Name: 형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 형광 태그 사코레 단백질을 이용한 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 사코레 단축 측정 방법을. 이 기술은 심근병증 연구 및 심장 질환 치료 개발에 활용됩니다.

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우리는 도움이 토론및 기술 지원을 위해 지치 의과 대학의 재생 의학 부서의 모든 실험실 구성원을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 의학 연구 개발 (AMED)에 대한 일본 기관의 보조금에 의해 지원되었다; JP18bm0704012 및 JP20bm0804018), 일본과학진흥협회(JSPS; JP19KK0219, 일본순환학회(기초연구보조금)

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<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li>
<li>Cho, G. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
<li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li>
<li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511%2F521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+%28ES%29+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).</li>
<li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).</li>
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<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
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<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization%2C+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).</li>
<li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li>
</ol>

H.U.는 이 원고와 관련된 특허를 출원했습니다.

PSC-CM은 심장 질환을 모델링하고 약물의 효과를 테스트하기 위해 시험관 내 플랫폼으로 활용 될 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고 PSC-CM 기능을 평가하는 정확하고 통일된 방법을 먼저 수립해야 합니다. 대부분의 기능성 검사는 PSC-CM, 예를 들어 전기생리학, 칼슘 과도 및 신진대사(26)와함께 작동하며, 최초의 환자 유래 PSC-CM 연구 중 하나는 긴 QT 증후군27에관한 것이었다. 그러나, 수축, 심근 세포의 가장 중요 한 기능 중 하나, 여전히 평가 하기 어렵다. 성인용 심근세포로, 사코프레 단축이 널리 사용됩니다. 대조적으로, PSC-CM의 저개발 및 무질서한 sarcomere 때문에, sarcomere 단축을 위한 표준 방법은 이 세포와 함께 작동하지 않습니다. 따라서, 우리는 형광 태그 sarcomere 단백질을 사용하여 PSC-CM에 있는 sarcomere 단축을 검토하기 위한 대체 방...

심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률의 주요원인이며 심근병증은 심장 관련 사망의 세 번째 원인을 나타낸다2. 심근병증은 심장 근육에 영향을 미치는 질병의 집단 그룹입니다. 유도 된 다능성 줄기 (iPS) 세포와 심근 세포 (PSC-CM)를 향한 iPS 세포의 지시 분화의 최근 개발은 심근병증의 체외 모델로 환자 게놈으로 심근세포를 연구하기위한 문을 열었습니다. 이들 세포는 심장 질환의 병리생리학을 이해하고, 분자 메커니즘을 해명하고, 다른 치료 후보3을테스트하는 데 사용될 수 있다. 이와 같이, 환자 유래 iPS 세포가 생성되었다(예를 들어, 비대성 심근병증 [HCM]4,5,부정맥 우심심근병증 [ARVC]6,확장된 심근병증 [DCM]7,및 미토콘드리아 관련 심근병증,미토콘드리아관련 심근병증이있다. 심근병증의 특성 중 하나는 sarcomeres의 기능 장애 및 중단이기 때문에, 상반신 기능을 균일하게 측정하는 유효한 도구가 필요합니다.
Sarcomere 단축은 동물 모델과 인간에서 파생 된 성인 심근 세포의 sarcomere 기능과 수축을 평가하는 가장 널리 사용되는 기술입니다. 사컴레 단축을 수행하려면 위상 대비하에서 보이는 잘 발달된 사카레가 필요합니다. 그러나, 시험관 내 디스플레이에서 배양된 PSC-CM은 저개발 및 무질서한 사코머를 나타내므로, 따라서, 사르코름단축(10)을제대로 측정하는 데 사용할 수 없다. PSC-CM의 수축성을 제대로 평가하는 이 어려움은 시험관 내심장 기능을 평가하는 플랫폼으로서의 사용을 방해합니다. PSC-CM 수축을 간접적으로 평가하기 위해, 원자력 현미경 검사법, 마이크로 포스트 어레이, 견인력 현미경 검사법 및 임피던스 측정은 이러한 세포가 주변 환경에 가해지는 모션의 효과를 측정하는 데 사용되어 왔다11,12,13. 실제 세포 운동의 보다 정교하고 덜 침습적인 비디오 현미경 기록(예를 들어, 소니로부터 SI8000)은 수축도 를 대안적으로 평가하는 데 사용될 수 있지만, 이 방법은 사르코메어 모션 또는 강제 생성운동학(14)을직접 측정하지 는 않는다.
PSC-CM에서 사코머 운동을 직접 측정하기 위해, 사코머 단백질에 형광 태깅과 같은 새로운 접근이 나타나고 있습니다. 예를 들어 Lifeact는 사마필모션(15,16)을측정하기 위해 필라멘트 액틴(F-actin)에 라벨을 붙이는 데사용된다. 유전자 변형 iPS 세포는 형광단백질17,18,19에의해 사코메르 단백질(예를 들어, α 액틴 [ACTN2] 및 Myomesin-2 [MYOM2])를 태깅하기 위한 또 다른 옵션이다.
이 논문에서는 Myom2-TagRFP(마우스 배아 줄기 [ES] 세포) 및 ACTN2-mCherry(인간 iPS 세포)를 사용하여 sarcomere 단축을 측정하기 위한 타임랩스 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 패턴 문화가 사마머 정렬을 용이하게한다는 것을 보여줍니다. 또한, 당사는 환자 유래 iPS 세포에 널리 적용될 수 있는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 사르메레 라벨링의 대체 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1-티오글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(55mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린(MPC) 폴리머,</td><td>NOF Corp.</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>후지필름 wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>폴리머 커버슬립이 있는 35mm 이미징 접시(&마이크로;-접시 35mm, 높음)</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR Helper Free System (AAV6) (벡터; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td><td>Takara</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry(AR12, AR21) hiPSC</td><td>N.A.</td><td></td><td>다른 곳에서 설명한 방법(Anzai, Methods Mol Biol, in press)</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), 무혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td> (50X), insulin <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50X), minus vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>벤조나제(25 U/&마이크로; L)</td><td>Merck Millipore</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Fujifilm wako</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4, 인간, 재조합,</td> <td>R & 주식회사 디 시스템즈</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59, Wnt 길항제(WntC59)</td><td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>CAD 도면 소프트웨어,</td> <td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td><td>코뿔소 6.0</td><td></td></tr><tr><td>원심 한외여과 장치(100k MWCO), Vivaspin-20</td><td>Sartorius</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>크롬 에칭</td><td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., 일본</td><td>N14B</td><td></td></tr><tr><td>AZP1350</td><td>Clean Surface Technology Co., 일본</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE 침전 캐리어 (20mg / mL 글리코겐, 3M 아세트산 나트륨 (pH 5.2))</td> <td>Takara</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM) - 고혈당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM) - 고포도당, 피루브산 나트륨 없음</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (99.5)</td><td>Fujifilm wako</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Moregate</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10, 인간, 재조합,</td> <td>R & 주식회사 디 시스템즈</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자(기본), 인간, 재조합</td><td>후지필름 wako</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>돼지 피부 분말에서 추출한 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>GLASS BOTTOM culture plates</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>Ham& 알스코오; s F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 변형 둘베코 배지 (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닌-L-글루타민 (GlutaMAX 보충제, 200mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-아스코르브산 나트륨 염</td><td>후지필름 와코</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>라미닌-511 E8 단편 ( LN511-E8, iMatrix-511)</td><td>Nippi</td><td>892012</td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>Union Optical Co., Ltd., 일본</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>마스크리스 리소그래피 도구</td><td>NanoSystem Solutions, Inc., 일본</td><td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV 주사기 필터 장치, 0.45 &micro; m, PVDF (0.45-&마이크로; m filter)</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP (SMM18)</td><td>N.A.</td><td></td><td>이전 논문(Chanthra, Sci Rep, 2020)에서 개발</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 디지털 CMOS 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sansei medical co. Ltd</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머</td><td>다우코닝 Corp., MI, USA</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민 MAX (MW. 40,000)</td><td>폴리사이언스</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>포지티브 포토레지스트 현상</td>액 <td>Tokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., 일본</td><td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간/마우스/쥐 Activin A 단백질</td><td>R& 주식회사 디 시스템즈</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>재조합 트립신 유사 프로테아제(rTrypsin; TrypLE express)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Mikasa Co., Ltd., Japan</td><td>MS-A100</td><td></td></tr><tr><td>Spininng 컨포칼 현미경 옥</td><td>스포드 기기</td><td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td><td></td></tr><tr><td>StemSure LIF, 마우스, 재조합, 솔루션 (10 ^ 6U)</td><td>Fujifilm wako</td><td>195-16053</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3010</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 3010</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 개발자</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant</td><td>Fujifilm wako</td><td>226-01781</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 sarcomere 단축.

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

다능성 줄기 세포 유래 심근세포(PSC-CM)는 배아 및 유도된 다능성 줄기(ES/iPS) 세포 모두에서 생성될 수 있다. 이 세포는 심장 질병 모델링을 위한 유망한 근원을 제공합니다. 심근병증의 경우, sarcomere 단축은 성인 심근세포와 함께 질병 표현형을 검사하는 표준 생리학적 평가 중 하나입니다. 그러나, 사용 가능한 방법은 PSC-CM의 수축도 평가하기에 적합하지 않습니다, 이러한 세포는 위상 대비 현미경 검사의 밑에 보이지 않는 저개발 사코메레스가 있기 때문에. 이 문제를 해결하고 PSC-CM을 사용하여 sarcomere 단축을 수행하기 위해 형광 태그 사코레 단백질및 형광 라이브 이미징이 사용되었습니다. 얇은 Z 라인과 M 라인은 각각 사마레의 양쪽 끝과 중앙에 있습니다. Z라인 단백질 -α-액티닌(ACTN2), 텔레토닌(TCAP), 액틴 관련 LIM 단백질(PDLIM3) 및 1개의 M라인 단백질—묘메신-2(Myom2) -는 형광 단백질로 태그하였다. 이러한 태그된 단백질은 내인성 대립구도에서 노크인또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 발현될 수 있다. 여기서는 마우스와 인간 만능 줄기 세포를 심근세포로 분화하고, AAV를 생산하고, 라이브 이미징을 수행하고 분석하는 방법을 소개합니다. 또한 형광 태그 단백질로 sarcomere 단축의 분석을 용이하게 PSC-CM의 패턴 문화에 대한 폴리디메틸실록산 (PDMS) 우표를 생산하는 방법을 설명합니다. 사컴 단축을 평가하기 위해 박동 세포의 시간 경과 이미지는 전기 자극(0.5-1Hz)에서 높은 프레임레이트(초당 50-100 프레임)로 기록되었다. 셀 수축 과정에서 사코메 길이를 분석하기 위해, 기록된 타임랩스 이미지는 ImageJ/Fiji의 플러그인인 SarcOptiM을 적용하였다. 우리의 전략은 PSC-CM에서 심장 질환 표현형을 조사하기위한 간단한 플랫폼을 제공합니다.

노크인 PSC-CM 기자 라인을 사용하여 sarcomere 단축 측정. Sarcomere 라벨PSC-CM은 사코름 단축을 측정하는 데 사용되었습니다. 이 라인은 내인성 로시에서 Myom2-RFP 및 ACTN2-mCherry를 표현합니다. TagRFP는 M라인으로 국소화되는 M-단백질을 코딩하는 M-단백질을 코딩하는 Myom2에삽입되었으며, mCherry는 ACTN2에노크하고, 코딩 α-액티닌은 Z라인18,25로국소화되었다. 타임랩스 이미지는 피규어 1과 2및 영화 1-3에제시된 바와 같이 사컴레 단축을 결정하는 데 사용되었다.
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이 방법은 형광 태그 sarcomere 단백질을 가진 다능한 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 sarcomere 단축을 검사하는 것을 이용할 수 있습니다.

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

다능성 줄기 세포 유래 심근세포에서 sarcomere 기능을 평가하기는 어렵습니다. 형광 태그 사커레 단백질을 사용하여, 우리는 지금 sarcomere 단축에 접근할 수 있습니다. 우리는 sarcomeres를 시각화하고 줄기 세포 유래 심근세포및 형광 태그 sarcomere 단백질을 사용하여 체외에서 그들의 기능을 평가할 수 있습니다.AAV 기반 트랜스듀션을 사용하여, 당사는 모든 환자 유래 유도 만능 줄기 세포로 방법을 확장할 수 있습니다. 이 방법은 체외에서 질병 관련 사코메레 기능 장애를 직접 평가하는 데 사용될 수 있기 때문에 심근병증 치료의 발달로 확장될 수 있다. 이 방법은 소아 심장학 연구를 포함하여 심장학 분야에서 유용합니다.그러나, 그것은 또한 골격 근육 기능 장애의 연구에 적용 될 수 있습니다., 근 병 증 등. 차별화 유도의 마이너스 4일에, 37섭씨 와 5%의 이산화탄소에서 30분 배양에 PBS에서 희석된 라미닌-511 E8의 평방 센티미터 당 0.5 마이크로그램으로 6웰 플레이트를 코팅합니다. 인큐베이션의 끝에 가까워지면, 37°C에서 3분 동안 재조합 트립신으로 인간이 유발한 만능 줄기 세포를 치료한다.세포가 분리되면, 카운트에 대한 10%FBS로 보충된 배지에 세포를 수확하고, 원심 분리 후 라미닌-511 E8 및 ROCK 억제제로 보충된 AK02N 배지의 2밀리리터 당 5세포에 1.25배 10배로 세포를 재연한다. 다음으로, 6웰 플레이트의 각 웰에서 코팅 용액을 흡인시키고, 각 우물에 2밀리리터의 세포를 시드한다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.4 일 후에, 세포는 80%의 합류에 도달합니다. 각 웰의 상체를 GSK-3 억제제로 보충한 인슐린 배지 없이 RPMI 플러스 B27의 2밀리리터로 대체하여 분화를 유도한다. 분화 2 일 후, 부드럽게 잘 당 포큐파인 억제제로 보충 인슐린 매체없이 RPMI 플러스 B27의 2 밀리리터로 배지를 교체.세포는 100%의 합류에 도달했어야 합니다. 차별화의 4 일째에, 부드럽게 잘 당 인슐린없이 RPMI 플러스 B27의 두 밀리리터로 슈퍼 네이션을 교체. 세포는 고밀도로 남아 있어야 하며 일부는 떠다니기 시작했을 수 있습니다.7일째와 9일째에, 선택적 만능 줄기 세포 유래 심근세포 배양을 위해 푸오마이신으로 보충된 인슐린으로 RPMI 플러스 B27의 2밀리리터와 각각의 상체를 대체한다. 이 시점에서, 구타 세포는 배양 내에서 관찰되어야한다. 패턴만능 줄기 세포 유래 심근세포 배양을 설정하려면 먼저 수선 테이프를 사용하여 맞춤형 PDMS 스탬프의 표면에서 먼지를 제거하고 70%에 이르는 스탬프를 잠깐 잠정적으로 잠급니다.에어 더스터를 사용하여 우표 표면에서 에탄올을 제거하고 표면을 0.5% MPC 폴리머 및 에탄올의 5~10마이크로리터로 처리합니다. 폴리머가 완전히 건조되면 35mm 이미징 접시에 폴리머 커버슬립에 스탬프를 놓고 스탬프에 무게를 놓습니다. 10분 후, 가벼운 현미경을 사용하여 패턴이 커버슬립으로 옮겨졌는지 확인하고 PBS로 접시와 커버슬립을 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후, 커버슬립을 실온에서 2~4시간 배양하기 위해 0.1%젤라틴으로 희석된 라미닌-511 E8의 평방 센티미터당 0.5~1마이크로그램으로 코팅합니다. 분화의 10 일째에, PBS로 세포를 두 번 씻고, 섭씨 37도에서 3 5 분 동안 잘 재조합 트립신 1 밀리리터로 치료합니다. 계산 후, RPMI의 밀리리터 당 5 세포에 2.5 ~ 5 배 10에 세포를 다시 일시 중단하고, 푸오 마이신 농도로 보충 인슐린과 B27, 37 섭씨에서 하룻밤 배양에 대한 접시에 세포의 1 밀리리터를 종자.다음 날 아침, 상체를 신선한 RPMI 플러스 B27로 대체하여 푸오마이신으로 보충된 인슐린으로 대체하고, 세포를 세포 배양 인큐베이터로 돌려보내, 이미징을 위해 21일에서 28일까지 일주일에 2~3회 중간을 상쾌하게 한다. PCCSM 배양에서 sarcomere 단축의 시간 경과 화상 진찰을 위해, 형광 공초점 현미경의 100 배 객관적인 렌즈에 기름을 적용하고, 관련 소프트웨어에서 살아있는 화상 진찰 조건을 선택합니다. 좋은 대표 데이터를 얻으려면 가장 높은 프레임 속도를 선택하고 셔터를 열어 놓고 획득 영역의 작물에 4x4 비닝을 적용하여 시간 경과 이미징 중에 이미지 간의 최단 간격을 달성합니다.세포의 구타 속도가 낮으면 전기장 자극에 의해 세포를 연상시키고 시간 경과 기록을 시작하여 이미징 중에 이미지 필드가 초점상태로 남아 있음을 주의하십시오. 이미징 기간이 끝나면 시간 경과 이미지를 적절한 폴더에 저장합니다. 시간 경과 이미지를 분석하려면 일련의 타임랩스 이미지를 ImageJ로 열고 사커머 패턴을 명확하게 관찰 할 때까지 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.모어 도구 메뉴에서 SarcOptiM을 선택하고 도구 모음의 컨트롤 시프트 P와 하나의 미크론 버튼을 눌러 프로그램을 보정하는 지침을 사용합니다. 그런 다음 sarcomere 단축을 측정하는 데 사용할 사컴레 의 영역에 걸쳐 선을 그리고 단일 셀 AVI를 클릭하여 사컴레 단축 분석을 시작합니다. 사코프레 라벨, 패턴만능 줄기 세포 유래 심근세포의 시간 경과 이미징은 상이한 시점에서 sarcomere 단축을 측정하는 데 사용될 수 있다.패턴형 다능줄기 세포 유래 심근세포 배양에서 전형적으로 관찰되는 사코메르 해체를 극복하기 위해, 특정 PDMS 우표는 패턴화된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포를 스트라이프 패턴으로 배양하는 데 사용될 수 있으며, 이는 비패턴 영역에서 배양된 세포 에 비해 길쭉한 세포 모양과 보다 조직화된 사림귀 패턴을 촉진한다. 패턴 배양은 또한 더 나은 세포 수축을 촉진하고 비 패턴 배양 세포에 비해 매끄러운 sarcomere 길이 프로파일을 제공합니다. AAV-변환 패턴 만능 줄기 세포 유래 심근세포는 3일 후 트랜스듀션 후 패턴만능 줄기 세포 유래 심근세포를 따라 육종 GFP 신호를 발현하고 또한 사코메 수축 프로파일을 측정하는 데 사용될 수 있다.또한, 트랜스듀션 시 블라실시딘 내성 유전자를 첨가하여 패턴형 다능성 줄기 세포 유래 심근세포 선택을 90% 이상의 순도로 용이하게 하기 위해 보다 쉽고 높은 품질의 이미지 분석을 용이하게 하기 위해서는, 선형으로 이동되는 사르코메어를 가진 영역을 식별하고 가장 높은 프레임 속도로 이미지를 얻는 것이 필수적이다. 이 방법을 사용하여, 우리는 질병 특정, 환자 유래 iPS 세포에서 파생된 실험실 심근세포에 있는 sarcomere 기능 장애를 연구하기 위하여 육종 단백질에 있는 성숙의 역할을 평가할 수 있습니다.

sarcomere-shortening-pluripotent-stem-cell-derived-cardiomyocytes

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아2 + 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

여기서, 광학 기반 플랫폼을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 수축성 및 칼슘 측정을 수행하는 확립된 방법이 설명되어 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 돌연변이의 효과와 다양한 자극에 대한 반응을 빠르고 재현 가능한 방식으로 연구할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 칼슘 및 수축성 매개변수의 실시간 측정

배우세요 형광 태그 사코레 단백질을 이용한 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 사코레 단축 측정 방법을. 이 기술은 심근병증 연구 및 심장 질환 치료 개발에 활용됩니다.

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

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