 인치당 30파운드로 설정된 공압 주입 컨트롤러에 장착합니다. 방아쇠를 눌러 바늘 끝에서 공기를 배출합니다.
공기가 방출되면 유지 압력을 천천히 높입니다. 주입 물질이 흐르기 시작하면 바늘에서 흐르는 주입 혼합물 지점 바로 아래가 될 때까지 유지 압력을 낮추고 바늘을 첫 번째 배아의 측면에 삽입합니다. 배아 뒤에 있는 커버 슬립을 백 스톱으로 사용하여 바늘을 부드럽게 제거하기 전에 소량의 주입 혼합물을 배아에 전달합니다.
바늘을 제거한 직후 주입기를 눌러 바늘 끝에서 다시 채워진 물질을 제거하고 다음 배아로 진행합니다. 모든 배아가 주입되면 주입된 배아의 수를 세어 실행 집계를 유지하고 덮개 슬립이 뜨도록 여과지에 물을 추가합니다. 그런 다음 프로브를 사용하여 여과지를 제자리에 고정하고 커버 슬립을 배아에서 당겨 빼냅니다.
그리고 그는 슬라이드에서 여분의 물을 닦아내기 위해 여과지였습니다. 여과지를 새 페트리 접시에 담긴 촉촉한 여과지 더미로 옮기고 각 배아를 붐비지 않고 축축한 작은 크기의 석고 포드에 수동으로 옮깁니다. 그런 다음 포드를 스크린으로 덮고 포드를 70% 습도의 26도 인큐베이터에 보관합니다.
가장 성공적인 미세주입 프로토콜과 마찬가지로, 주사되는 배아에 적합한 좋은 미세주사 바늘이 중요합니다. 좋은 날카로운 바늘은 주입 후 물질이 빠져나가지 않고 배아를 쉽게 관통할 수 있습니다. 당겨진 바늘에는 너무 긴 테이퍼가 없어야 합니다.
그렇지 않으면 테이퍼의 주요 부분에서 바늘의 루멘이 매우 좁아져 바늘을 통해 재료를 강제로 통과시킬 수 있을 만큼 사출 압력을 높게 얻기가 어려워집니다. 주입 후 양육된 건강한 배아는 보존해야 하며, 손상된 곰팡이, 오염, 건조 또는 변형된 배아는 폐기해야 합니다. 잠재적인 돌연변이 대립유전자는 예상되는 절단 부위 주변 영역의 PCR 분석을 통해 주입 후 사육된 개체에서 확인할 수 있습니다.
주입된 배아를 사용하여 돌연변이 계통을 확립한 후, 유전형 분석 PCR을 통해 동형접합 돌연변이 형제 교배를 식별할 수 있습니다. 배아를 부드럽게 조작하고 주입하기 위해서는 좋은 바늘을 갖는 것이 필수적입니다. 그리고 전체 절차에 걸쳐 배아가 수분이 공급되도록 합니다.
일부 파리의 게놈 편집은 이제 막 시작되었을 뿐입니다. 이 기술은 실제로 더 복잡한 게놈 변형 전략이 뒤따라야 하는 첫 번째 단계입니다.
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개요
이 프로토콜은 유충 수집, 주사, 곤충 사육, 돌연변이 식별 등을 포함하여 모래파리에서의 CRISPR/Cas9 표적 돌연변이 유도의 단계를 상세히 설명합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 유전자 공학
- 곤충 생물학
- 벡터 관리
배경
- 표적 돌연변이 유도는 모래파리에서 유전자 기능을 이해하는 데 중요합니다.
- 배아 미세주사는 게놈 편집의 중요한 단계입니다.
- 모래파리 배아는 작고 습도에 민감합니다.
- 모래파리의 적절한 사료 및 유지 관리는 성공적인 실험을 위해 필수적입니다.
연구 목적
- 모래파리에서의 CRISPR/Cas9 기술 사용을 적응시키는 것.
- 벡터 곤충에서 특정 유전자의 역할을 조사하는 것.
- 곤충 게놈 편집 방법을 개선하는 것.
사용된 방법
- 모래파리로부터 배아 수집.
- CRISPR/Cas9 구성 요소의 미세주사.
- 주사된 곤충의 사육.
- 돌연변이의 식별 및 선택.
주요 결과
- 모래파리에서의 CRISPR/Cas9 성공적인 적응.
- 효과적인 배아 미세주사 프로토콜 설정.
- 목표 유전자에서의 관심 돌연변이 식별.
- 벡터 생물학에서 유전자 기능에 대한 통찰력.
결론
- CRISPR/Cas9는 모래파리에서의 유전자 연구를 위한 타당한 도구입니다.
- 방법론적 적응은 다른 곤충 종에 대해 필요합니다.
- 이 연구는 벡터 유전학에 대한 우리의 이해를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
CRISPR/Cas9-mediated embryo microinjection in Phlebotomus papatasi enables precise, heritable gene editing in a key disease vector, addressing a longstanding bottleneck in vector biology. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for genes influencing vector competence and pathogen transmission. The method positions sand fly genetics for integration into early discovery and translational research pipelines relevant to infectious disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of genes implicated in vector competence and immune response.
- Supports biological de-risking by generating stable, heritable loss-of-function alleles.
- Facilitates predictive confidence in target selection for vector-borne disease interventions.
Screening & Assay Development
- Provides genetically defined sand fly lines for downstream phenotypic screening of vector-pathogen interactions.
- Standardizes genetic backgrounds, improving reproducibility and assay comparability.
- Enables quantitative assessment of gene function through PCR-based genotyping and phenotypic analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vector genetic models with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from gene discovery to preclinical validation of vector-targeted interventions.
- Reduces risk in advancing vector control strategies by enabling mechanistic studies in a natural disease vector.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling the generation of genetically modified sand fly lines for hypothesis-driven studies.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in vector competence.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined models for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative PCR-based genotyping to confirm targeted mutagenesis.
- Translational Research: Bridges basic vector biology with translational studies on disease transmission.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative gene function studies in sand flies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vector biology and target validation.
- Operational Value: Standardizes genetic manipulation in a previously intractable vector species.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for vector-targeted R&D programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vector control and transmission-blocking strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and sand fly colony maintenance.
- Demands specialized instrumentation for embryo handling and injection.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for other non-model vector species.
- Embryo viability and humidity sensitivity impose practical throughput limitations.
