Name: 수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 학습하세요 인간 망막 안료 상피 세포에서 과산화수소를 이용한 산화 스트레스 유도 및 항산화 효과 분석 방법을. 이 기법은 신경망막 퇴행성 질환 치료 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 훌륭한 기술 지원에 대한 그레그 실리와 알레인 콘티와 베를린의 맥스 델브뤼크 센터에서 교수 Zsuzsanna 이즈바크에게 감사하고 싶습니다 pSB100X 및 pT2-CAGGS-비너스 플라스미드를 친절하게 제공합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단과 유럽 위원회가 제7 프레임 워크 프로그램의 맥락에서 지원되었습니다. Z.I는 유럽 연구 위원회, ERC 고급 [ERC-2011-ADG 294742]에 의해 투자되었다.

<ol><li>Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+ARPE-19+cultures%3A+Do+melanosomes+confer+cytoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection.</a> Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).</li>
<li>Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+macular+carotenoid+lutein+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells.</a> Antioxidants. 6 (4), (2017).</li>
<li>Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+current+and+future+management+of+geographic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Review of current and future management of geographic atrophy.</a> Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).</li>
<li>Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Interventions+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Recent developments in age-related macular degeneration: a review.</a> Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).</li>
<li>Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complement+membrane+attack+complex+in+dry+and+wet+AMD+-+From+hypothesis+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials.</a> Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).</li>
<li>Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and reactive oxygen species.</a> Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Alhasani, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gypenosides+protect+retinal+pigment+epithelium+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress.</a> Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).</li>
<li>National Institute of Health. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics">https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics</a> (2020).</li>
<li>Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).</li>
<li>He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+improves+mitochondrial+function+in+RPE+cells+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).</li>
<li>Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytokine+profiles+of+human+retinal+pigment+epithelium%3A+Oxidant+injury+and+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence.</a> Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).</li>
<li>Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+expression+affects+the+oxidative+and+inflammatory+state+of+choroidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells.</a> Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).</li>
<li>Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolato%2C+F+%22Retinal+Degenerative+Diseases%22">Retinal Degenerative Diseases</a>. , Springer. 699-706 (2016).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+the+ERK1%2F2+pathways+and+protects+injured+retinal+ganglion+cells+from+induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death.</a> Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+protects+rat+photoreceptors+from+death+by+activating+the+SRC-dependent+signalling+and+elevating+anti-apoptotic+factors+and+neurotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archives+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins.</a> Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).</li>
<li>Thumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+PEDF-expressing+primary+pigment+epithelial+cells+by+the+SB+transposon+system+delivered+by+pFAR4+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).</li>
<li>Garcia-Garcia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+PEDF+release+in+rat+iris+and+retinal+epithelial+cells+after+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+and+neurogenic+activities+of+Sleeping+Beauty-mediated+PEDF-transfected+RPE+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+H2O2-%2C+HNE-%2C+or+tBH-treated+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).</li>
<li>Allen, R. G., Tresini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and gene regulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).</li>
<li>Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+H2O2+induce+catalase+and+metallothionein+gene+expression+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).</li>
<li>Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide in the human body.</a> FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).</li>
<li>Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+correlation+between+the+levels+of+ascorbic+acid+and+H2O2+in+aqueous+humor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor.</a> Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).</li>
<li>Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KGF+prevents+oxygen-mediated+damage+in+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).</li>
<li>Campochiaro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+gene+transfer+of+endostatin%2Fangiostatin+for+macular+degeneration+%28GEM%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study.</a> Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).</li>
<li>Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+affects+retinal+pigment+epithelial+cell+survival+through+epidermal+growth+factor+receptor%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway.</a> International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).</li>
<li>Tu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allicin+attenuates+H2O2+-+induced+cytotoxicity+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+by+regulating+the+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species.</a> Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).</li>
<li>Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piceatannol+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+hydrogen+peroxide+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+through+modulating%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating.</a> Nutrients. 11, 1-13 (2019).</li>
<li>Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+causes+significant+mitochondrial+DNA+damage+in+human+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells.</a> Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+uncoupling+protein+2+attenuates+salt-induced+vascular+dysfunction+by+inhibition+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress.</a> American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li>
<li>Mátés, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html">https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html</a> (2020).</li>
<li>Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx">https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx</a> (2020).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%5E%28-%CE%94%CE%94CT%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).</li>
<li>Bascuas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-virally+transfected+primary+human+pigment+epithelium+cells+overexpressing+the+oxidative+stress+reduction+factors+PEDF+and+GM-CSF+to+treat+retinal+neurodegeneration+neurodegenerationl%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).</li>
<li>Zhuge, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fullerenol+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+stress-induced+premature+senescence+via+activating+SIRT1%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).</li>
<li>Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+H2O2+Availability+to+ARPE-19+cultures+in+models+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+oxidative+stress+via+upregulation+of+UCP2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).</li>
<li>Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCP2%2C+a+mitochondrial+protein+regulated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 어떤 putative 유익한 유전자로 전염되는 세포에 적용될 수 있는 전감염된 세포에 의해 생성된 PEDF 및 GM-CSF의 산화 및 보호 기능을 분석하는 접근법을 제안합니다. 유전자 변형 세포를 이식하여 조직에 단백질을 전달하는 것을 목표로 하는 유전자 치료 전략에서, 단백질 발현의 수준, 발현의 장수 및 질병의 모델에서 발현 된 단백질의 효과에 대한 정보를 얻는 것이 중요하다. 우리의 실험실에서, 여기에서 제시된 프로토콜은 aAMD6의병기발생에 있는 중요한 요소로 가설된 산화 스트레스에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 효과를 정의하는 데 유용했습니다6,7. 구체적으로, 우리는 SB100X-매개 PEDF /GM-CSF-전동 1 차 hRPE 세포의 산화 효과를 정의하는 프로토콜을 사용했다. 몇몇 조사자들은H2O2가 산화 스트레스의 중요한 증상을 ...

여기에 설명된 모델은 세포의 산화 스트레스를 줄이기 위한 바이오 의약품 제제의 효율성을 평가하는 유용한 접근법을 제공합니다. 우리는 H2O2-매개산화 용 안료 상피 세포에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 보호 효과를 조사하기 위해 모델을 사용했으며, 이는 높은 수준의 O2에노출되며, 가시광선, 광수용체 외부 세그먼트 멤브레인의 phagocytosis를 통해 반응성 산소 종(ROS)1, 1, 1, 1 2. 그(것)들은 혈관 나이 관련 황반 변성의 병인에 중요한 기여자로 간주됩니다 (aAMD)3,4,5,6,7,8. 게다가, RPE 합성 신경 보호 인자, 특히 안료 상피 유래 인자 (PEDF), 인슐린 과같은 성장 인자 (IGFs), 및 과립구 대식세포 -콜로니 자극 인자 (GM-CSF)가 RPE 세포의 기능 장애 및 손실로 이어지는후, 광수용체 및 망막 갱셀(R) 세포3,4GC세포(RGC) . AMD는 대사, 기능성, 유전적 및 환경적 요인4사이의 상호 작용에서 발생하는 복잡한 질환이다. aAMD에 대한 치료의 부족은 선진국9,10에서60 세 이상의 환자에서 실명의 주요 원인입니다. PEDF및 GM-CSF를 과도하게 발현하는 유전자 변형 RPE 세포의 피하 이식에 의한 신경보호 및 신경성 망막 환경의 재구성은 산화 스트레스의 효과를 완화하고 염증을 억제하고 세포생존11,12,13, 14,14, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15,15,1 . 세포에 유전자를 전달하는 몇 가지 방법론이 있지만, 우리는 그 안전 프로필, 숙주 세포의 게놈에 유전자의 통합, 그리고 우리가이전에보여 준 바와 같이 비 전사 활성 사이트에 전달 된 유전자를 통합하는 성향 때문에 RPE 세포에 PEDF 및 GM-CSF 유전자를 제공하기 위해 비 바이러스 성 활동적인 수면 뷰티 트랜스포슨 시스템을선택했습니다. 18,19.
세포 산화 스트레스는 과산화수소(H2O2),4-하이드로이네날(HNE), 테르부틸하이드로산화물(tBH), 높은 산소 장력, 가시광선(전체 스펙트럼 또는 UV 조사)20,21을포함한 여러 산화제에 의해 시험관내에서 배양되는 세포에서 유도될 수 있다. 높은 산소 장력과 빛은 다른 시스템으로의 전송 가능성을 제한하는 특수 장비 와 조건이 필요합니다. H2O2,HNE 및 tBH와 같은 제제는 겹치는 산화 스트레스 분자 및 세포 변화를 유도한다. 우리는 포토수용체 외부 세그먼트 phagocytosis(22)에서 반응성 산소 중간체로서 RPE 세포에 의해 생성되기 때문에 편리하고 생물학적으로 관련성이 있기 때문에 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 활성을테스트하기 위해 H2O2를 선택했으며 생체내안구 조직에서 발견된다. 글루타티온의 산화는 눈에 H2O2의 생산에 부분적으로 책임이 있을 수 있기 때문에, 우리는 H2 O2-유도산화스트레스및세포의 재생 능력에 연결되는 우리의 연구에서 GSH/글루타티온의 수준을 분석하였다21,22. 글루타티온 수준의 분석은 눈24의산화 방지 메커니즘에 참여하기 때문에 특히 관련이 있다. H2O2에노출되는 것은 RPE 세포의 산화 스트레스 감수성 및 항산화활성을검사하기 위한 모델로 자주 사용되며, 또한, 광유발 산화 스트레스 손상, 산화 스트레스21의"생리적" 원인과 유사성을 나타낸다. 
신경 보호 요인의 기능성과 효과를 평가하기 위해, 우리는 분석이 PEDF와 GM-CSF를 과발현하기 위하여 유전자 변형된 세포에 의해 표현된 성장 인자의 산화 효과를 정량화하는 분석을 허용하는 시험관 내 모형을 개발했습니다. 여기서, 우리는 PEDF및 GM-CSF에 대한 유전자와 함께 전염된 RPE 세포가 세포 형태, 밀도, 생존성, 글루타티온의 세포내 수준 및 UCP2 유전자의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 비과감염 대조구 세포보다 H2O2의 유해한 영향에 더 저항력이 있음을 보여주며, 이는 미토콘드리아 분리 단백질(ROS31)에 대한 코드로 인해31종의산소를 감소시키는 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>96웰 배양 플레이트는 흰색이며 바닥이 투명하고 평평합니다.</td><td>Costar</td><td>3610</td>은 <td>발광 (GSH-Glo Assay)을 측정하기 전에 세포를 확인할 수 있습니다.</td></tr> <tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>아크릴아미드 40%</td><td>Biorad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>AMIMED</td><td>4-05F00-H</td><td></td></tr><tr><td>항체 항-GMCSF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PA5-24184</td><td></td></tr><tr><td>항체 항-마우스 IgG/IgA/IgM&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>항체 항-PEDF&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-390172</td><td></td></tr><tr><td>항체 항펜타-그의&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>항체 anti-phospho-Akt</td><td>세포 신호 기술</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>항체 anti-rabbit IgG H& L-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>항체 당나귀 안티-토끼 Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>항체 염소 안티-마우스 Alexa 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>ARPE-19 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>챔버 배양 유리 슬라이드</td><td>Corning</td><td>354118</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo 세포 독성 분석&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/햄의 F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>듀오 세트 ELISA 키트</td><td>R& D 시스템&nbsp;</td><td>DY215-05</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>ELISAquant kit</td><td>BioProducts MD</td><td>PED613-10-Human</td><td></td></tr><tr><td>Eyes (human)</td><td>Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>플루오로마운트 수성 마운팅 미디엄</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>플루오스타 오메가 플레이트 리더&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 소프트웨어(버전 8.0)</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH-Glo 글루타티온 분석</td><td>Promega</td><td>V6912</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어 (이미지 처리 프로그램)</td><td>W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997&ndash; 2014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미다졸&nbsp;</td><td>Axonlab</td><td>A1378.0010</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI4000B 현미경&nbsp;</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td></td><td></td></tr>즈 <tr><td>LightCycler 480 기기 II&nbsp;</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SW1.5.1 소프트웨어</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Axonlab</td><td>3468.1000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System 10 &마이크로; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 챔버</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 슈퍼플로우&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-3197</td><td></td></tr><tr><td>Omega Lum G Gel 이미징 시스템</td><td>Aplegen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quantabio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>프라이머&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td></td><td>보충 자료</td></tr><tr><td>pSB100X(250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute; t&eacute; S 외, 2009. Zsuzsanna Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF 교수 제공-His 플라스미드 DNA(250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>문헌[Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796]에 보고된 기존 pT2-CMV-PEDF-EGFP 플라스미드를 사용하여 구축하였다.</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His 플라스미드 DNA(250ng/&마이크로; L)</td><td></td><td></td><td>문헌[Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796]에 보고된 기존 pT2-CMV-PEDF-EGFP 플라스미드를 사용하여 구축하였다.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 미니 키트</td><td>QIAGEN</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>재조합 hGM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>재조합 hPEDF&nbsp; &nbsp;</td><td>BioProductsMD</td><td>004-096</td><td></td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA 세포 미니프렙 시스템</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase 세트</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>반건조 전사 WB를 위한 시스템&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperMix qScript</td><td>Quantabio</td><td>95048-025</td><td></td></tr><tr><td>트리스 완충 식염수(TBS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>AppliChem&nbsp;</td><td>A1390</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL HRP 기판</td><td>Advansta</td><td>K-12045-D50</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Chemie Brunschwig</td><td>MNSC04530301</td><td></td></tr></tbody></table>

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

산화 스트레스는 전 세계적으로 3천만 명의 환자에게 영향을 미치는 병리학인 노화 관련 황반 변성(AMD)을 포함한 여러 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 망막 색소 상피(RPE)-합성 신경보호인자, 예를 들어, 안료 상피 유래 인자(PEDF) 및 과립세포-대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF)의 감소로 이어지며, 결국 광수용체 및 망막 갱셀(RGC)의 손실로 이어진다. 우리는 PEDF와 GM-CSF를 과발현하는 과발뇌형 RPE 세포의 감속 이식에 의한 신경보호 및 신경성 망막 환경의 재구성이 산화 스트레스의 효과를 완화하고 염증을 억제하며 세포 생존을 지원함으로써 망막 변성을 예방할 수 있는 잠재력을 가지고 있다고 가설합니다. 수면미트랜스포손 시스템(SB100X)을이용하여 인간 RPE 세포는 PEDF 및 GM-CSF 유전자에 감염되어 qPCR, 서부 블롯, ELISA 및 면역불률을 이용한 안정적인 유전자 통합, 장기 유전자 발현 및 단백질 분비를 보였다. 전감염된 RPE 세포에 의해 분비된 PEDF 및 GM-CSF의 기능성 및 효능을 확인하기 위해, 배양시 RPE 세포에 대한H2O2-유도산화 스트레스의 감소를 정량화하기 위한 시험관 내 분석서를 개발하였다. 세포 보호는 세포 형태학, 밀도, 글루타티온의 세포 내 수준, UCP2 유전자 발현 및 세포 생존가능성을 분석하여 평가하였다. 둘 다, PEDF 및/또는 GM-CSF 및 세포를 과도하게 발현하는 전감염된 RPE 세포는 비감염되었지만 PEDF 및/또는 GM-CSF(소판 또는 전감염된 세포로부터 정수)로 전처리된 비처리 대조군과 비교하여 상당한 항산화 세포 보호를 보였다. 본H2O2-모델은AMD 또는 이와 유사한 신경퇴행성 질환을 치료하는 데 효과적일 수 있는 요인의 항산화 효과를 평가하는 간단하고 효과적인 접근법이다.

인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스유도 ARPE-19 및 1차 hRPE 세포는 24시간 동안H2 O2의다양한 농도로 처리되었고 항산화 글루타티온의 세포내 수준을 정량화하였다(도2A,B). H2O2 앳 50 μM 및 100 μM은 글루타티온 생산에 영향을 미치지 않았지만 350 μM에서는 ARPE-19 및 1차 hRPE 세포에서 글루타티온이 현저히 감소했습니다. 세포독성 분석 결과 350μM은 세포 생존율이 현저한감소(도 2C)를유발하는H2 O2의가장 낮은 농도를 보였다. 형태학적으로,H2 O2로처리된 ARPE-19 세포는H2</...

우리는 H 2O2로망막 색소 상피 세포를 치료하여 세포 형태, 생존가능성, 밀도, 글루타티온 및 UCP-2 수준의 개발 및 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 신경망 변성을 치료하기 위해 트랜스포슨-감염된 세포에 의해 분비되는 단백질의 항산화 효과를 조사하는 데 유용한 모델이다.

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

과산화수소 모델은 노화 관련 황반 변성 또는 유사한 신경 퇴행성 질환을 치료하는 데 유용할 수 있는 인자의 항산화 효과를 평가하기 위한 간단하고 효과적인 접근 방식입니다. 산화제인 과산화수소는 단일 펄스로 전달되므로 과산화수소 처리를 며칠 동안 반복해야 하는 모델보다 더 빠르고 간단하게 수행할 수 있습니다. 파종된 세포의 수는 치료의 산화 효과에 영향을 미치기 때문에 배양 전에 세포를 주의 깊게 세는 것이 중요합니다.이 절차를 시연하는 사람은 가브리엘 투만(Gabriele Thumann) 실험실의 박사 후 연구원인 타이스 바스쿠아스(Thais Bascuas)입니다. 컨디셔닝 배지 준비의 경우, PEDF, GM-CSF 또는 둘 다로 transfection한 후 28일 후에 완전 배지 농도의 밀리리터당 500,000개 세포에서 human ARPE-19 세포주 T-75 플라스크를 시딩합니다. 세포가 약 80% 포화도에 도달하면 상등액을 새로운 완전한 배지로 교체하고 24시간 후에 새로운 상등액을 수집합니다.히스티딘 태그가 붙은 GM-CSF 및 PEDF 단백질을 정제하기 위해 상층액을 원심분리하여 잠재적인 잔여 세포를 제거하고 샘플을 따로 보관합니다. 다음으로, 30 밀리리터 튜브에 1.5 마이크로 리터의 니켈 NTA 용액을 추가합니다. 원심분리 후 니켈 NTA 플로우 스루를 버리고 세척당 200마이크로리터의 1X 배양 버퍼로 펠릿을 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후, 펠릿을 40마이크로리터의 4X 배양 완충액과 900마이크로리터의 원심분리된 컨디셔닝된 배지에 다시 현탁시킵니다. 컨디셔닝된 배지 용액을 실온에서 1시간 동안 분당 70회 회전하여 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플을 원심분리하고 세척당 175마이크로리터의 1X 배양으로 펠릿을 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후 20마이크로리터의 용리 완충액을 추가하여 실온에서 분당 70회전으로 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 따로 보관하고 표준 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석에 의해 용출된 총 단백질을 정량화합니다.컨디셔닝 배지 및 과산화수소로 비형질 주입된 망막 색소 상피 세포를 처리하기 위해 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양을 위해 200마이크로리터의 완전한 배지에 있는 3000개의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩합니다. 다음 날 아침, 상등액을 웰당 200마이크로리터의 컨디셔닝 배지로 교체하고 세포를 10일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양 11일째에 350마이크로몰의 과산화수소로 세포를 완전 배지에서 24시간 동안 처리합니다.정제 또는 상용 PEDF 및/또는 GM-CSF로 transfection되지 않은 RPE 세포를 처리하기 위해, 세포 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하기 위해 재조합 PEDF의 밀리리터당 500나노그램 및/또는 웰당 GM-CSF로 재조합 밀리리터당 50나노그램이 보충된 완전한 배지의 200마이크로리터에 3000개의 세포를 시드합니다. 배양이 끝나면 상등액을 24시간 동안 350마이크로몰의 과산화수소와 PEDF 밀리리터당 500나노그램 및/또는 웰당 밀리리터당 50나노그램의 GM-CSF를 포함하는 완전한 배지로 교체합니다. 형질주입된 RPE 세포의 과산화수소 처리를 위해 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 웰당 200마이크로리터의 완전한 배지에 5, 000개의 형질주입된 세포를 배양한 후 350마이크로몰의 과산화수소로 세포를 처리합니다.PEDF 및/또는 GM-CSF를 과발현하는 형질주입된 세포 또는 과산화수소 처리 후 성장 인자로 전처리된 형질주입되지 않은 세포에서 생성된 글루타치온 수치를 측정하기 위해, 각 웰의 상등액을 웰당 100마이크로리터의 새로 준비된 1X 시약 혼합물로 교체하고 안와 쉐이커에서 분당 500회전으로 14초 동안 세포를 시약 혼합물과 혼합합니다. 흔든 후 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양한 후 각 웰에 100마이크로리터의 재구성된 루시페린 검출 시약을 추가합니다. 셰이커에서 용액을 15초 동안 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.배양이 끝나면 플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 레이아웃 변경을 선택합니다. Basic Parameters 탭에서 96-well plate 및 Top optic을 선택하고 포지셔닝 지연을 0.1로, 측정 시작 시간을 0으로, 측정 간격 시간을 1로, 결과를 정규화하는 시간을 0으로 설정해야 합니다. 블랭크, 표준물질 및 샘플을 정의하고 Start measurement(측정 시작)를 클릭합니다.그런 다음 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내고 표준 곡선의 보간을 통해 각 샘플의 글루타치온 농도를 계산합니다. 세포 생존율을 측정하기 위해 각 웰의 상층액을 웰당 100%FBS가 보충된 100마이크로리터의 완전한 배지로 교체하고 분석이 진행될 때까지 세포를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배양물에서 처리되지 않은 ARPE-19 세포를 채취한 후, 1%FBS 농도가 보충된 DMEM Hams F-12 배지에서 밀리리터당 100, 000 세포로 세포를 다시 현탁시킵니다.다음으로, 1% FBS가 보충된 200마이크로리터의 배지에 7개의 직렬 1:1 희석액을 준비하고, 각 표준물질 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 적절한 웰에 복제하여 옮깁니다. 갓 준비한 시약 혼합물 50마이크로리터를 모든 웰에 추가하고 셰이커에서 15초 동안 혼합물과 세포를 혼합한 후 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양이 끝나면 설명된 대로 발광을 측정합니다.측정값을 얻은 후 실온에서 15분 동안 배양하기 위해 각 웰에 50마이크로리터의 용해 시약을 추가한 다음 발광을 다시 측정하고 공식을 사용하여 생존 가능한 세포의 백분율을 계산합니다.50 및 100마이크로몰의 과산화수소로 24시간 처리해도 세포 내 글루타티온 생산에 영향을 미치지 않는 반면, 세포를 350-500 또는 700마이크로몰의 과산화수소로 처리하면 글루타티온의 현저한 감소가 관찰됩니다. 농도. 형태학적으로 과산화수소 처리된 세포는 화합물의 농도가 증가함에 따라 덜 퍼지고 더 둥글게 나타납니다.이러한 효과는 과산화수소로 처리된 PEDF 및 GM-CSF-형질주입 세포에서는 덜 두드러졌습니다. 세포 수가 과산화수소 매개 산화 스트레스에 영향을 미친다는 점에 유의하는 것이 중요합니다., 글루타티온의 수치는 5, 000 개의 세포로 파종된 우물에서 과산화수소 처리 후 통계적으로 현저하게 감소했습니다. PEDF 및/또는 GM-CSF를 발현하기 위해 처리되거나 형질주입된 세포는 산화 조건에서 처리되지 않은 대조 세포에 비해 훨씬 더 많은 글루타티온을 생성합니다.또한, 과산화수소 투여 후 PEDF 및 GM-CSF 형질주입 세포에서 UCP2 유전자 발현 수준이 증가하지만, 이러한 증가는 통계적으로 유의하지 않습니다. 과산화수소에 노출된 GM-CSF 형질 주입 세포의 용해물에서 인산화된 AKT의 웨스턴 블롯 분석은 처리되지 않은 대조 세포에 비해 인산화가 약간 감소하는 것으로 나타나며, 이는 GM-CSF가 산화 스트레스 손상으로부터 세포를 보호할 수 있음을 나타냅니다. 세포를 올바른 밀도로 파종하고, 신선한 과산화수소 용액을 사용하고, 배지에 새로운 단백질을 추가하는 것이 중요합니다.과산화수소 모델을 사용하여 성장 인자의 항산화 효과가 확증되면 산화 스트레스 관련 안구 질환 모델에서 인자를 테스트할 수 있습니다. 현재의 과산화수소 산화 스트레스 모델은 다양한 요인이 가질 수 있는 항산화 효과를 평가할 수 있게 해주며, 따라서 새로운 유전자 치료법의 개발을 지원합니다.

induction-analysis-oxidative-stress-sleeping-beauty-transposon

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

산화 세포 환경을 감지하는 심사 방법은 CM - H2DCFDA의 산화를 측정하는 것입니다. 일단 비 형광의 형광 화합물로 세포, CM - H2DCFDA 변경 내에 산화. 형광에이 변경 사항은 유동세포계측법으로 측정하고 산화 환경에서 세포의 수를 나타냅니다.

고양이 Astrocyte 세포주에서 산화 스트레스에 대한 심사 분석, G355 - 5

여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 산화 스트레스를 측정하는 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 전체 배아 조직과 단일 세포 집단 모두에서 활성 산소 종(ROS)을 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정성적 분석과 정량적 분석을 모두 수행합니다.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

Non-coherent Xenon light는 협대역 간섭 및 중성 밀도 필터를 통과하여 다양한 파장과 강도의 빛을 배양된 세포에 전달했습니다. 이 프로토콜은 적색/근적외선 요법이 in vitro 반응성 종의 생산에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었으며, 테스트된 매개변수를 사용하여 효과가 관찰되지 않았습니다.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법 체외

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

망막 색소 상피(RPE) 배양에서 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 새로운 장치를 소개합니다. 이 장치는 플레이트가 표준 세포 배양 인큐베이터에 있는 동안 표준 배지가 있는 표준 세포 배양 플레이트에서 성장한 RPE에서 한 번에 몇 주 동안 OCR을 측정할 수 있습니다.

고도로 분화된 편광 망막 색소 상피 배양에서 산소 소비율의 장기 모니터링

편견 접근법을 사용하여 발암의 알 수없는 드라이버를 식별하는 방법이 설명되어 있습니다. 방법은...

의 식별<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em링커로 인한 PCR을 사용하여 고체 종양의&gt; Transposon의 삽입

학습하세요 인간 망막 안료 상피 세포에서 과산화수소를 이용한 산화 스트레스 유도 및 항산화 효과 분석 방법을. 이 기법은 신경망막 퇴행성 질환 치료 연구에 활용됩니다.

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

더 많은 동영상 탐색