Name: Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a convertir fibroblastos humanos en mioblastos y miotubos mediante transducción viral para investigar trastornos neuromusculares. Este método ofrece una alternativa rápida a la tecnología iPSC.

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Nos gustaría dar las gracias al Dr. Vincent Mouly por compartir sus conocimientos en el pasado con respecto al modelo. Este trabajo ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Estados Unidos (R01 NS043264 (K.M.F., y R.B.W.)), el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos y cutáneas (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., y N.W.). N.W. ha recibido apoyo de becas de la Universidad Estatal de Ohio/Nationwide Children's Hospital Muscle Group y la Fundación Philippe. Este trabajo también fue apoyado por fondos discrecionales internos y parte de la obra de salto exon 2 ha sido apoyada también por CureDuchenne (K.M.F.) y la Asociación Francaise Contre Les Myopathies. Número IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS000000123.

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<li>Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+alteration+of+pre-mRNA+splicing+patterns+by+modified+U7+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
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<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
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</ol>

El Hospital Nacional de Niños ha autorizado el programa de saltos exon 2 descrito aquí a Audentes Therapeutics. K.M.F. y N.W. han recibido pagos de regalías como resultado de esta licencia.

Para obtener líneas celulares FM con buena calidad, algunos pasos son críticos. Cuanto antes se procese la biopsia de la piel, mayores serán las posibilidades de obtener fibroblastos sanos. El número de pasajes de cultivos de fibroblastos también es importante. Las células primarias tienen una capacidad proliferativa limitada y después de muchos pasajes, entran en senescencia replicativa. Por lo tanto, es mejor tener un stock de fibroblastos en un número de paso bajo y transformar las células en el paso más temprano posi...

Los modelos celulares obtenidos directamente de los tejidos humanos son útiles para modelar muchos trastornos genéticos humanos, con la ventaja de tener el contexto genómico original y, en muchos casos, reproducir las mismas señas de identidad moleculares y celulares observadas en los pacientes. En el campo de los trastornos neuromusculares, biopsias musculares han sido una gran fuente de mioblastos humanos y han ayudado en la elucidación de mecanismos patológicos. Además, son una herramienta importante para las pruebas in vivo de fármacos y terapias génicas. Por un lado, la derivación de mioblastos de fragmentos musculares es relativamente fácil. Por otro lado, la cultura y el mantenimiento de los mioblastos primarios son difíciles, debido a su limitada tasa de proliferación y senescencia replicativa in vitro1. Una alternativa para estas limitaciones es inmortalizar los mioblastos con la inserción de los genes telomerasa humana(hTERT)y/o quinasa 4(CDK4)dependientes de la ciclina2,3,con preservación de las características musculares esqueléticas4. Sin embargo, la obtensión de los mioblastos primarios sigue dependiendo de la biopsia muscular, un procedimiento quirúrgico con desventajas para los pacientes, que, en muchos casos, tienen sus músculos en degeneración avanzada. Así, el músculo de estos pacientes se compone de una proporción significativa de tejido fibromático y/o adiposo y produce menos células musculares, requiriendo la purificación de las células previamente a la inmortalización.
A diferencia de las biopsias musculares, las biopsias de la piel son más accesibles y son menos dañinas para los pacientes. Los fibroblastos primarios se pueden derivar de fragmentos de piel in vitro. Aunque los fibroblastos no se ven afectados principalmente por mutaciones que causan trastornos neuromusculares, pueden ser transdiferenciados en mioblastos. Esto se puede lograr mediante la inserción del gen Myod, un factor de transcripción regulador miogénico5. En este manuscrito, describimos el protocolo para obtener mioblastos transdiferenciados, desde el establecimiento de cultivos de fibroblastos hasta la obtensión de miotubes diferenciados (se representa un resumen representativo del método en la Figura 1).
Las pruebas preclínicos de estrategias terapéuticas dependen de modelos celulares y animales portadores de mutaciones similares a las mutaciones encontradas en pacientes humanos. Aunque el desarrollo de modelos animales se ha vuelto más factible con el avance de tecnologías de edición genética como CRISPR/Cas96,sigue siendo desafiante y costoso. Por lo tanto, las líneas celulares derivadas del paciente son una opción accesible para tener modelos, cubriendo el gran espectro de mutaciones de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). La obtención y la creación de modelos celulares son cruciales para el desarrollo de terapias personalizadas para este tipo de patologías.
Entre las terapias personalizadas que se han investigado, las estrategias de salto exon es una de las prometedoras para diferentes distrofias musculares7,8. Esta estrategia consiste en producir una proteína más corta pero funcional. Esto se realiza ocultando la definición exon al empalme, excluyendo así el exon mutado del mensajero final. Esta es una tecnología muy prometedora que ha sido aprobada por la FDA para dmd. Así, también describimos en este protocolo, métodos para transfectar mioblasts con dos exon diferentes saltando tecnologías relacionadas: oligonucleótidos antisense (AON) y virus asociados al U7snRNA-adeno (AAV). La transfección AON es una buena herramienta para la proyección inicial de varias secuencias diseñadas para promover el salto exon9. Sin embargo, la actividad de los AON es transitoria. Para obtener una expresión sostenida de secuencias antisense, también exploramos pequeñas ANR nucleares (SNRNAs) combinadas con AAV, permitiendo la localización e inclusión nuclear en la maquinaria de empalme10. U7 es un snRNA implicado en el procesamiento de ARNm de histona que se puede diseñar para unir proteínas que lo redirigirán al empalme y entregarán secuencias antisense11. El uso de SNRNAs U7 modificados en combinación con vectores AAV supera las limitaciones de los AONs, lo que resulta en una expresión continua de los ANV y una mejor transducción de tejidos de interés12. Utilizamos células derivadas de pacientes con DMD para este protocolo para ilustrar la estrategia de salto exon.

<table><tbody><tr><td>Plato de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA, rojo fenol</td><td>Thermo Fisher</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X Tampón de transferencia</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-acetato SDS tampón de funcionamiento</td><td>Thermo Fisher</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8% Gel de acetato de tris</td><td>Thermo Fisher</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>matraz de 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Cadena pesada anti-miosina, anticuerpo de sarcómero</td><td>Estudios de desarrollo Banco de hibridadores</td><td>MF20 sobrenadante</td><td>Dilución 1:50</td></tr><tr><td>Antioxidante</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA Ensayo de proteínas</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3571</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I set (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de doxiciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 imprimadores humanos</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5</td><td>' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'Anticuerpo contra la</td><td></td></tr> <tr><td>distrofina</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Halt Cóctel inhibidor de la proteasa 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>Thermo Fisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD anti-Conejo de cabra IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>Dilución 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II Sistema de correderas de cámara CC2</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de membrana GFR</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Contenedor de congelación</td><td>Thermo Fisher</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa 0,45 &micro; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Control normal del suero de cabra</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>Tampón de bloqueo para Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de PCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la fosfatasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 Tinción de proteína total para la normalización de Western Blot</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrador-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes</td><td>Aspen Quirúrgico</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Medio de diferenciación de células musculares esqueléticas</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas</td><td>Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td></td> 215682500 <td></td></tr><tr><td>reactivo</td> <td>TRIzolThermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Congelador de temperatura ultrabaja</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield medio de montaje antidecoloración</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Las investigaciones sobre la fisiopatología y las dianas terapéuticas en distrofias musculares se han visto obstaculizadas por la limitada capacidad proliferativa de los mioblastos humanos. Se han creado varios modelos de ratón, pero no representan realmente la fisiopatología humana de la enfermedad o no son representativos del amplio espectro de mutaciones que se encuentran en los seres humanos. La inmortalización de los mioblastos primarios humanos es una alternativa a esta limitación; sin embargo, todavía depende de biopsias musculares, que son invasivas y no fácilmente disponibles. Por el contrario, las biopsias cutáneas son más fáciles de obtener y menos invasivas para los pacientes. Los fibroblastos derivados de biopsias de piel pueden ser inmortalizados y transdiferenciados en mioblastos, proporcionando una fuente de células con un excelente potencial miogénico. Aquí, describimos un método de reprogramación rápida y directa de fibroblasto en un linaje miogénico. Los fibroblastos se transducen con dos lentivirus: hTERT para inmortalizar el cultivo primario y un MYODinducible en tet, que tras la adición de doxiciclina, induce la conversión de fibroblastos en mioblastos y luego miotubes maduros, que expresan marcadores de diferenciación tardía. Este protocolo de transdiferenciación rápida representa una poderosa herramienta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias innovadoras basadas en genes o farmacológicas para trastornos neuromusculares.

Este protocolo muestra cómo establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana y convertirlos en mioblastos y luego en miotubes diferenciados. Este tipo de línea celular es extremadamente útil para el estudio de trastornos neuromusculares y pruebas in vitro de terapias potenciales.
Se muestra una representación esquemática de la conversión fibroblasta en la figura 1. La Figura 2A muestra un fragmento de piel y lo...

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Hola a todos. Mi nombre es Nicolas Wein. Soy investigador principal del Hospital Nacional de Niños en Columbus, Ohio.Y hoy vamos a mostrarte un video sobre cómo tomar una biopsia de piel y convertirla en mioblastos y miotube. Esta es una herramienta muy útil para estudiar el trastorno neuromuscular. Además, es una tecnología mucho más rápida en comparación con IPSC porque estamos utilizando dos tipos diferentes de virus para combatir directamente este tipo de célula.Este video demuestra el protocolo para establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana, la conversión en mioblastos y luego miotubes diferenciados. Una biopsia de piel se transfiere al cultivo celular para derivar fibroblastos dérmicos. Los Lentivirus portadores de genes hTERT y MYOD se utilizan para transducir estos fibroblastos.Tras la adición del medio de crecimiento de mioblastos complementado con doxiciclina, se expresa el gen MYOD, induciendo la conversión de fibroblastos en mioblastos. A continuación, el medio se cambia a un medio de diferenciación, también complementado con doxiciclina. Luego los mioblasts se fusionan entre sí, formando miotubes multinucleados.Aspirar los medios del tubo y enjuag

direct-reprogramming-human-fibroblasts-into-myoblasts-to-investigate

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Un medio no invasivo para evaluar el éxito de trasplante de mioblastos se describe. El método se aprovecha de un gen de fusión informador unificada compuesta de genes cuya expresión se pueden obtener imágenes con diferentes modalidades de imágenes. Aquí, se hace uso de...

Imagen Molecular a Target trasplantó células progenitoras musculares

Este protocolo implica procedimientos detallados para el aislamiento de células derivadas de la orina de pacientes con distrofia muscular; su reprogramación eficiente y rápida a través de la transducción del virus de Sendai.

Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo.  También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares.  En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Reprogramación neuronal directa genera neuronas que mantienen la edad de la partida de la célula somática. Aquí, describimos un método único basado en vectores para generar neuronas inducidas de fibroblastos dérmicos obtenidos de donantes humanos adultos.

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Aquí describimos un método clínicamente relevante, alta eficiencia y libre de alimentador para reprogramar fibroblastos primarios humanos en células pluripotentes inducidas, usando modificado mRNAs que codifican factores de reprogramación y microRNA maduro-367/302 imita. También se incluyen métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación, ampliar las colonias clonales iPSC y confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60.

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Se describe un protocolo para reprogramar fibroblastos derivados de la piel humana en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs), y su posterior diferenciación en astrocitos inducidos (iAs). Este método conduce a la generación rápida y reproducible de iNPCs e iAs en grandes cantidades.

Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

Aquí, describimos un sistema de reprogramación directa optimizado para melanocitos y un sistema de empaquetado de virus concentrado de alta eficiencia que garantiza una reprogramación directa sin problemas.

Reprogramación directa de fibroblastos de ratón en melanocitos

Aprende a convertir fibroblastos humanos en mioblastos y miotubos mediante transducción viral para investigar trastornos neuromusculares. Este método ofrece una alternativa rápida a la tecnología iPSC.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

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