Name: Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 학습하세요 단일 분자 수준에서 제한 엔도뉴클레아제의 DNA 절단 메커니즘을 다중화된 체류 시간 분석으로 연구하는 방법을. 양자점 표지 DNA와 전반사 형광 현미경을 활용하여 수백 개의 효소 촉매 주기를 동시에 관찰하고 감마 확률 분포로 데이터를 분석하여 DNA 절단 동역학에 대한 통찰을 얻습니다.

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이 연구는 미국 국립종합의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)로부터 CME에 수여된 Award Number K12GM074869의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 National Institute of General Medical Sciences 또는 National Institutes of Health의 공식 견해를 반드시 나타내는 것은 아닙니다.

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저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다

이 분석을 위한 DNA 기질은 sulfo-SMCC를 사용하는 2단계 반응 방식을 사용하여 양자점으로 표지됩니다. 이 이중작용 가교제는 일차 아민과 반응할 수 있는 NHS 에스테르 부분과 sulfhydryl기(20)와 반응할 수 있는 maleimide 부분으로 구성됩니다. 기판을 제조하는 데 사용되는 티올화 올리고뉴클레오티드는 산화된 형태로 배송됩니다. 커플링 절차를 진행하기 전에 설명된 대로 이들을 환원하고 정제하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 커플링 반응의 효율이 감소할 것입니다. 사용 직전에 새로운 DTT 및 sulfo-SMCC 용액을 준비하는 것이 중요합니다. 이 분자는 수용액에서 빠르게 가수분해됩니다. 용액을 투석 장치 안팎으로 옮길 때 주의하십시오 - 피펫 팁이 멤브레인에 닿으면 파열이 발생하고 샘플이 손실됩니다. 샘플 손실을 방지하기 위해 섹션 2의 모든 단계를 중단 없이 완료하는 것이 이상적입니다.
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제한 엔도뉴클레아제(REase)는 DNA의 염기서열 특이적 이중 가닥 절단에 영향을 미치는 효소입니다. 1970년대에 REases의 발견은 재조합 DNA 기술의 개발로 이어졌고, 이러한 효소는 이제 유전자 변형 및 조작에 없어서는 안 될 실험실 도구가 되었습니다1. Type II REase는 인식 서열 내 또는 근처의 고정된 위치에서 DNA를 절단하기 때문에 이 등급에서 가장 널리 사용되는 효소입니다. 그러나 Type II REase 사이에는 많은 변이가 있으며, 진화 관계에 따라 분류되기보다는 특정 효소 특성에 따라 여러 하위 유형으로 나뉩니다. 각 아형(subtype) 중에는 분류 체계에 대한 빈번한 예외가 있으며, 많은 효소가 여러 아형(subtype)에 속한다2. 수천 개의 Type II REase가 확인되었으며 그 중 수백 개가 상업적으로 이용 가능합니다.
그러나 Type II REase 간의 다양성에도 불구하고 자세히 연구된 REase는 거의 없습니다. 1975년 리처드 로버츠 경(Sir Richard Roberts)에 의해 확립된 제한효소 데이터베이스인 REBASE에따르면3, 발표된 동역학 데이터는 이러한 효소 중 20개 미만에 대해 사용할 수 있습니다. 게다가, 몇몇 REases는 그들의 인식 순서 4,5,6,7에 만나서 결합하기 전에 DNA를 따라서 확산하는 동안 단 하나 분자 수준에서 직접 관찰되는 동안, 그들의 절단 반응 역학에 대한 단 하나 분자 학문은 거의 없습니다. 기존 연구들은 단일 절단사건이 발생하는 시간의 변동을 상세히 분석하기에 충분한 통계를 보고하지 못하거나8,9,10 분할 횟수11의 전체 분포를 포착할 수 없다. 이러한 유형의 분석은 상대적으로 수명이 긴 kinetic 중간체의 존재를 밝힐 수 있으며 REase 매개 DNA 절단의 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.
단일 분자 수준에서, 생화학적 과정은 확률적이며, 과정의 단일 인스턴스가 발생할 때까지 기다리는 시간( τ)은 가변적입니다. 그러나 τ 의 많은 측정값은 발생하는 프로세스 유형을 나타내는 확률 분포 p(τ)를 따를 것으로 예상할 수 있습니다. 예를 들어, 효소에서 제품 분자를 방출하는 것과 같은 단일 단계 프로세스는 Poisson 통계를 따르고 p(τ)는 음의 지수 분포의 형태를 취합니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
여기서 β은 평균 대기 시간입니다. 프로세스의 속도 k는 평균 대기 시간의 역수인 1/β와 같습니다. 둘 이상의 단계가 필요한 공정의 경우 p(τ)는 각 개별 단계에 대한 단일 지수 분포의 컨볼루션이 됩니다. 평균 대기 시간 β이 동일한 N 단일 지수 감쇠 함수의 컨볼루션에 대한 일반적인 솔루션은 감마 확률 분포입니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
여기서 Γ(N)은 감마 함수로, N-1의 계승을 N의 정수가 아닌 값으로의 보간을 설명합니다. 이 일반적인 솔루션은 개별 단계의 평균 대기 시간이 유사한 경우 근사치로 사용할 수 있지만, 상대적으로 빠른 단계의 존재는 대기 시간이 훨씬 긴 단계에 의해 가려진다는 점을 이해해야 합니다. 즉, N 값은단계 12 수에 대한 하한을 나타냅니다. 적절한 수의 대기 시간 측정을 통해 이벤트를 범주화하고 감마 분포를 결과 히스토그램에 맞추거나 최대우도 추정 방법을 사용하여 매개변수 β 및 N을 추정할 수 있습니다. 따라서 이러한 유형의 분석은 앙상블 분석에서 쉽게 해결할 수 없는 역학 단계의 존재를 드러낼 수 있으며 매개변수를 정확하게 추정하기 위해 많은 수의 관찰이 필요합니다12,13.
이 논문은 양자 점 표지 DNA 및 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 수백 개의 개별 REase 매개 DNA 절단 이벤트를 병렬로 관찰하는 방법을 설명합니다. 분석의 설계를 통해 여러 실험의 결과를 통합할 수 있으며 수천 개의 이벤트를 포함하는 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다. 양자점의 높은 광안정성과 밝기는 실험 시작 후 몇 분 후에도 발생하는 절단 이벤트를 관찰할 수 있는 능력을 희생하지 않고 10Hz 시간 분해능을 허용합니다. 우수한 시간 분해능과 넓은 동적 범위, 대규모 데이터 세트를 수집할 수 있는 기능이 결합되어 체류 시간 분포의 정확한 특성 분석을 통해 회전율이 1min-1 범위인 REase의 절단 경로에 여러 역학 단계가 존재하는지 확인할 수 있습니다. EcoRV의 경우 세 가지 역학 단계를 해결할 수 있으며, 모두 다른 수단을 통해 식별되어 분석이 이러한 단계의 존재에 민감하다는 것을 확인합니다.
관심 인식 서열을 포함하는 Duplex DNA 기질은 비오틴화된 올리고뉴클레오티드를 단일 공유 결합 반도체 나노결정 양자점으로 표지된 상보적인 가닥에 어닐링하여 생산됩니다. 이 기판은 고분자량 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자가 표면에 공유 결합되어 있는 잔디가 있는 유리 커버슬립 위에 구축된 유동 채널로 도입됩니다. DNA 기질은 자유 말단에 비오틴이 있는 PEG 분자의 일부에 의해 비오틴-스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해 포획됩니다. TIRF 현미경에서는 유리-액체 계면으로부터의 거리에 따라 기하급수적으로 감소하는 증발파가 조명을 제공합니다. 침투 깊이는 사용되는 빛의 파장 순서에 있습니다. 이러한 조건에서는 기능성 유리 표면에 포착된 DNA 분자에 의해 표면에 연결된 양자점만 여기됩니다. 용액에서 자유로운 양자점은 조명 영역 내에서 제한되지 않으므로 발광하지 않습니다. 양자점을 표면에 묶고 있는 DNA가 절단되면 해당 양자점은 표면에서 자유롭게 확산될 수 있으며 형광 이미지에서 사라집니다.
많은 제2형 REase가 마그네슘14가 없을 때 DNA와 결합하는 것으로 알려져 있지만, 모든 REase는 DNA 절단15을 매개하기 위해 마그네슘을 필요로 한다. 이러한 REase는 마그네슘이 없을 때 표면 고정화된 DNA와 결합할 수 있습니다. 마그네슘 함유 완충액이 REase가 DNA에 사전 결합되어 있는 채널을 통해 흐르면 양자점이 사라지는 것처럼 절단이 즉시 시작됩니다. REase 분자를 사전 결합한 다음 마그네슘을 주입하여 DNA 절단을 시작함으로써 달성된 동기화는 실험에서 관찰된 효소 집단의 각 분자에 대해 독립적으로 DNA 절단 완료까지의 지연 시간 측정을 용이하게 합니다. 플루오레세인은 마그네슘 함유 완충액에 추적자 염료로 포함되어 마그네슘이 시야에 도착했음을 나타냅니다. 마그네슘 함유 완충액에는 효소가 포함되어 있지 않기 때문에 마그네슘 함유 완충액이 도착한 후 각 양자점이 소멸될 때까지의 지연 시간은 이미 DNA에 결합된 REase가 DNA를 절단하고 유리 표면에서 양자점을 방출하는 데 걸리는 시간을 나타냅니다. 양자점 소멸은 빠르게 발생하여 강도 궤적의 급격한 감소를 초래하여 주어진 DNA 분자가 절단되는 시간을 명확하게 표시합니다. 이벤트 시간의 결정은 강도 궤적의 수학적 분석을 통해 이루어지며, 일반적인 실험에서는 수백 개의 식별 가능한 절단 이벤트가 발생합니다. 여러 실험의 결과를 취합하여 비선형 최소제곱 또는 최대우도 분석을 통해 매개변수 N 및 β를 추정할 수 있는 적절한 통계를 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>dessicator 상자에 저장</td></tr><tr><td>5 분 에폭시</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>미세 유체 장치 아</td></tr><tr><td>세톤</td> 밀봉에 사용 <td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>커버 슬립</td></tr><tr><td>목욕 초음파 세척기</td> 청소에 사용 <td>Fisher Scientific</td><td>CPXH 모델 2800</td><td>카탈로그 번호 15-337-410</td></tr><tr><td>비커, 유리, 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비오틴-PEG-숙시니미딜 발레레이트 (MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>숙시니미딜 발레레이트는 숙시니미딜 카보네이</td></tr>트 <tr><td>비오틴화 올리고뉴클레오티드</td>보다 반감기가 더 깁니다. <td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형 - 설계 고려 사항은 프로토콜 참조</td><td>5' 비오틴 변형 요청 및 HPLC 정제</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>10 mg / mL 용액 (aq)을 준비하고 95 °C로 가열합니다. C</td></tr><tr><td>Centri-Spin-10 크기 배제 스핀 컬럼</td> 사용 전 <td>Princeton Separations</td><td>CS-100 또는 CS-101</td><td>이황화 결합을 감소시킨 후 티올 올리고뉴클레오티드를 정제하는 데 사용</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 1.5. mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 1인치 정사각형 유리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 홀더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 포인트 휠</td><td>Dremel</td><td>7134</td><td>석영 플로우 셀 토퍼</td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td>에 구멍 뚫기에 사용<td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>No-Weigh Format, 7.7mg/바이알</td></tr><tr><td>드릴 프레스 로터리 툴 워크스테이션 스탠드</td><td>Dremel</td><td>220-01</td>은 <td>석영 드릴링을 용이하게 합니다</td></tr>. <tr><td>EcoRV(예시 데이터 생성에 사용되는 REase)New</td> <td>England Biolabs</td><td>R0195T 또는 R0195M</td><td>과도한 글리세롤 추가를 피하기 위해 100,000 units/mL 스톡을 사용하십시오. 다른 리ase 공급업체에 대한 REBASE를 확인하십시오.</td></tr><tr><td>에탄올</td>, <td>다양한</td><td>CAS 64-17-5</td>, <td>변성 또는 95% 허용 가능, 커버슬립 청소에 사용</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마 알드리치</td><td>EDS</td><td>BioUltra, 무수, 건조제 상자에 보관</td></tr><tr><td>Flea Micro Spinbar</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>커버슬립 랙 아래에 맞는 3mm x 10mm 크기</td></tr><tr><td>플루오레세인</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>실험용 버퍼 제작에 사용</td></tr><tr><td>중력 대류 오븐</td><td>바인더</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 로터리 멀티툴</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>석영 플로우 셀 토퍼</td></tr><tr><td>ImagEM X2 EM-CCD 카메라</td><td>하마마츠</td><td>C9100-23B</td><td>공기 냉각은 이 실험에 적합하며, HCImage 소프트웨어 또는 이와 유사한 것을 사용하여</td></tr><tr><td>이미징 스페이서, 양면, 접착</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항아리, 나사 캡이 있는 유리, (약 50mm 직경 x 50mm 높이)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP214-500</td><td>을 사용하여 마그네슘</td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어로</td><td></td> <td>실험용 완충액을 만듭니다.</td><td>데이터 분석</td></tr><tr><td>금속 핀셋</td><td>Fisher Brand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>반응 속도가 일정하도록 두 PEG는 동일한 NHS 에스테르를 가져야 합니다</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>multiposition magnetic stirrer</td><td>VWR</td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES)</td> <td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9, CHES 버퍼</td></tr><tr><td>궤도 셰이커 및 히터를 만드는 데 사용 마이크로 원심 분리기 튜브 Q</td><td>Instruments</td><td>1808-0506</td><td>(1808-1061 어댑터 포함) 24 x 2.0 mL 또는 15 x 0.5 mL 튜브</td></tr><tr><td>용 Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60 폴리에틸렌 튜브 (내경 0.76 mm, 외경 1.22 mm)</td> <td>Intramedic</td><td>6258917</td><td>22 G의 뭉툭한 바늘이 이 튜빙 크기에 잘 맞습니다</td></tr>. <tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>1x 강도에서 사용</td></tr><tr>수<td>산화칼</td><td>륨 VWR 화학물질 BDH</td><td>BDH9262</td><td>1 M 용액을 사용하여 커버슬립을 청소합니다.</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm 두께</td><td>의 전자 현미경 Sciences</td><td>72250-10</td><td>구멍은 입구 및 출구 튜브 삽입을 위해 모서리에 뚫어야 합니다.</td></tr><tr><td>강화 플라스틱 핀셋</td><td>Rubis</td><td>K35a</td>는 <td>커버슬립 취급 및 미세유체 장치 제작에 사용</td></tr><tr><td>SecureSeal 접착 시트 Grace</td><td>Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td>미세유체 장치용 스페이서를 형성하기 위해 절단</td></tr> New <tr><td></td><td>Era 펌프 시스템</td><td>50</td><td>mL 주사기 및 22 G 무딘 바늘이 장착된</td>NE-1002X-US</tr><tr><td>Slide-a-Lyzer MINI 투석 기기, 10 kDa MWCO, 0.1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 또는 69572</td>는 <td>DNA에 대한 양자점 결합 중 완충액 교환에 사용됨</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0320</td>은 <td>표면 기능화를 위한 완충액을 만드는 데 사용; 100 mM, pH 8</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td>실험용 완충액을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 용액(BioUltra, 물 속 0.5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94046</td><td>100mM 인산나트륨 완충액을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 용액(BioUltra, 물 속 5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td> Streptomyces avidiniiSigma Aldrich S4762<td>에서 100mM 인산나트륨 완충액</td></tr><tr><td>Streptavidin의</td><td></td><td></td> pH를 조정하는 데 사용 <td>1 mg/mL에서 용해하고 -20 ?</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>No-Weigh Format,</td></tr><tr><td>무딘 21 G 니들</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td>가 장착된 2 mg/바이알 주사기 티<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>올화 올리고뉴클레오티드</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형 - 설계 고려 사항은</td> <td>프로토콜 참조요청 5' Thiol Modifier C6 S-S 및 HPLC purificaiton</td></tr><tr><td>TIRF 이미징 시스템, 488nm 레이저 조명,</td><td>다양한</td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td>Research Products, International</td><td>T60050</td><td>사용 실험용 완충액 제작,</td></tr><tr><td>Tris base</td>, <td>JT Baker</td><td>4101</td><td>, 실험용 완충액</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>제작에 사용 차단 버퍼</td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>VWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Coverslip 랙</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70366-16</td><td>커버 슬립의 표면 기능화에 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

single-molecule dwell-time analysis of restriction endonuclease-mediated dna cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 dna 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

이 새로운 전반사 형광 현미경 기반 분석법은 한 번의 실험에서 수백 개의 개별 제한 엔도뉴클레아제(REase) 분자에 대한 촉매 주기의 길이를 동시에 측정할 수 있도록 합니다. 이 분석은 단백질 라벨링이 필요하지 않으며 단일 이미징 채널로 수행할 수 있습니다. 또한 여러 개별 실험의 결과를 취합하여 잘 채워진 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다. 결과 체류 시간 분포를 분석하면 직접 관찰할 수 없는 운동 단계의 존재를 밝혀 DNA 절단 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 잘 연구된 REase, EcoRV(회문 서열 GAT↓ATC(여기서 ↓는 절단 부위)를 절단하는 이합체 유형 IIP 제한 엔도뉴클레아제와 함께 이 분석을 사용하여 수집된 예제 데이터는 이전 연구와 일치합니다. 이러한 결과는 EcoRV가 DNA가 없을 때 마그네슘이 결합한 후 마그네슘을 도입하여 시작되는 DNA 절단 경로에 최소 3단계가 있음을 시사하며, 각 단계에 대해 평균 0.17 s-1 의 비율이 있습니다.

플로우 셀은 대물렌즈 투과 TIRF 이미징을 위한 레이저 조명이 장착된 도립 현미경에서 높은 개구수 오일 이멀젼 60x 배율 대물렌즈에 직접 연결됩니다(그림 5A). DNA 기질을 도입하고 과도한 DNA와 양자점을 씻어낸 후에는 일반적으로 시야에 수천 개의 개별 양자점이 있습니다(그림 5B). 이러한 양자점은 유리 표면에 안정적으로 부착되며 실험 시간 동안 눈에 띄는 디밍이나 심각한 표백을 겪지 않습니다. 그러나 마그네슘과 적절한 REase를 모두 포함하는 완충액이 유동 채널을 통해 흐르는 경우 일반적인 4분 관찰 시간이 끝날 때 실험 시작 시 존재하는 양자점의 최소 30%가 시야에서 사라집니다. 마그네슘 요구량을 확인하면, 마그네슘이 없을 때 REase가 채널을 통해 흐를 때 실험 시작 시 존재하는 양자점의 최소 95%는 관찰 기간이 끝날 때도 여전히 볼 수 있습니다(그림 5C</st...

quantum-dot-labeled DNA와 total internal reflection fluorescence microcopy를 사용하여 unlabeled protein을 사용하면서 restriction endonucleases의 반응 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 이 단일 분자 기법을 사용하면 개별 단백질-DNA 상호 작용을 대규모로 다중화하여 관찰할 수 있으며, 데이터를 풀링하여 잘 채워진 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

이 프로토콜을 사용하면 단일 분자 수준에서 제한 엔도뉴클레아제에 의한 부위 특이적 DNA 절단을 직접 관찰할 수 있습니다. 당사의 다중화 접근 방식을 통해 수백 개의 개별 REase가 촉매 주기를 완료하는 데 걸리는 시간을 측정할 수 있습니다. 멀티플렉싱을 사용하면 감마 확률 분포에 맞출 수 있는 잘 채워진 dwell time to cleavage 분포를 생성하여 DNA cleavage의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.먼저 50 마이크로리터의 올리고뉴클레오티드와 50 마이크로리터의 갓 준비된 DTT 용액에서 각 튜브에 재현탁 올리고뉴클레오티드에 대해 새로운 튜브를 준비하고 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 각 샘플 혼합물의 전체 부피를 준비된 컬럼과 750G에서 2분 동안 원심분리기에 부드럽게 피펫팅합니다. 원심분리 후에는 즉시 사용하지 않을 시료를 섭씨 20도에서 보관하여 티올기의 산화와 이황화물 결합의 형성을 방지합니다.양자점 스톡 50마이크로리터의 부분 표본 1개를 투석 장치에 피펫팅하여 각 구조를 만들고 피펫 팁이 있는 멤브레인을 건드리지 않도록 합니다. 15 분 동안 100 분당 회전수에 약동을 가진 표본 양 의 적어도 1, 000 시간인 CHES 완충액의 양에 대하여 투석하십시오. 피펫터를 사용하여 투석 장치에서 부유 양자점을 조심스럽게 회수하고 새로 준비된 Sulfo-SMCC 용액이 동일한 부피의 새 튜브에 들어 있는 새 튜브로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.Sulfo-SMCC가 양자 점의 1 차 아민과 반응할 수 있도록 1, 000 RPM에서 동요를 가진 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 피펫터를 사용하여 각 샘플을 새 투석 장치로 조심스럽게 옮깁니다. 과잉 Sulfo-SMCC를 제거하기 위하여는, 15 분 동안 약동을 가진 투석 장치에서 포함된 양 의 적어도 1, 000 시간 인 CHES 완충액의 양에 대하여 투석하십시오.완충액을 두 번 교환하고 새 CHES 완충액으로 총 세 번 투석을 수행하여 각 완충액 교환 후 15분 동안 투석을 진행할 수 있습니다. 그런 다음 PBS로 투석을 반복합니다. 피펫터를 사용하여 투석 장치에서 양자점이 포함된 용액을 조심스럽게 회수하고 각 샘플을 PBS에 희석된 등몰량의 팽창 올리고뉴클레오티드가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다.1, 000 분당 회전수에 동요를 가진 실내 온도에 2 시간 동안 잠복하십시오. 최종 농도를 밀리리터당 0.5mg으로 하기 위해 각 샘플에 BSA를 첨가합니다. 그런 다음 피펫터를 사용하여 각 샘플을 조심스럽게 새 투석 장치로 옮기고 저장 완충액에 대해 투석합니다.투석 후에는 각 검체를 조심스럽게 회수하여 새 튜브에 넣습니다. 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 양자점 표지된 올리고뉴클레오티드 샘플과 10배 초과량의 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 결합합니다.열 블록의 혼합물을 섭씨 75도까지 가열하고 그 온도에서 5분 동안 유지합니다. 그런 다음 열 블록을 끄고 혼합물을 천천히 식히십시오. 완성된 구조물을 섭씨 4도에서 보관 테이퍼 다이아몬드 포인트 휠 비트가 장착된 휴대용 회전식 다중 도구를 사용하여 석영 슬라이드의 반대쪽 모서리에 두 개의 구멍을 뚫어 입구와 출구 역할을 합니다.슬라이드를 제자리에 고정하고 비트에 윤활유를 바르고 드릴링하는 동안 물로 계속 미끄러지십시오. 각 실험이 끝나면 사용한 장치를 아세톤에 담가 접착제와 에폭시를 용해시켜 준비된 석영 슬라이드를 복구합니다. 나머지 구성 요소를 폐기합니다.25 마이크로리터의 스트렙타비딘 용액을 80 마이크로리터의 PBS 및 20 마이크로리터의 차단 완충액과 결합합니다. PEG 처리된 커버 슬립에 이 혼합물을 코팅하고 습한 환경에서 30분 동안 배양합니다. 커버 슬립을 배양하는 동안 이미징 스페이서를 준비하여 흐름 채널을 생성합니다.이미징 스페이서 재료의 1인치 정사각형 조각을 자른 다음 석영 슬라이드에 뚫린 구멍의 끝에 정렬된 2mm 너비의 채널을 표시합니다. 메스로 스페이서 재료에서 채널을 잘라냅니다. 석영 슬라이드를 아세톤으로 철저히 청소하여 이전 실험에서 남아 있는 접착제를 제거합니다.이미지 스페이서에서 뒷면의 한쪽을 떼어내고 입구와 출구 구멍을 막지 않도록 주의하면서 석영 슬라이드에 조심스럽게 놓습니다. 커버 슬립을 물로 씻고 압축 공기로 건조시킵니다. 이미징 스페이서에서 뒷면의 다른 쪽을 제거하고 플라스틱 핀셋을 사용하여 석영 슬라이드와 기능성 스트렙타비딘 코팅 커버 슬립 사이에 끼워 어셈블리를 함께 누르고 접착제에서 기포를 제거합니다.용액의 자유로운 흐름을 보장하기 위해 튜브의 끝을 비스듬히 자릅니다. 그런 다음 30cm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 석영 슬라이드의 각 구멍에 삽입합니다. 튜브 랙으로 튜브를 제자리에 고정한 다음 에폭시를 사용하여 튜브를 제자리에 밀봉하고 조립된 장치의 가장자리를 밀봉합니다.에폭시가 굳으면 빈 주사기의 뭉툭한 바늘을 장치의 출구 튜브에 삽입하고 입구 튜브의 끝을 차단 완충액으로 채워진 용기에 담그십시오. 주사기 플런저를 뒤로 당겨 장치에 차단 완충액을 채웁니다. 그런 다음 사용하기 최소 30분 전에 장치를 배양하도록 두십시오.미세유체 장치를 테이프로 현미경 스테이지 플레이트에 부착합니다. 대물렌즈를 장치 바닥에 접촉시키고 시야가 미세유체 채널 내에 있도록 대물렌즈를 배치합니다. 배출 튜브를 주사기 펌프에 연결한 후 주사기 플런저를 뒤로 당겨 새로운 차단 완충액으로 미세유체 채널을 세척합니다.튜브나 채널에 기포가 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 제조된 DNA 기질 1마이크로리터를 1밀리리터의 차단 완충액으로 희석합니다. 입구 튜브를 희석된 DNA 기판에 넣고 분당 200마이크로리터의 속도로 채널을 통해 800마이크로리터의 기판 용액을 흘립니다.흐름이 멈춘 후 15분 동안 DNA 용액이 채널에서 배양되도록 합니다. 배양 후 분당 200 마이크로리터의 속도로 채널을 통해 최소 800 마이크로리터의 차단 완충액을 흐르게 하여 결합되지 않은 DNA를 채널 밖으로 헹궈냅니다. 표면 테더링된 양자점이 명확하게 보이도록 현미경 초점을 조정합니다.분당 200마이크로리터의 유속으로 마그네슘이 없는 800마이크로리터의 실험용 버퍼로 미세유체 장치를 플러시합니다. REase를 마그네슘이 없는 실험용 완충액의 부분 표본에 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 분당 200마이크로리터의 유속으로 EcoRV 밀리리터당 400단위의 800마이크로리터를 흐르게 합니다.마그네슘과 플루오레세인이 포함된 실험용 완충액을 분당 200마이크로리터의 유속으로 흐르게 하여 실험을 시작합니다. 주사기 펌프를 시작한 직후 데이터 캡처를 시작합니다. 800 마이크로리터의 버퍼를 흘린 후 데이터 수집을 중지합니다.DNA 기질을 플로우 셀에 도입하고 과도한 DNA와 양자점을 씻어낸 후에는 일반적으로 시야에 수천 개의 개별 양자점이 있습니다. 유리 표면에 안정적으로 부착되며 실험 전반에 걸쳐 눈에 띄는 디밍이나 심각한 표백이 발생하지 않습니다. 마그네슘이 없는 상태에서 REase가 채널을 통해 흐르면 실험 시작 시 존재하는 양자점의 최소 95%는 관찰 기간이 끝난 후에도 여전히 볼 수 있습니다.그러나 REase 직후에 마그네슘 함유 완충액이 흐르면 관찰 기간이 끝날 때까지 양자점의 최대 절반이 사라지며, 이는 REase와 마그네슘이 함께 채널을 통해 흐를 때 관찰되는 것과 유사합니다. 양자점 소멸은 빠르게 발생하여 강도 궤적의 급격한 감소를 초래하여 주어진 DNA 분자가 절단되는 시간을 명확하게 표시합니다. 이 실험은 잘 연구된 유형 II P REase EcoRV로 수행되었습니다.비선형 최소 제곱 곡선 피팅과 최대우도 매개변수 추정을 모두 사용하여 데이터에서 n과 beta의 값을 추출했습니다. 두 가지 매개 변수 추정 방법이 일치했습니다. 비선형 최소제곱 피팅을 사용하면 n은 3.52초, beta는 5.78초입니다.최대우도 추정치를 사용하여 n은 3.41초, beta는 6.06초였습니다. 이 분석은 절단 경로를 따라 중간 단계가 존재한다는 증거를 제공할 수 있습니다. 변화하는 반응 조건에서 이 분석을 수행하면 직접 관찰할 수 없는 반응 중간체의 특성을 확립하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

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