자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정
2021년 2월 2일
여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.
실질적인 니그라에서 도파민성 뉴런 수의 추정은 파킨슨 병 연구에서 중요한 결과 척도입니다. 이 프로토콜은 뉴런 수를 추정하는 데 필요한 워크로드를 크게 단축합니다. 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하며 세포 생존에 대한 내정간섭의 영향을 결정하는 데 적합합니다.
이 방법은 전통적인 입체 적 방법에 비해 비용과 시간 이점을 유지하면서 다른 뇌 영역에서 뉴런의 정확한 수를 제공하기 위해 쉽게 적응 할 수있다. IHC 이미지를 캡처하려면 10배배율의 공초점 현미경에 결합된 소프트웨어를 사용합니다. 핀 구멍을 1.5 개의 영역 단위로 열어 총 1.5 마이크로 미터의 넓은 평면을 캡처하고 뇌의 주입 된 측면에 초점을 설정합니다.
수집 탭에서 타일 스캔 이미징 옵션을 확인하고 치수를 10x 4로 설정합니다. 획득 모드 패널에서 확대/축소를 1.1로 설정하여 타일 스캔 이미지 사이의 스티치 마크를 피합니다. 프레임 크기를 1024x 1024픽셀로 설정하고 평균2픽셀로 설정하여 고품질 이미지 수집을 보장합니다.
채널 패널 세트 알렉사에 하나를 트랙 488 알렉사 에 두 트랙 555. 슬라이드를 스테이지에 로드하고 TH 염색이 강한 단면을 선택합니다. 획득 패널에서 라이브를 클릭합니다.
채널 패널에서 레이저 강도를 설정하고 신호를 최대화하고 배경 소음을 제한하는 수준으로 게인. 범위 표시기를 사용하여 신호가 과도하게 노출되지 않았는지 확인합니다. 여러 슬라이드로 반복합니다.
획득 탭에서 위치 확인란을 선택합니다. 이미징을 시작하려면 눈조각을 사용하고 긍정적 인 TH 염색을 보여주는 첫 번째 섹션을 선택하십시오. 그런 다음 관심 지점에서 포커스를 설정하고 스테이지를 섹션의 중간선으로 이동합니다.
이렇게 하면 X, Y 및 Z 축의 위치를 저장하고 전체 섹션을 캡처하는 타일 스캔을 이미지화합니다. 주입되지 않은 사이트를 포함한 다른 모든 슬라이드에 대해 이 작업을 반복합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 분리하고 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
펜 어음 도구를 선택하여 실질적인 니그라 파스 콤팩트를 중심으로 음표기를 그려 관심 영역을 정의합니다. 분석 탭으로 이동하여 드롭다운 분석 메뉴에서 실시간 튜닝을 선택합니다. 이렇게 하면 섹션 이미지의 별도의 창이 열리므로 분석 매개 변수를 실시간으로 수정할 수 있습니다.
분석 배율 섹션에서 적절한 이미지 줌을 선택합니다. 세포 검출 섹션에서 는 TH 염색에 사용되는 염료로서 핵 염료를 선택합니다. 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성 및 핵 크기 설정을 신중하게 조정하는 동시에 시간을 조정합니다.
여러 샘플로 이 프로세스를 반복합니다. 적절한 수의 이미지를 샘플링하고 실시간 튜닝이 조정되면 설정 동작 드롭다운 메뉴의 분석 설정을 저장합니다. 분석할 모든 이미지를 선택하고 분석을 클릭합니다.
방금 저장된 분석 설정을 선택하고 분석 창 영역에서 별표 레이어 상자를 확인한 다음 레이어 를 확인하고 분석을 클릭합니다. 완료되면 개체 분석 데이터를 내보내는 옵션을 선택하여 모든 섹션에 대한 요약 분석 데이터를 내보냅니다. 이 데이터 세트는 독소 또는 치료에 반응하여 세포 크기의 변화를 검사하는 데 사용될 수 있었다.
아데노 관련 바이러스 또는 AAV 주사 후 6 주, 쥐 뇌의 실질적인 니그라로 돌연변이 A53T 알파 시뉴클레인을 표현하는 AAV의 입체 주사는 도파민 성 뉴런의 밀도가 현저한 감소귀착되었다. AAV-A35T로 주입된 쥐의 실질적인 니그라에서 제곱된 밀리미터당 TH 양성 뉴런의 평균 수는 AAV 빈 벡터로 주입된 쥐의 평균 감소와 비교하여 현저히 감소하였다. 유사한 관찰은 편견없는 입체학을 사용하여 이루어졌다.
이 프로토콜을 시도할 때 소프트웨어는 교육을 받은 만큼만 유용합니다. 따라서 단일 셀이 단일 셀로 식별되도록 시간과 주의를 기울여야 합니다. 이 소프트웨어는 알파 시뉴클레인과 같은 다른 관심사 단백질의 형광 강도를 측정하여 치료가 단백질 수준을 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 조정할 수 있습니다.
이 기술은 도파민저기 신경 밀도에 대한 여러 잠재적 치료법의 효과를 테스트 할 때 더 큰 효율성을 허용했습니다.
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개요
이 연구는 쥐의 흑질 콤팩타 부분의 도파민성 뉴런 수의 반정량적 결정을 위한 자동화된 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 뉴런 수를 추정할 때 작업량을 크게 줄이고 정확도를 향상시키며, 이는 파킨슨 병 연구에서 매우 중요합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 정신과
- 세포 생물학
배경
- 도파민성 뉴런 수의 추정은 파킨슨 병 연구에 매우 중요합니다.
- 기존 방법은 시간이 많이 소요되고 정확도가 낮을 수 있습니다.
- 자동화된 방법은 시간 효율성과 비용 절감 장점을 제공할 수 있습니다.
- 뉴런 수의 정량적 변화는 치료 효과를 평가할 수 있습니다.
연구 목적
- 도파민성 뉴런 수의 효율적이고 정확한 검출 방법을 제시합니다.
- 연구자들이 다양한 개입으로 인한 뉴런 수의 변화를 분석할 수 있게 합니다.
- 도파민성 뉴런에 대한 이미징 및 데이터 분석 과정을 간소화합니다.
사용된 방법
- 공초점 현미경을 사용한 자동 이미징 방법.
- 쥐 모델에서 흑질 콤팩타 부분에 초점을 맞춥니다.
- 프로토콜은 특정 이미징 설정을 통해 10배 배율로 IHC 이미지를 캡처하는 것을 포함합니다.
- 자동화된 소프트웨어를 통한 신경 이미지의 실시간 조정 및 분석.
- 개입 후 뉴런 밀도의 변화에 대한 데이터 분석을 포함합니다.
주요 결과
- 이 방법은 돌연변이 A53T 알파-시누클레인을 발현하는 AAV 주사 후 TH 양성 뉴런 밀도의 유의미한 감소를 보여주었습니다.
- 결과는 대조군에 비해 도파민성 뉴런 수의 감소를 나타냈습니다.
- 무편 스테레올로지를 통해 결과를 검증했습니다.
- 치료 개입에 대한 반응으로 형태학적 변화를 감지할 수 있습니다.
결론
- 이 연구는 도파민성 뉴런을 정량화하는 효율적인 방법을 검증합니다.
- 이 기술은 파킨슨 병 모델에서 신경 손실에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 제시된 방법은 뉴런 밀도에 대한 치료 효과 탐색을 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
