Name: 자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 배우세요 설치류 흑질에서 도파민성 뉴런 밀도를 자동 이미지 분석으로 반정량 측정하는 방법을. 이 기법은 파킨슨병 전임상 연구에서 신경변성 평가에 시간 효율적인 대안을 제공합니다.

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저자는 이 프로토콜 개발에 있는 그들의 시간 및 지원에 대한 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 검사기 시설 (AOMF)에 있는 모든 직원에게 감사하고 싶습니다.

모든 절차는 대학 건강 네트워크 동물 관리위원회에 의해 승인되고 동물 관리에 캐나다 위원회에 의해 설정 된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
1. 스테레오전술 주입
<ol><li>나무 침구와 음식과 물에 대한 광고 리브 액세스 케이지에 쌍 하우스 성인 여성 스프라그 - Dawley 쥐 (250-280 g). 일정한 온도와 습도가 있는 일반 12h 빛/암흑 주기(06:30의 조명)에서 동물 서식지를 유지합니다.</li>
	<li>이전에 설명된 바와 같이 뇌의 오른쪽에 있는 SNpc(오른쪽 또는 왼쪽, 각 실험실의 선호도에 따라)에 AAV를 직접 일방적으로 스테레오전술 주사를수행한다. 3.4 x 1012 게놈 입자/mL의 최종 티터에 AAV1/2의 2 μL을 주입하십시오.</li>
</ol>2. 뇌 단면 및 면역 작용화학 (IHC)
<ol><li>3 분 동안 마취 챔버에 배치하여 5 %의 이소플루란으로 쥐를 마취. 다른 승인된 방법은 적절한 제도적 검토 후 이 단계에 사용될 수 있다.</li>
	<li>쥐가 깊은 마취의 수술 비행기에 도달하면, 단단히 부검 테이블에 부착 코 콘으로 전송합니다. 테이프를 사용하여 쥐의 앞발을 확보하고 발가락 핀치 응답 방법을 사용하여 마취의 깊이를 결정합니다. 동물은 계속하기 전에 응답하지 않아야합니다.</li>
	<li>흉골 아래 측면 절개를 하고 흉막 의 전체 길이를 따라 다이어프램을 잘라 흉막 구멍을 노출합니다. 머리 위에 있는 헤스테트로 흉골을 들어 올리고 고정합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 심장을 고정하고 좌심실의 후면 끝에 관류 펌프에 연결된 나비 바늘을 삽입합니다. 150mL의 헤파린화식 식염수또는 눈과 피부가 맑을 때까지 쥐를 분리합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)를 가진 관류는 식염수 대신, 특정 항체 또는 얇은 뇌 절면을 통해 면역염색을 용이하게 하는 것이 바람직할 수 있다.</li>
	<li>일단 관류가 완료되면, 기요틴으로 참수하고 뇌 매트릭스에 뇌를 추출, 복부 표면을 향하고.</li>
	<li>신선한 면도날을 사용하여 관상 비행기에서 2mm 로스트랄을 광학 치아솜으로 자릅니다. 슬라이스하는 동안 뇌가 뒤틀리는 것을 피하기 위해 블레이드를 좌우로 밀어 내십시오.</li>
	<li>실온에서 48h의 후고에 대한 4% PFA의 약 20mL를 포함하는 사전 표지된 유리병에 뇌의 후방 부분을 침수하십시오. 뇌의 전방 부분은 -80°C에서 저장하기 전에 -42°C로 냉각된 2-메틸부탄에서 얼어 붙일 수 있다.</li>
	<li>48h 후, 고정 된 뇌를 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 30 % 자당을 포함하는 표지 된 유리병에 옮기고 4 ° C에서 가라 앉을 때까지 저장합니다 (48-72 h).</li>
	<li>시편 단계의 트로프에 드라이 아이스를 배치하고 100% 에탄올을 넣음으로써 마이크로토메를 준비합니다. 스테이지가 냉각되면 직경 2cm, 두께 0.5cm의 원을 형성할 때까지 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물을 스테이지에 짜냅니다. 일단 부분적으로 동결되면, 조심스럽게 10 월의 마운드에 뇌를 낮추고, 줄무늬 절단 표면이 무대와 평행하게 유지되도록.</li>
	<li>뇌가 얼릴 수 있도록 무대에 드라이 아이스를 더 넣습니다. 뇌가 크림색으로 변하면 드라이 아이스의 무대를 치웁울 수 있습니다.</li>
	<li>오른쪽반구와 왼쪽 반구를 구별하기 위해 25G 바늘로 뇌의 오른쪽에 구멍을 찌른다. 관심있는 해부학 구조를 통해 바늘을 통과하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>브레그마 -3.8에서 시작하여 bregma -6.8에서 끝나는 관상 비행기의 40 μm 섹션을 연속적으로 절단합니다.</li>
	<li>동결 방지 용액(PBS 40%, 2-에톡시에탄올 30%, 글리세롤 30%)을 장착한 라벨이 부착된 튜브에 6시리즈를 저장합니다. 각 시리즈에는 12개의 뇌 섹션이 포함되어야 합니다.</li>
	<li>면역히스토케미칼 염색을 위한 섹션 1세트를 선택하고 0.2% PBS-T에서 3 x 10분 세척으로 동결 방지 용액을 씻어냅니다.</li>
	<li>블로킹 용액(일반 염소 세럼 10%, 소세럼 알부민(BSA)이 0.2% PBS-T로 부드러운 투두처리로 RT에서 1h를 차단합니다. 토끼 안티 티로신 하이드록실라제(TH) 항체(1:500) 및 마우스 항-α-syn 항체(1:500)를 실온에서 하룻밤 0.2% PBS-T로 배양하여 이에 따라보세요.</li>
	<li>0.2% PBS-T에서 3 x 5 분 세척으로 1 차 항체를 씻어 내고, 염소 안티 래빗 알렉사 플루어 488 이차 항체 (1:500)와 염소 항 마우스 알렉사 플루어 555 이차 항체를 0.2 % PBS-T로 씻어. 섹션이 빛과 견과류로부터 부드럽게 보호되는지 확인합니다.</li>
	<li>0.2% PBS-T로 3 x 5분 세척으로 이차 항체를 씻어내고 좁은 페인트 브러시를 사용하여 빛과 먼지로부터 보호되는 슬라이드에 전체 섹션 세트를 장착합니다. 투명 네일 바니시장착 매체와 씰이 있는 커버슬립.</li>
</ol>3. 공초점 현미경 검사법과 이미지 수집
<ol><li>10배 배율로 공초점 현미경에 결합된 소프트웨어를 사용하여 IHC 이미지를 캡처합니다. 핀홀을 1.5 AU로 열어 ~1.5 μm의 넓은 평면을 포착하고 뇌의 주입측에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>수집 탭에서 타일 스캔 이미징 옵션을 확인하고 치수를 10 x 4로 설정합니다.</li>
	<li>수집 모드 패널에서 확대/축소를 1.1로 설정합니다. 이렇게 하면 타일 스캔 이미지 사이에 명백한 스티치 표시가 없습니다.</li>
	<li>프레임 크기를 1024 x 1024 픽셀로 설정하고 평균을 2로 설정하여 고품질 의 이미지 수집을 보장합니다.</li>
	<li>채널 패널에서 트랙 1을 Alexa488로 설정하고 2트랙을 Alexa555로 추적합니다.</li>
	<li>슬라이드를 스테이지에 로드하고 TH 염색이 강한 단면을 선택합니다. 획득 패널에서 라이브를 클릭합니다.</li>
	<li>채널 패널에서 레이저 강도와 게인을 신호를 최대화하고 배경에서 노이즈를 제한하는 수준으로 설정합니다. 범위 표시기를 사용하여 신호가 과다 노출되지 않았는지 확인합니다(어두운 빨간색 오버레이로 표시됨).</li>
	<li>레이저 강도 /게인슬라이드 사이에 조정할 수 없기 때문에 슬라이드 사이에 염색이 일관되도록 여러 슬라이드로 위의 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>획득 탭에서 위치 확인란을 선택합니다.</li>
	<li>이 시점에서 이미징을 시작할 준비가 되었습니다. 접안렌즈를 사용하여, 긍정적 인 TH 염색을 보여주는 첫 번째 섹션을 선택하고 관심 지점 (즉, SNpc)에 초점을 설정한 다음 스테이지를 섹션의 중간선으로 이동합니다. 이렇게 하면 x, y 및 z 축의 위치를 저장하고 전체 섹션을 캡처하는 타일 스캔을 이미지화합니다.</li>
	<li>SNpc의 전체 이미지 집합을 제공하는 SNpc 전체의 모든 섹션에 대해 위의 단계를 반복합니다. 주입되지 않은 측의 상세한 분석이 필요한 경우, 단계 3.10 에서 3.11 단계는 주입되지 않은 측에 초점을 설정하여 반복되어야한다.</li>
</ol>4. 이미지 분석 및 수량
<ol><li>적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 분리하고 이미지 파일을 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.</li>
	<li>SNpc 주위에 음부작성을 그릴 펜 어음 도구를 선택하여 관심 영역을 정의합니다. 참고: 다량의 도파민성 뉴런 손실이 있는 섹션에서, 일시적으로 발광/흡수를 증가시켜 SNpc(도2)를명확하게 정의하는 데 도움이 될 수 있다.</li>
	<li>분석 탭으로 이동하고 드롭다운 분석 메뉴에서 실시간 튜닝을 선택합니다. 이렇게 하면 섹션 이미지의 별도의 창이 열리므로 분석 매개 변수를 실시간으로 수정할 수있습니다(그림 3).</li>
	<li>분석 확대 섹션에서 적절한 이미지 확대/축소를 선택합니다.</li>
	<li>세포 검출 섹션에서, TH 염색에 사용되는 염료로 핵염을 선택한다(Alexa Fluor 488).</li>
	<li>실시간 튜닝 창을 주의 깊게 보면서 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성및 핵 크기 설정을 조정합니다. 참고: 실시간 튜닝 창에서 각 개별 셀을 단일 셀로 정확하게 표현하는 것은 정확성에 매우 중요합니다. 이러한 설정은 사용되는 소프트웨어에 따라 임의적인 척도에 있지만 소프트웨어가 개별 셀과 셀 과 배경 간에 정확하게 분화할 수 있도록 올바른 조정이필요합니다(그림 3).</li>
	<li>이 프로세스를 최소 10개의 개별 샘플로 반복하여 다른 섹션에 걸쳐 셀을 구성하는 것에 대한 균일한 동의를 보장합니다. 참고: 추가 셀 마커(예: α-syn 또는 NeuN)는 분석 탭의 마커 1 또는 마커 2 섹션을 사용하여 동일한 분석 플랫폼 내에서 식별할 수 있습니다.</li>
	<li>적절한 수의 이미지를 샘플링하고 그에 따라 실시간 튜닝이 조정되면 설정 작업 드롭다운 메뉴에서 분석 설정을 저장합니다.</li>
	<li>분석할 모든 이미지를 선택하고 분석할 이미지를 클릭합니다.</li>
	<li>방금 저장한 분석 설정을 선택하고 분석 영역에서 는 별표 레이어 상자를 선택합니다. 그런 다음 레이어 1을 확인하고 분석을클릭합니다. 참고: 단일 뇌의 경우 분석은 일반적으로 약 5분이 소요됩니다. 완료된 결과에셀로 계산된 각 항목(그림4)이명확하게 표시됩니다.</li>
	<li>완료되면 모든 섹션에 대한 요약 분석 데이터를 내보냅니다. 감지된각 셀의 셀 크기를 포함하여 자세한 데이터를 제공하는 개체 분석 데이터를 내보낼 수 있는 옵션이 있습니다. 이 데이터 집합은 독소/치료에 반응하여 세포 크기의 변화를 검사하는 데 사용될 수 있습니다.</li>
	<li>동물별로 분석된 각 섹션과 총 분석 영역(mm2)의총 셀을 추가합니다. 각 쥐에 대한 SNpc의 셀/mm2 수를 계산하기 위해 분석된 총 영역으로 총 셀 수를 나눕니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
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<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV1%2F2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment%3A+a+new+mouse+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11(2017).</li>
<li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis%3A+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li>
</ol>

저자는 경쟁 적인 관심사를 보고 하지 않습니다.

PD의 전임상 모델에서 도파민 시스템의 무결성에 대한 신뢰할 수 있는 평가는 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 결정하는 데 매우 중요합니다. 따라서 조직 병리학 데이터의 신뢰성과 재현성을 감소시킬 수 있는 잠재적인 혼동을 제어하고 최소화하는 것이 중요합니다. 신중한 정량적 결과는 정성적 또는 반정성 설명보다 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 동시에, 우리는 시간과 자원의 제약 조건이 병리학적 변화 또는 세포의 손실을 양화하기 위해 편견없는 입체 계수를 수행하기 어렵게 만들 수 있음을 인식해야합니다. 그러나, 최근 의 진보와 함께, 이러한 기준의 대부분은 전산화 및 자동화 된 이미징 플랫폼을 사용하여 충족 될 수있다6.
이 프로토콜은 설치류 뇌에서 도파민뉴런/mm2의 입체적 추정을 결정하는 데 중요한 여러 단계를 설명합니다. 그것은 우리가 SNpc에 AAV를 제공하기 위해 입체 주입을 사용 주의해야한다, 어떤 치료...

파킨슨병(PD)은 α-시뉴클레인(α-syn)을 함유한 단백질 골재의 존재와 실산니그라 파스 콤카(SNpc)1에서도파민성 뉴런의 우대손실을 특징으로 하는 만연한 신경퇴행성 운동 장애이다. 도파민성 뉴런 수의 정량화는 PD 연구의 중요한 부분으로, 이는 nigrostriatal 시스템의 무결성의 평가를 허용하므로, 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 평가하는 중요한 종점을 제공한다. 현재, 세포 수의 정량화에 대한 표준은 조직의 2차원(2D) 단면을 활용하여 3차원(3D) 구조2,3,4에서체적 특징을 추정하는 편견없는 입체 적 계수이다. 현대설계 기반 입체적 방법은 포괄적인 무작위 샘플링 절차를 채택하고 잠재적인 아티팩트및 체계적인 오류를 피하기 위해 계수 프로토콜(프로브라고 함)을 적용하여 동물 간 변형5보다약간 더 큰 차이를 안정적으로 감지할 수 있도록 합니다. 입체학은 생체 내 조직학 연구를 위한 강력한 분석 도구를 제공하지만, 시간 집약적이며 균일한 표본 준비를 가정하며, 임상 전 번역 조사에 점점 더 필요한 효율성에 영향을 미칠 수 있는 여러 단계에서 검증이 필요합니다.
디지털 과학의 최근 기술 발전은 입체 현미경없이 병리학의 보다 효율적인 평가를위한 새로운 응용 프로그램을 채택 할 수 있게, 편견 입체학의 대리로 필요성을 채우는 동안. 이러한 방법은 속도를 높이고, 사람의 실수를 줄이며, 입체 기술의 재현성을 향상6,7. HALO는 디지털 병리학에서 정량적 조직 분석을 위한 이러한 이미지 분석 플랫폼 중 하나입니다. 패턴 인식 알고리즘을 사용하여 전체 조직 섹션에 걸쳐 세포별 기초에 대한 다양한 다양한 모듈 및 보고서 형태학적 및 멀티플렉스 식 데이터를 포함한다. 세포핵 FL 모듈은 핵 또는 세포질에서 형광 마커의 면역 형광 성 양성을 측정합니다. 이를 통해 각 마커에 대해 양성 셀 수와 각 셀에 대한 강도 점수를 보고할 수 있습니다. 이 기능은 도파민성 뉴런의 정량화에는 필요하지 않지만 모듈은 개별 세포 크기와 강도 측정을 제공하도록 조정할 수 있습니다.
이 연구의 목적은 이전에 검증된 바이러스 벡터 기반 α-syn 쥐 모델인 nigral neurodegeneration8,9,10을사용하여 이 방법을 확인하는 것이다. 본 모델에서, 인간 돌연변이 A53T α-syn은 아데노 관련 바이러스 하이브리드 혈청형 1/2(AAV1/2)의 스테레오테테 주사에 의해 SNpc에서 발현되어 6주 동안 상당한 신경 변성을 초래한다. 반대로 주입되지 않은 SNpc는 일부 연구에서 주입 된 측에 대한 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. 더 일반적으로, 동물의 대조군에서 AAV-빈 벡터(AAV-EV)를 주입하는 것은 음의 대조군으로 사용된다. 자동 이미지 분석소프트웨어(도 1)를이용하여 6주 후 주입된 SNpc에 남아 있는 도파민성 뉴런의 밀도를 추정하는 단계별 가이드를 제시한다.

<table><tbody><tr><td>A-SYN 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32-8100</td><td></td></tr><tr><td>ABC Elite</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6102</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 2차 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 2차 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-28180</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 포스파타아제 접합 항토끼 igG</td><td>Jackson Immuno</td><td>111-055-144</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 형광 무팅 매체</td><td>Agilent</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>HALO&trade;</td><td>Indica Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Diamed</td><td>HS202</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase substrate</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>LSM880 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuN 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000-20</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>BioShop</td><td>PAR070.1</td><td></td></tr><tr><td>슬라이딩 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 조사자</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC700</td><td></td></tr><tr><td>TH 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P21962</td><td></td></tr><tr><td>Vecta마운트 마운팅 매체</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Vector Blue 알칼리성 인산가수분해효소 기판</td><td>Vector Labs</td><td>SK-5300</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

nigra의 도파민성 뉴런의 수를 추정하는 것은 임상 전 파킨슨 병 연구의 핵심 방법입니다. 현재, 편견 입체 계수는 이러한 세포의 정량화를위한 표준이지만, 모든 프로젝트에 대해 가능하지 않을 수 있습니다 힘들고 시간이 많이 소요되는 과정남아있다. 여기서는 미리 정의된 관심 영역에서 표지된 셀의 양을 정확하게 추정할 수 있는 이미지 분석 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 쥐 두뇌에 있는 분석의 이 방법에 대한 단계별 프로토콜을 설명하고 지하 니그라에서 돌연변이 α-synuclein의 발현때문에 티로신 하이드록실라제 양성 뉴런의 현저한 감소를 확인할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 편견없는 입체학에 의해 얻은 결과와 비교하여이 방법론을 검증했습니다. 종합하면, 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하므로 세포 생존에 대한 내정간섭의 효과를 효율적으로 판단하는 데 적합합니다.

AAV 주사 후 6주 후에 수집된 뇌 조직에 위의 방법을 적용함으로써, 쥐 뇌의 SNpc에서 돌연변이 A53T α-syn(AAV-A53T)을 발현하는 AAV의 스테레오테테 주사는 빈 벡터 AAV(AAV-EV)의 주입에비해 도파미네릭 뉴런의 밀도가 현저한 감소임을 입증하였다(AAV-EV). AAV-EV로 주입된 쥐의 SNpc에서 TH 양성 뉴런/mm2의 평균 수는 276.2 ± 34.7, AAV-A53T로 주입된 쥐의 SNpc에서 41.2 ± 17(P= 0.0003)이었다. SNpc에서 도파민성 뉴런/mm2의 수의 정량화는 이전에 발표된보고서(10,11)와유사하다. 여기에 설명된 방법에 대해 동물당 4개의 순차적 단면을 분석했다. 이전 연구는 3 섹션만큼 작은와 상당한 차이를 보여 주었다...

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

실질적인 니그라에서 도파민성 뉴런 수의 추정은 파킨슨 병 연구에서 중요한 결과 척도입니다. 이 프로토콜은 뉴런 수를 추정하는 데 필요한 워크로드를 크게 단축합니다. 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하며 세포 생존에 대한 내정간섭의 영향을 결정하는 데 적합합니다.이 방법은 전통적인 입체 적 방법에 비해 비용과 시간 이점을 유지하면서 다른 뇌 영역에서 뉴런의 정확한 수를 제공하기 위해 쉽게 적응 할 수있다. IHC 이미지를 캡처하려면 10배배율의 공초점 현미경에 결합된 소프트웨어를 사용합니다. 핀 구멍을 1.5 개의 영역 단위로 열어 총 1.5 마이크로 미터의 넓은 평면을 캡처하고 뇌의 주입 된 측면에 초점을 설정합니다.수집 탭에서 타일 스캔 이미징 옵션을 확인하고 치수를 10x 4로 설정합니다. 획득 모드 패널에서 확대/축소를 1.1로 설정하여 타일 스캔 이미지 사이의 스티치 마크를 피합니다. 프레임 크기를 1024x 1024픽셀로 설정하고 평균2픽셀로 설정하여 고품질 이미지 수집을 보장합니다.채널 패널 세트 알렉사에 하나를 트랙 488 알렉사 에 두 트랙 555. 슬라이드를 스테이지에 로드하고 TH 염색이 강한 단면을 선택합니다. 획득 패널에서 라이브를 클릭합니다.채널 패널에서 레이저 강도를 설정하고 신호를 최대화하고 배경 소음을 제한하는 수준으로 게인. 범위 표시기를 사용하여 신호가 과도하게 노출되지 않았는지 확인합니다. 여러 슬라이드로 반복합니다.획득 탭에서 위치 확인란을 선택합니다. 이미징을 시작하려면 눈조각을 사용하고 긍정적 인 TH 염색을 보여주는 첫 번째 섹션을 선택하십시오. 그런 다음 관심 지점에서 포커스를 설정하고 스테이지를 섹션의 중간선으로 이동합니다.이렇게 하면 X, Y 및 Z 축의 위치를 저장하고 전체 섹션을 캡처하는 타일 스캔을 이미지화합니다. 주입되지 않은 사이트를 포함한 다른 모든 슬라이드에 대해 이 작업을 반복합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 분리하고 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.펜 어음 도구를 선택하여 실질적인 니그라 파스 콤팩트를 중심으로 음표기를 그려 관심 영역을 정의합니다. 분석 탭으로 이동하여 드롭다운 분석 메뉴에서 실시간 튜닝을 선택합니다. 이렇게 하면 섹션 이미지의 별도의 창이 열리므로 분석 매개 변수를 실시간으로 수정할 수 있습니다.분석 배율 섹션에서 적절한 이미지 줌을 선택합니다. 세포 검출 섹션에서 는 TH 염색에 사용되는 염료로서 핵 염료를 선택합니다. 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성 및 핵 크기 설정을 신중하게 조정하는 동시에 시간을 조정합니다.여러 샘플로 이 프로세스를 반복합니다. 적절한 수의 이미지를 샘플링하고 실시간 튜닝이 조정되면 설정 동작 드롭다운 메뉴의 분석 설정을 저장합니다. 분석할 모든 이미지를 선택하고 분석을 클릭합니다.방금 저장된 분석 설정을 선택하고 분석 창 영역에서 별표 레이어 상자를 확인한 다음 레이어 를 확인하고 분석을 클릭합니다. 완료되면 개체 분석 데이터를 내보내는 옵션을 선택하여 모든 섹션에 대한 요약 분석 데이터를 내보냅니다. 이 데이터 세트는 독소 또는 치료에 반응하여 세포 크기의 변화를 검사하는 데 사용될 수 있었다.아데노 관련 바이러스 또는 AAV 주사 후 6 주, 쥐 뇌의 실질적인 니그라로 돌연변이 A53T 알파 시뉴클레인을 표현하는 AAV의 입체 주사는 도파민 성 뉴런의 밀도가 현저한 감소귀착되었다. AAV-A35T로 주입된 쥐의 실질적인 니그라에서 제곱된 밀리미터당 TH 양성 뉴런의 평균 수는 AAV 빈 벡터로 주입된 쥐의 평균 감소와 비교하여 현저히 감소하였다. 유사한 관찰은 편견없는 입체학을 사용하여 이루어졌다.이 프로토콜을 시도할 때 소프트웨어는 교육을 받은 만큼만 유용합니다. 따라서 단일 셀이 단일 셀로 식별되도록 시간과 주의를 기울여야 합니다. 이 소프트웨어는 알파 시뉴클레인과 같은 다른 관심사 단백질의 형광 강도를 측정하여 치료가 단백질 수준을 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 조정할 수 있습니다.이 기술은 도파민저기 신경 밀도에 대한 여러 잠재적 치료법의 효과를 테스트 할 때 더 큰 효율성을 허용했습니다.

semi-quantitative-determination-dopaminergic-neuron-density

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

출처: Olesen, M. V., et al. 전기 경련 요법의 쥐 모델에서 세포 수를 추정하는 광학 분획기 기술. J. vis. exp. (2017).  이 비디오는 뇌 조직에서 새로 생성된 뉴런을 정량화하는 기술을 보여줍니다. Bromodeoxyuridine(BrdU) 표지된 뉴런을 포함하는 해마 조직 절편을 면역조직화학을 사용하여 염색한 후 광학 분획기 기술을 사용하여 조직 두께 전체에 걸쳐 정량화했습니다.

광학 분획기 기법을 사용하여 쥐의 뇌 조직에서 새로 생성된 뉴런 정량화

이 프로토콜은 성인 마우스의 적응 행동 및 뇌 복구의 기저에 있는 환경적으로 유발된 뇌 변화를 연구하기 위한 두 가지 다른 환경 조작과 동시 뇌 주입 프로토콜을 설명합니다.

성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조

Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

이 프로토콜은 흑질의 뉴로멜라닌 민감성 자기공명영상 데이터를 획득하는 방법을 보여준다.

흑질의 뉴로멜라닌 민감성 자기공명영상을 위한 표준화된 데이터 수집

이 연구는 파킨슨 병의 전임상 모델에서 신경 염증, 신경 변성 및 운동 장애를 유도하는 데 필요한 벡터 용량과 노출 시간을 분석합니다. 인간 α시누클레인을 코딩하는 이들 벡터는 파킨슨병과 관련된 시누클레인 병리를 재분석하기 위해 흑질로 전달된다.

인간 α-시누클레인을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터에 의해 유도된 파킨슨병 마우스 모델 분석

Neurite outgrowth assay는 재생 신경 세포 과정에 대한 정량적 가치를 제공합니다. 이 반자동 소프트웨어의 장점은 마스크를 생성하여 세포체와 신경돌기를 별도로 분할하고 신경돌기 길이, 분지점 수, 세포체 클러스터 면적 및 세포 클러스터 수와 같은 다양한 파라미터를 측정한다는 것입니다.

Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화 

배우세요 설치류 흑질에서 도파민성 뉴런 밀도를 자동 이미지 분석으로 반정량 측정하는 방법을. 이 기법은 파킨슨병 전임상 연구에서 신경변성 평가에 시간 효율적인 대안을 제공합니다.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

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