Name: 단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 학습하세요 체외 성숙 중 난모세포의 mRNA 번역 조절 메커니즘을 단일 난사 기자 분석기와 시간 경과 현미경으로 연구하는 방법을. 이 기법은 번역 활성화 시점을 정확히 파악하여 생식 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH R01 GM097165, GM116926 및 유니스 케네디 슈리버 NICHD 국립 재생 및 불임 P50 HD055764에서 마르코 콘티에 의해 지원되었다. 엔리코 M. 달델로는 랄로 재단의 펠로우십에 의해 지원되었고 나타자 G. J. 코스터만스는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)의 루비콘 펠로우십에 의해 지원되었습니다.

동물과 관련된 실험 절차는 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 AN182026).
1. 미디어 준비
<ol><li>표 1에설명된 대로 모든 구성 요소를 추가하여 기본 난낭 수거 배지 및 난모세포 성숙 배지를 만듭니다. 기본 컬렉션 매체의 경우 pH를 7.4로 설정합니다. 수집 및 성숙 배지의 경우 사용 당일 소 세럼 알부민(BSA)과 1 μM 시로스타미드를 3mg/mL추가합니다.</li>
</ol>2. Ypet-3'UTR 및 mCherry용 mRNA 인코딩 준비
<ol><li>관심있는 mRNA의 3′ UTR 시퀀스를 가져옵니다. 참고: 이 연구를 위해, 서열은 이전에 마우스 oocyte cDNA에서 얻어졌습니다.</li>
	<li>Ypet 코딩 서열, V5-에피토프 태그 및 T7 프로모터를 포함하는 pcDNA 3.1 벡터의 오키테 cDNA 및 부분으로부터 표적 3'UTR을 증폭시키는 설계 프라이머.</li>
	<li>고충실도 DNA 폴리머라제 키트를 사용하여 증폭. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 제품을 젤상에 실행하여 조각이 정확한 크기인지 확인하고, 밴드를 잘라내고, 제조업체의 지시에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 젤에서 DNA를 추출한다.</li>
	<li>PCR 복제 키트를 사용하여 PCR 조각을 벡터에 융합합니다. 참고: PCR 파편은 보다 효율적인 재조합 과정을 용이하게 하기 위해 4시간 동안 얼음에 배양되었습니다. 이것은 단지 45 분의 잠복 시간을 권장하는 제조업체의 지침과 는 상반됩니다.</li>
	<li>트랜스펙트 PCR은 유능한 5-α 대장균 균으로 단편화합니다.<ol>
<li>박테리아에 믹스와 플라스미드를 넣고 얼음에 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>혼합물과 플라스미드를 42°C에서 45초로 가열하고, 얼음에서 3분간 즉시 식힙니다.</li>
		<li>카타볼라이트 억압(SOC) 배지로 슈퍼 최적 국물의 500μL을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>7000 × g에서 2분 동안 회전하고 대부분의 상체를 제거합니다. 적절한 선택 항생제로 Luria Broth (LB) 한마접시에 재중단 및 플레이트. 참고: 카베니실린은 이 연구에서 사용되었습니다.</li>
		<li>37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 콜로니 중 하나에 파이펫 팁을 가볍게 누르고 카베니실린 100 μg/mL로 LB 배지 3mL에 배치하여 식민지를 분리합니다. 37°C에서 12-24h의 인큐베이션을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>제조 업체의 지시에 따라 플라스미드 DNA 격리 키트를 사용하여 플라스미드의 DNA를 추출하고 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For Ypet/3' UTR:<ol>
<li>시험관 내 전사를 위한 선형 PCR 템플릿을 생성합니다. Ypet 서열의 전방 프라이머 상류와 20개의 추가 티민 잔류가 있는 역프라이머를 사용합니다. Ypet/IL-7 3' UTR 의 시퀀스와 전방 및 역 프라이머의 시퀀스에 대한 표 2를 참조하십시오. 참고: 이러한 추가 티민 잔류물은 시험관 내 전사 후 선형 mRNA에 올리고(A)를추가합니다.
</li>
		<li>
시험관 내는 제조업체의 지침에 따라 T7 전사 키트를 사용하여 PCR 제품을 전사합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 전사 정리 키트를 사용하여 결과 보완 RNA (cRNA)를 정화합니다.</li>
		<li>RNA가 없는 물에서 정제된 cRNA를 엘테우트하고, 농도를 측정하고, 아가로 전기전도에 의한 무결성을 평가합니다. -80 °C에서 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>mCherry의 경우:<ol>
<li>고충실도 제한 효소를 이용하여 체외 전사를 위한 선형 PCR 템플릿을 생성; 이 예제를 복제하는 경우 제한 효소 mfEI-HF를 사용한다. 37 °C에서 하룻밤 동안 소화 버퍼로 소화하십시오.</li>
		<li>젤을 실행하여 샘플을 정화하고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 선형 DNA를 추출합니다.</li>
		<li>
시험관 내는 제조업체의 지침에 따라 T7 전사 키트를 사용하여 PCR 제품을 전사합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 폴리(A) 테일링 키트를 사용하여 cRNA(150-200 뉴클레오티드)를 폴리아데니레이트한다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 전사 정리 키트를 사용하여 생성된 cRNA를 정화합니다.</li>
		<li>RNA가 없는 물에서 정제된 cRNA를 엘테우우고, mRNA 농도를 측정하고, 젤 전기전도에 의한 메시지 무결성을 평가한다. -80 °C에서 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 실험 절차
참고: 오키테 마이크로 주입 및 후속 시간 경과 현미경 검사법의 회로도 개요는 그림 1에서제공됩니다.
<ol><li>1일차<ol>
<li>내회적으로 임신 한 마레의 혈청 생식선 호르몬의 5 IU와 21 일 된 마우스를 주입하여 개미 단계11에여포 성장을 촉진한다.</li>
	</ol></li>
	<li>3일차<ol><li>오사이클 컬렉션<ol>
<li>난소를 수집하기 위해 프라이밍 후 마우스 44-48h를 희생하고 기본 난소 수집 매체와 플라스틱 페트리 접시에 배치합니다.</li>
			<li>26 G 바늘로 여포 벽에 작은 상처를 만들어 조심스럽게 개미 여포를 엽니다. 입으로 작동하는 유리 파이펫을 사용하여 여러 층의 적분 세포로 그대로 적분동 된 난모세포 (COC)를 분리합니다.</li>
			<li>더 작은 파이펫(오마사이클의 직경보다 약간 더 큰)을 사용하고 반복된 파이펫팅을 통해 COC를 기계적으로 디누드합니다. 참고: 또는 그대로 COC에 미세 주입을 수행합니다.</li>
			<li>더 큰 파이펫을 사용하여, 탈모세포를 흡습하고 성숙 배지를 가진 페트리 접시에 영양제 억제제, cilostamide의 1 μM로 보충하여 메이오틱성숙(12)의재개를 방지한다. 2 시간 동안 인큐베이터에 접시를 놓아 모낭에서 난모세포의 분리로 인한 스트레스로부터 난모세포가 회복될 수 있도록 한다.</li>
		</ol></li>
		<li>오사이클 마이크로 주입<ol>
<li>기계 풀러에 10cm 길이의 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 배치하여 주사 바늘을 준비합니다. 최적의 주입을 위해 가열된 필라멘트를 사용하여 바늘 끝을 45° 각도로 구부립니다.</li>
			<li>기본 난낭수 수집 매체의 20 μL 액적으로 폴리스티렌 요리를 준비하고, 가벼운 미네랄 오일로 액적을 덮습니다.</li>
			<li>12.5 μg/μL Ypet-3' UTR 및 12.5 μg/μL mCherry를 추가하여 기자 믹스를 준비합니다. 더 큰 볼륨을 준비하고 유사한 기자 농도를 보장하기 위해 향후 실험을 위해 알리쿼트를 만듭니다. 이 알리코를 -80°C에 저장합니다. 해동 시 먼저 알리쿼트에 20,000 x g로알리쿼트를 2분 간 분리하고 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮긴다. 참고: 이 원심 분리는 사출 바늘이 리포터 믹스의 잠재적 인 골재에 의해 막히는 것을 방지할 것입니다.</li>
			<li>기자 믹스의 약 0.5 μL로 모세혈관에 의한 주사 바늘을 적재한다.</li>
			<li>홀더에 파이펫과 적재 된 주입 바늘을 놓고 난소 수집 매체의 액적에 배치합니다. 일부 배지를 홀딩 파이펫에 흡인합니다.</li>
			<li>조심스럽게 보유 파이펫에 대해 눌러 주입 바늘을 엽니 다.</li>
			<li>스테디트 컬렉션 매체의 액적에 난모를 놓고 리포터 믹스의 5-10 pL을 주입합니다.</li>
			<li>16h의 1μM 시로사미드를 1μM 시로사미드로 성숙 배지에 배양하여 mCherry 신호를 고원에 허용합니다.</li>
			<li>각 주입 된 기자에 대한 성숙 배지의 적어도 두 20 μL 방울과 시간 경과 현미경 검사에 사용되는 페트리 접시를 준비 : 제어 prophase I 체포 oocytes와 성숙 난모 세포에 대한 cilostamide없이 하나의 방울을 제어하기 위해 1 μM cilostamide와 하나의 방울. 물방울을 가벼운 미네랄 오일로 덮고 인큐베이터에 놓습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>시간 경과 현미경 검사법<ol>
<li>배양 전 후 인큐베이터에서 주입된 난모세포를 제거하고 실로사미드없이 성숙 배지에서 4번 세척합니다. 1 μM 시로스타미드를 1단계로 성숙 배지에 일부 난토를 유지하여 i-체포된 난소세포 대조군으로 유지한다.</li>
			<li>이전에 준비된 시간 경과 현미경 접시에 주입된 난모세포를 각각의 물방울로 옮깁니다. 닫힌 유리 파이펫을 사용하여 난모를 클러스터 (닫힌 파이펫은 몇 초 동안 화염에 끝을 잡고 준비 할 수있다). 참고: 난모세포를 클러스터링하면 녹음 중에 움직임을 방지할 수 있습니다.</li>
			<li>37°C 및 5%CO2에서유지되는 환경 챔버가 장착된 발광 다이오드 조명 시스템과 전동 스테이지를 갖춘 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 이 연구를 복제하려면 필터 세트: dichroic 미러 YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP 채널 (흥분 (Ex): S500/20 × 49057; 배출 (EM): D535/30 m 47281), mCherry 채널 (예: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).</li>
			<li>시간 경과 실험에 적합한 설정을 입력합니다(이 스터디에 사용된 소프트웨어의 재료 표 참조): 앱 | 클릭 다중 차원 수집. 첫 번째 탭 메인을 선택하고 타임랩스, 여러 스테이지 위치및 여러 파장을 선택합니다.</li>
			<li>탭 저장을 선택하여 실험을 저장해야 하는 위치를 입력합니다.</li>
			<li>시간 경과 탭을 선택하여 시간 포인트, 기간 및 시간 간격을 입력합니다. 참고: 시간 경과 실험의 기간은 난피성 메이오성 성숙의 타이밍이 종 마다 다르기 때문에 연구된 동물 종에 달려 있습니다. 마우스 난모세포와 이 실험에서는 16시간 동안 15분마다 난모세포가 기록되었습니다.</li>
			<li>탭 스테이지를선택합니다. 밝은 필드에 전환하고 인수 | 선택하여 새 창을 열어 난모세포의 위치를 찾습니다. | 취득 라이브 표시. 난모세포가 있으면 다차원 획득 창으로 다시 전환하고 +를 눌러 난모세포의 위치를 설정합니다.</li>
			<li>탭 파장을선택하고 브라이트필드(노출 15ms), YFP(Ypet/IL7 3' UTR용 노출 150ms), mCherry(Ypet/IL7 3' UTR의 노출 75ms)를 설정합니다. 참고: 기자 축적 수준과 주입된 볼륨에 따라 각 Ypet/3'UTR 리포터의 노출을 조정합니다. YFP 신호가 실험 시작 시 검출 범위의 중심에 속하여 번역활성화 시 과소 평가 또는 포화를 방지해야 합니다. mCherry의 경우, 신호가 폴리아데닐화 시술 중에 첨가된 아데닌 뉴클레오티드의 수에 따라 달라지므로 mCherry의 각 배치에 대한 노출을 조정한다. 폴리아데닐레이션 효율의 변화 때문에, 실험 간의 더 나은 비교를 위해 다른 실험에서 동일한 배치의 mCherry를 사용합니다.</li>
			<li>획득을클릭하여 시간 경과 실험을 시작합니다. 그림 2 및 보충 파일을 참조하여 단일 난소에서 시간 경과 기록의 예를 들어 보겠습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>Ypet-3'UTR 번역 분석<ol>
<li>이 분석의 경우(본 연구에서 사용되는 소프트웨어의 재료 표 참조)는 각 난소에 대해 두 개의 영역 측정을 수행합니다: 타원 영역을 클릭하고 난소세포에 가까운 오사이클과 작은 영역을 둘러싸고 직사각형 영역에서백그라운드 감산 클릭에 사용할 수 있습니다. 참고: 난모세포가 시간 경과 기록 중에 선택한 영역밖으로 이동하지 않도록 합니다. 극성 체압 주위의 영역 측정의 배치에 특별한주의를 기울이면, 이는 난소세포의 움직임을 유발하고 기록을 왜곡할 수 있기 때문이다.</li>
			<li>지역 측정 데이터를 먼저 로그를 클릭한 다음 로그 데이터를 클릭하여 스프레드시트로 내보내 데이터 분석 소프트웨어를 내보냅니다.</li>
			<li>각 개별 난해체및 측정된 모든 시간점에 대해, 오키테 영역 측정에서 백그라운드 영역 측정을 뺍니다. YFP와 mCherry 파장에 대해 별도로 이 작업을 수행합니다.</li>
			<li>발아 소포 고장(GVBD) 및 극성 체압(PBE)의 타이밍을 나중에 참조하여 기록합니다. 참고: GVBD가 2h를 초과할 때 성숙 마우스 난동을 제외합니다.</li>
			<li>각 난십에 대해 시간이 지남에 따라 YFP 및 mCherry 표현을 플롯하여 이상값을 확인합니다. 참고: 이 경우 녹음 중에 난모세포가 이동되었음을 나타낼 수 있는 부드러운 곡선이어야 합니다.</li>
			<li>각 개별 난마낭에 대해, 레코딩의 마지막 10시간 점에 대한 평균 mCherry 표현을 계산합니다. 각 시간점에 대해 YFP 식을 평균 mCherry 식으로 나누어 각 개별 난마낭에 대해 매 시간 지점에서 YFP/mCherry 비율을 얻기 위해 주입된 볼륨을 보정합니다.</li>
			<li>선형 회귀에 의해 곡선의 경사를 피팅하여 특정 시간 간격에 대한 번역 속도를 계산합니다. 통계 추론을 사용하여 번역 률의 차이를 평가합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+3%27+uridylation+and+poly%28A%29+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li>
<li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

제시된 방법은 시험관 내 oocyte meiotic 성숙 도중 다른 전환에서 표적 mRNA의 번역의 활성화 그리고 억압을 공부하는 전략을 설명합니다. IL-7은 난낭구-적혈구 세포 통신8,13에관여할 수 있는 난모세포에 의해 방출된 사이토카인이 본 방법을 설명하기 위해 선택되었다. IL-7은 난마귀 성숙도 8 동안 점점 더 번역되는 것으로 알려져 있으며, 이 방법을 사용하여 번역 활성화의 좋은 시각화를 허용한다. 그러나 실험 전반에 걸쳐 일정한 속도로 번역이 발생하면 리포터의 축적이 선형 패턴을 따르며 실험 의 시작과 끝에 있는 번역 속도는 유사합니다. 이러한 결론은 전체 기록 간격을 통해 선형 회귀의 적합성(R)의 적합성(R)에 의해 확인할 수 있습니다. 기자 번역의 억압은 YFP 신호의 고원으로 나타납니다.
3'U...

완전히 자란 포유류 난소세포는 토티포텐시의 수정 및 획득에 대비하여 급격한 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 수정 후 배아 발달을 유지하는 데 필수적입니다. 핵 성숙과 관련된 사건은 비교적 잘 설명되어 있지만, 난모세포 세포질의 분자 과정과 경로에 대해 훨씬 적게 알려져 있습니다. 난모세포 성숙의 마지막 단계 동안, 난모세포는 전사적으로 침묵하며 유전자 발현은 mRNA 번역 및 분해1,2에전적으로 의존한다. 발달 능력에 중요한 단백질의 합성은, 그러므로, oocyte 성장1,3도중 이전에 합성된 장수 mRNA의 시간별 번역의 프로그램에 의존합니다. 메이오능 성숙 과 난소 -zygote 전환 중에 실행 된 모성 mRNA 번역의이 프로그램을 정의하는 초점의 일환으로,이 논문은 체외 메이오틱 성숙 동안 단일 oocytes에서 대상 모계 mRNAs의 번역의 활성화 및 억압을 연구하는 전략을 제시한다.
이 방법에서 YPet 오픈 판독 프레임은 관심 있는 성적증명서의 3' UTR의 상류로 복제됩니다. 다음으로, mRNA는 주입된 볼륨을 제어하기 위해 mCherry를 코딩하는 폴리아데니얼mRNA와 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 리포터 축적은 시간 경과 현미경 검사를 사용하여 체외 수막 마이오틱 성숙 중에 측정됩니다. 황색 형광 단백질(YFP)과 mCherry의 축적은 개별 난소세포에 기록되며, YFP 신호는 공동 주입된 mCherry의 고원 수준에 의해 수정된다. 데이터 수집 후, 변환 속도는 곡선 피팅에 의해 얻어진 곡선의 경사를 계산하여 체외 우피 메이오틱 성숙 중에 다른 시간 간격으로 계산됩니다.
이 방법은 선택한 내생 성 mRNA의 번역 의 변화를 실험적으로 확인하는 도구를 제공합니다. 또한, 이 방법은 표적 mRNA4,5,6의3'UTR의 시스-규제 요소를 조작하여 난파성 메이오틱 성숙 시 번역을 제어하는 조절 요소의 특성화를 용이하게 한다. 폴리(A) 꼬리 길이를 조작하면 난모세포5에서아데닐라제/데아데닐라제 활동에 대한 통찰력을 허용한다. 시스 작용 원소 또는 RNA 면역 침전의 돌연변이 발생은 코그네이트 RNA 결합 단백질6,7과의상호 작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 오낭화 화질 감소와 관련된 모델에서 타겟 3'UTR 번역을 측정하여 난낭성 개발 능력에 중요한 번역 프로그램의 필수 구성 요소를 식별하는 데 사용할 수 있다 8,9,10. 이 방법 논문은 IL-7의 3'UTR에 융합된 Ypet 리포터와 함께 21일 된 C57/BL6 마우스의 디누드 난동구가 마이크로 주입된 대표적인 실험을 제시한다. 난구 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 설정 및 프로토콜이 설명되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Preparation of media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bovine serum Albumin Powder Bioxtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL-A3311</td><td></td></tr><tr><td>Cilostamide</td><td>EMD Millipore</td><td>231085</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2645</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 100x 용액, 멸균 여과</td><td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이트&nbsp;</td><td>JT-Baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>초순수 증류수</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>YFP/3' UTR 및 mCherry를 인코딩하는 mRNA의 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Biomedical&nbsp;</td><td>20-102QD</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린 디소듐 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Choo-Choo 클로닝 키트</td><td>McLab</td><td>CCK-20</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart 버퍼 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>DNA 로딩 염료 (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 솔루션</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plates with 100 &micro; g/mL 카르베니실린, 테크노바&nbsp;</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>LB 매체 (캡슐)</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-021</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 전사 정리 키트</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MfeI-HF 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R3589</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA 폴리메라이제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) 테일링 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. 매체</td><td>써모 피셔</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>TAE 버퍼&nbsp;</td><td>에이펙스 바이오메디컬&nbsp;</td><td>20-193</td><td></td></tr><tr><td>초순수 에티듐 브로마이드 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Oocyte 컬렉션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator 튜브 어셈블리 보정된 마이크로 피펫용</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>보정된 마이크로 피펫</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSG- 5000</td><td>Mybiosource</td><td>MBS142665</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘 26 G x 1/2</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Oocyte micro-injection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish | No. 0 커버슬립 | 20mm 유리 직경 | 코팅되지 않은</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td>시간 경과 현미경 검사용</td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 붕규산 유리</td><td>셔터 기기</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>배아 배양용 오일</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>팔콘</td><td>351006</td><td>마이크로 주입</td></tr><tr><td>용 조직 배양 접시</td><td>팔콘</td><td>353001</td><td>난모세포 배양용</td></tr><tr><td>VacuTip Holding Capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5195000036</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Figure 1S</td></tr><tr><td>MetaMorph 준비, 버전 7.8.13.0&nbsp;</td><td>분자 소자</td><td></td><td>&nbsp; 타임 랩스 현미경 검사의 경우 3' UTR 번역 분석&nbsp;</td></tr></tbody></table>

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mrna 번역 프로그램 정의

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

난수 핵 성숙과 관련된 사건은 잘 설명되어 있다. 그러나, 훨씬 적은 풍부하게 함의 풍부하게 하고 취득을 위한 준비에 있는 세포질에서 일어나는 분자 통로 및 프로세스에 관하여 알려져 있습니다. 난모성 성숙 도중, 유전자 발현의 변경은 전사보다는 모계 메신저 RNA (mRNA)의 번역 그리고 저하에 전적으로 달려 있습니다. 따라서 번역 프로그램의 실행은 배아 발달을 유지하기 위해 난소 세포 발달 역량을 확립하는 데 중요한 역할을합니다. 이 논문은 메이오틱 성숙 과 난소 - zygote 전환 에서 발생하는 모계 mRNA 번역의 프로그램을 정의하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 논문에서는 체외 내분피 성숙 중에 표적 mRNA의 번역 을 연구하는 전략이 제시됩니다. 여기서, Ypet 기자는 관심 있는 유전자의 3'un번역 영역(UTR)에 융합된 다음, 주입된 부피를 제어하기 위해 mCherry를 위한 폴리아데니얼mRNA 인코딩과 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 시간 경과 현미경 을 사용하여 기자 축적을 측정함으로써, 번역 속도는 난소 메이오틱 성숙 동안 다른 전환에서 계산됩니다. 여기서, 난소 분리 및 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 프로토콜이 Ypet/interleukin-7(IL-7)-3'UTR 리포터를 예로 들 수 있다.

21일 된 C57/BL6 마우스의 탈누드 prophase I-체포 난동세포는 Il-7 및 mRNA 인코딩 mCherry의 3'UTR에 융합된 Ypet 기자를 코딩하는 mRNA를 포함하는 기자 믹스를 주입하였다. YFP와 mCherry 표현은 39개의 난초로 기록되었으며, 그 중 30개가 성숙되었고, 9명은 음의 통제로 1단계에서 체포되었다. 3개의 성숙한 난동체는 지연된 GVBD(N=2)를 가지고 있거나 기록(N=1) 동안 접시에 이동했기 때문에 분석을 위해 제외되었습니다. 도 3은 mCherry 및 YFP 발현을 prophase I 및 성숙 난모세포로 보여줍니다. 도 4는 주입된 볼륨에 대해 보정하기 위해 고원 mCherry 발현(마지막 10시간 지점에서 평균 mCherry 발현)에 대해 보정된 성숙 난초의 YFP 표현을 나타낸다. 리포터의 번역속도는 1단계 I에서 YFP/mCherry 값을 곡선 피팅(선형 회귀)으로 측...

이 프로토콜은 시험관 내 성숙 시 단일 난초에서 mRNA 번역의 조절을 연구하기 위해 기자 분석에 설명합니다.

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

이 방법은 난모세포 성숙 시 번역을 제어하는 규제 요소를 식별하고 특성화하는 데 사용될 수 있습니다. 시험관 내 난해성 전반에 걸쳐 기자 축적을 평가하기 위해 시간 경과 현미경 검사를 적용했습니다. 이것은 정확하게 번역 활성화 또는 억압이 oocyte 성숙 도중 일어나는 시간을 정확하게 찾아내습니다.시작하려면 26 게이지 바늘로 여포 벽에 작은 절단을 함으로써 개미 여포를 조심스럽게 엽니다. 입으로 작동하는 유리 파이펫을 사용하여 여러 층의 적혈구로 손상되지 않은 COC를 분리합니다. 더 작은 파이펫을 사용하고 반복 파이프팅을 통해 COC를 기계적으로 디누드합니다.탈모한 난토를 흡입하고 시트로스타미드의 마이크로몰라 1장으로 보충된 성숙 매체를 곁들인 페트리 접시에 넣습니다. 난모세포가 여포로부터의 고립으로 인한 스트레스로부터 회복될 수 있도록 2시간 동안 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 10센티미터 길이의 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 기계 풀러에 넣고 주사 바늘을 준비합니다.최적의 주사를 위해 가열 된 필라멘트를 사용하여 45도 각도로 바늘 끝을 구부립니다. 폴리스티렌 접시에 기본 oocyte 수집 매체의 20 마이크로 리터 방울을 놓고, 가벼운 미네랄 오일로 방울을 덮습니다. Ypet UTR및 mCherry각각의 마이크로리터 당 12.5 마이크로그램을 추가하여 더 많은 양의 리포터 믹스를 준비합니다.영하 80도에 이들의 알리쿼트를 보관하십시오. 해동시 알리쿼트(aliquot)를 20, 000회 G로 2분간 원심분리한 다음 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮긴다. 기자 믹스의 약 0.5 마이크로 리터로 주사 바늘을적재한다.홀더에 홀딩 파이펫과 주입 바늘을 놓고 오피테 수집 매체의 액적에 놓습니다. 조심스럽게 보유 파이펫에 대해 눌러 주입 바늘을 엽니 다. 보낭을 기본 수집 매체의 액적에 놓고 리포터 믹스의 5~10피콜리터를 주입합니다.16시간 동안 1개의 마이크로몰러 시로사미드로 난모세포와 성숙 배지를 배양하여 mCherry 신호를 고원에 허용합니다. 시간 경과 현미경 검사법의 경우, 각 주입 된 기자에 대한 성숙 배지의 20 마이크로 리터 방울, 제어 prophase I-체포 oocytes를위한 마이크로 몰러 cilostamide 1 방울, 성숙 난모를위한 시로스타미드가없는 한 방울로 페트리 접시를 준비하십시오. 경광물 오일로 물방울을 덮고 인큐베이터에 넣습니다.사전 인큐베이션 후 인큐베이터에서 주입 된 난모세포를 제거하고 cilostamide없이 성숙 배지에서 4 번 세척하십시오. 1개의 마이크로몰러 cilostamide를 프로페이즈 I oocyte 대조군으로 성숙 배지에 일부 난토를 보관하십시오. 이전에 준비된 시간 경과 현미경 접시에 주입된 난모세포를 각각의 물방울로 옮깁니다.녹음 중에 움직임을 방지하기 위해 밀폐 된 유리 파이펫으로 난모를 클러스터합니다. 텍스트 원고에 언급된 매개변수를 사용하여 식기 방출 다이오드 제거 시스템과 환경 챔버가 장착된 전동 단계는 텍스트 원고에 언급된 매개변수를 사용하여 37도 및 이산화탄소 5%로 유지되는 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 앱을 클릭한 다음 다차원 인수를 클릭하여 시간 경과 실험에 적합한 설정을 입력합니다.첫 번째 탭 Main을 선택하고 시간 경과, 여러 스테이지 위치 및 여러 파장을 선택합니다. 탭 저장을 선택하여 실험을 저장해야 하는 위치를 입력합니다. 그런 다음 탭 Time-Lapse를 선택하여 시간 점, 기간 및 시간 간격을 입력합니다.탭 스테이지를 선택하고, 밝은 필드를 전환하고, 새 창을 열고 획득, 획득 및 라이브 표시를 선택하여 난모세포의 위치를 찾습니다. 난모세포가 있는 후에는 다차원 획득 창으로 돌아가 서 플러스를 눌러 난모세포의 위치를 설정합니다. 탭 파장을 선택하고 밝은 필드, YFP 및 mCherry에 대한 세 가지 다른 파장을 설정합니다.Ypet 및 mCherry에 대한 노출을 조정한 다음 획득을 클릭하여 시간 경과 실험을 시작합니다. Ypet 3개의 주요 UTR 번역을 분석하기 위해 각 난소에 대해 두 개의 영역 측정, 타원 영역을 클릭하여 난소 세포 자체, 직사각형 영역을 클릭하여 배경 감산에 사용할 난모세포 주변의 작은 영역을 수행합니다. 리전 측정 데이터를 열기 로그를 클릭한 다음 데이터를 기록하여 스프레드시트로 내보냅니다.각 개별 난소 및 측정된 모든 시간점에 대해 YFP 및 mCherry 파장에 대해 별도로 난낭 영역 측정에서 백그라운드 영역 측정을 뺍니다. mCherry와 YFP의 발현은 39개의 난초로 기록되었으며, 그 중 30개가 성숙되었고, 9명은 부정적 통제로 1단계에서 체포되었다. Prophase I-체포 및 성숙 난귀세포의 신호에 대한 개별 YFP 대 mCherry 비율은 Prophase I-체포 및 성숙 난모세포에 대한 마지막 10 시간 지점의 평균 mCherry 신호로 YFP 신호를 분할하여 주입 된 부피에 대해 수정되었다.기자 YFP의 번역률은 YFP대 mCherry 비율을 prophase I에서 피팅하고, 첫 0~2시간 동안, 또는 선형 회귀를 사용하여 시로사다미드 방출 후 8~10시간 동안 성숙한 난귀에 의해 측정되었다. 리포터의 축적은 시로스타미드 방출 후 0~2시간에서 8~10시간 사이의 번역률의 현저한 차이로 표시된 선형 패턴을 따르지 않으며, 이는 난소근 성숙 시 인터류키닌 7 번역의 활성화를 나타낸다. 이 프로토콜을 시도할 때 기록 시작 시 노출 시간이 적절한지 확인합니다.오키테 메이오틱 재개 중에 번역이 활성화되면 시간 과정에서 신호가 포화될 수 있습니다. MRMA의 안정성은 YFP에 대한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인될 수 있다. 번역의 변화를 확인하려면 V5 기술에 대한 항체로 서양 얼룩을 사용할 수 있습니다.

defining-program-maternal-mrna-translation-during-vitro-maturation

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는 포스포다이에스테르 억제제가 존재할 때 난모세포 세포주기가 prophase-I에서 정지되며, 이 동안 전사된 mRNA가 번역이 없는 상태에서 저장되는 것을 보여줍니다. 억제제가 방출된 후 난모세포 성숙이 재개되고 세포는 중기에 들어갑니다. metaphase-I에서 타겟 유전자와 융합된 리포터 mRNA의 신호는 번역 기전과 단백질 발현의 활성화를 나타냅니다.

In Vitro Single Oocyte Reporter Assay: In Vitro 난모세포 성숙 중 표적 mRNA 번역 조절을 연구하는 기술

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

모체 유전자 산물의 조작에 사용 제브라 난자의 체외 성숙에 최적화 프로토콜은 여기에 제시된다.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

이 프로토콜은 마우스 난자의 시험관 내 성숙, 시험관 수정, 그리고 배아를 배반포 단계까지 배아 배양하는 절차를 설명합니다.

생쥐 난자 내 시험관 성숙, 수정 및 착상 전 배아의 배양

학습하세요 체외 성숙 중 난모세포의 mRNA 번역 조절 메커니즘을 단일 난사 기자 분석기와 시간 경과 현미경으로 연구하는 방법을. 이 기법은 번역 활성화 시점을 정확히 파악하여 생식 생물학 연구에 활용됩니다.

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

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