Name: Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 학습하세요 Anopheles gambiae에서 GAL4-UAS 시스템을 이용한 기능 유전학 분석 방법을. 유전자 발현의 시공간적 제어를 통해 살충제 내성 및 유전적 방제 전략 관련 유전자를 연구할 수 있습니다.

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우리는 감사로 LSTM과 IVCC (아드리아나 아돌피), BBSRC (새로운 조사자 상 (AL), MRC (BCP에 박사 학생 교직 박사 학생: MR / P016197/1), 웰컴 (경 헨리 웰컴 박사 후 박사 과정 펠로우십 LG: 215894/ Z/ 19/Z) 그 제안에 Gal4UAS 분석을 통합했습니다.

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<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+validation+of+key+genes+conferring+insecticide+resistance+in+the+major+African+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).</li>
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모기 유전자 기능을 이해하는 것은 Anopheles를 통제하고 말라리아 전송에 영향을 미치기 위하여 새로운 접근을 개발하는 것이 중요합니다. 설명된 GAL4-UAS 시스템은 후보 유전자의 기능적 분석을 위한 다재다능하고 강력한 시스템으로 현재까지 우리는 살충제 저항17 및 큐티큘러 탄화수소 생산의 유전적 기초를 검사하고, 형광태그상이다른 모기세포 집단8 . 지금까지 응답자 구조는 제한 효소 복제를 통해 플라스미드로 복제하여 UAS의 여러 복제 부위를 하류로 운반하였다(그림 1, 표 1). 그러나 여러 요소(attB 사이트, 3xP3-YFP 및 집시 절연체 시퀀스)를 운반하는 구체의 모듈식 특성으로 인해 새로운 응답자 플라스미드...

이 양파르트-UAS 시스템은 곤충 모델 유기체 Drosophila melanogaster1,2,3에서 유전자의 기능적 특성화의 주력이다. GAL4-UAS 시스템을 사용하기 위해, 변성 드라이버 라인은, 규제 서열의 통제하에 효모 전사 인자 GAL4를 표현하고, GAL4에 의해 인식되는 업스트림 활성화 서열(UAS)에 의해 제어되는 관심 또는 RNA 간섭(RNAi) 구조의 유전자를 운반하는 응답자 라인과 교차된다. 본 십자가의 자손은 GAL4 발현을 제어하는 프로모터에 의해 지시된 현면 패턴에 대한 관심의 변형을 표현한다(도 1). 운전자-응답자 십자가의 자손에 의해 표시되는 표현형은 후보 유전자의 기능을 해명하기 위하여 평가될 수 있다. D. 멜라노가스터는 다른 유기체로부터 유전자를 검사하는 데 사용되었지만4,5,6,7, GAL4-UAS 시스템은 이제 관심있는 종에 대한 직접 분석을 제공하기 위해 의료 및 농업 중요성의 곤충에 사용하기 위해 적응되어 8,9,9,10,11,12,13,14.
아프리카 말라리아 모기에서, Anopheles 감비아, GAL4-UAS 시스템은 세포주 공동 형질제9에 의해 처음으로 시험되었습니다. 여러 개의 구조는 서로 다른 쌍방향 조합의 효율성을 위해 분석되었으며, 14개의 UAS가 작은 인공 인트론(UAS-14i)으로 보충되어 GAL4 드라이버 패널과 함께 사용할 때 가장 광범위한 활성화 잠재력을 나타낸다는 것을 발견했습니다. 생체 내 기능을 입증하기 위해, 이러한 구조는 PiggyBac 변환8에 의해 두 개의 별도의 형질형 An. 감비아 라인을 만드는 데 사용되었다: midgut 특정 프로모터에 의해 구동 GAL4를 운반하는 드라이버 라인, 그리고 UAS 서열의 규정에 따라 루시파라제및 향상된 황색 형광 단백질 (eYFP) 유전자를 모두 포함하는 응답자 라인. 자손의 직감 특이적 루시파제 활동과 형광은 시스템이 Anopheles에서 효율적이라고 지적했다. 그 이후, 운전자 라인은 이노뉴테15 및 혈구16을 포함한 벡터 용량 및 살충제 저항에 중요한 다른 조직에서 전경과를 발현하고, 유비쿼터스 패턴10에 가깝게 만들어졌다. 수많은 UAS 라인은 또한 대사 및 격리 중재 살충제 저항, 큐티칸 탄화수소 합성 및 형광 태그 다른 세포 및 조직 유형 (표 1)에 관여하는 것으로 생각 되는 분석 유전자에 생성 되었습니다. 응답자 라인의 경우, 이제 ΦC31 촉매 재조합 카세트 교환17,18에 의해 생성되어 UAS 규제 유전자의 게놈 컨텍스트를 수정하여 트랜스진의 현장 지향적 통합이 수행된다. 이러한 방식으로, 유전자 발현은 게놈 삽입 위치에 대해 정상화되어 상이한 후보 유전자의 표현 효과보다 정확한 비교를 가능하게 한다.
현재까지 생성된 응답자 라인은 높은 수준에서 트랜스진을 발현하거나 RNA 간섭(RNAi)을 통해 유전자 발현을 감소시키도록 설계되었습니다. 일반적으로 cDNA 클론은 UAS 서열에 융합되어 적절한 발현 플라스미드를 생성하지만 전체 게놈 서열도 복제에 너무 크지 않다고 가정할 수 있습니다. 침묵 구조를 생성하기 위해, 우리는 RNAi를 자극하는 헤어 핀 dsRNA를 형성하는 적절한 탠덤 반전 시퀀스를 얻기 위해 세 가지 다른 방법을 사용했다. 여기에는 융합 PCR, 비대칭 PCR 및 헤어핀 구조의 상업적 합성이 포함되었습니다. 각 방법에 공통적으로 복제 안정성을 제공하기 위해 반전된 시퀀스 사이에 인트론 시퀀스를 포함시키는 것이 일반적이다. 관심/RNAi 구조유전자를 삽입할 수 있는 응답자 플라스미드가 개발되었다15. 이 플라스미드는 또한 RMCE에 필요한 ΦC31 attB 사이트를 수행합니다 (RCME 기술을 자세히 설명하는 JoVE 종이와 함께 아돌피에 설명). 과발현을 위해 이러한 플라스미드 중 하나에 삽입시퀀스를 선택할 때 필요한 중요한 단계를 다루는 프로토콜이 이 원고에 포함되어 있습니다. 또한 RNAi 헤어핀 구조 생성을 위한 두 가지 프로토콜이 설명되고 설명되어 있습니다.
새로운 라인을 만들 때, 희귀 한 형질 전환 개인의 식별은 설립하고 형질 전환 식민지를 유지하기 위해 번식하는 것이 중요합니다. 가장 중요한 것은 GAL4-UAS 시스템의 경우 응답자와 운전자 라인을 구별하여 교차를 설정하고 두 트랜스유전자를 모두 수행하는 개별 자손을 식별할 필요가 있습니다. 이것은 드라이버와 응답자 카세트에 연결된 다른 지배적인 선택 가능한 마커 유전자를 사용하여 달성됩니다. 가장 일반적으로 이들은 광학 필터를 사용하여 명확하게 구별되는 형광 마커 유전자입니다 (예를 들어, eYFP, eCFP, dsRed). 이 이상과 오염의 식별을 쉽게하기 때문에 마커는 알려진 신뢰할 수있는 실각 측량 패턴으로 표현되는 것이 중요합니다. 형광 마커 유전자 발현은 합성 3xP3 프로모터에 의해 일상적으로 조절되며, 이는 An. 감비아 개발의 모든 단계에서 눈과 복부 신경리아 특이적 발현을 일으킨다. 3xP3 에 의해 제어되는 형광 마커는 이 문서에 기재된 모든 변환 플라스미드에 포함되어 있습니다. 형광을 검사하는 데 사용되는 일반적인 방법을 자세히 설명하는 프로토콜 An. 감비아 에 푸파에 GAL4-UAS 라인이 여기에 포함되어 있습니다.
GAL4-UAS 시스템의 핵심 요소 중 하나는 차별화된 표시된 드라이버 및 응답자 라인을 교차해야 한다는 것입니다. 각 줄에서이 남성과 여성은 짝짓기 전에 분리해야합니다. 성인은 시력에 의해 쉽게 구별 할 수 있습니다, 그러나, 유전 십자가를 확립하기위한 것은 짝짓기가 발생하지 않았는지 확인하기 위해 성인 출현 전에 남녀를 분리하는 것이 합리적이다. 남성과 여성의 일반적인 크기 차이는 너무 가변적이며, 성결정의 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법이 될 수 있다20. 대신 외부 생식기에 명확한 형태적 차이는 An. 감비아에서 섹스에 대한 신뢰할 수있는 기초를 제공합니다. 이 기사에서는 적절한 십자가를 세우기 위해 An. 감비아 푸를 섹스하는 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다.
<img alt="모기에서 RNAi를 사용한 유전자 편집 과정, 복제, 주사 및 표현형 분석을 다루는 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1 - 아노펠스 감비아에서 이중 PARTite GAL4-UAS 시스템을 사용하기 위한 공정의 다이어그램 표현. (A) 예시 벡터(pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]의 주요 구성 요소는 사용 가능한 제한 부위(EcoRI, NheI, XhoI 및 NcoI)를 상세히 묘사하며, 이는 관심 있는 유전자에 대한 헤어핀 구조 또는 코딩 서열을 삽입하는 데 사용하기에 적합한 다중 복제 부위 내에서 묘사된다. 도킹 라인의 구조도 묘사됩니다. (B) 교차 단계는 운전자 라인(3xP3 프로모터에 의해 구동되는 관심 및 eCFP의 발기인에 의해 GAL4 드라이버를 운반)과 응답자 라인에서 여성의 사용을 나타내는 것으로 도시된다(UAS 프로모터에 의해 제어되는 관심 또는 헤어핀 구조의 유전자를 운반하고 3xP3 프로모터에 의해 제어되는 eYFP 마커). (C) B에서 십자가의 자손에 대한 관심 유전자의 GAL4 구동 발현과 평가되는 전형적인 표현형의 일부 목록의 다이어그램 표현. 약어: 다중 복제 부위(MCS), 재조합 중재 카세트 교환(RMCE), 업스트림 액티베이터 서열(UAS), 향상된 황색 형광 단백질(eYFP), 향상된 시안 형광 단백질(eCFP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그것은 더 선형 접근 에 비해 뚜렷한 장점을 가지고 GAL4-UAS 시스템의 쌍층 특성을 제공하는 십자가의 사용이다. 예를 들어, 드라이버 와 응답자 라인의 더 많은 조합은 새로운 형질 전환선이 생성되고 각 프로모터/유전자 조합에 대해 유지되어야 하는 경우 실현 가능한 것보다 평가될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 선형 시스템에서 생성/유지가 어려운 발현이 위태로빙될 때 치명적또는 멸균 표현형을 생성하는 유전자의 분석을 허용한다. 이러한 치명적인 표현형은 유전자 기능 및 현면 발현에 따라 모든 발달 단계에서 나타날 수 있지만 배아 발달 중에 가장 자주 관찰됩니다. 모기 배아 발달을 시각화하려면 계란을 코팅하는 불투명한 초리온을 비우는 것이 필요합니다. Trpiš (1970)21 및 Kaiser 외.(2014)22에 기술된 방법에 따라, 우리는 구조적 무결성을 유지하면서 배아를 고치는 데 사용하는 프로토콜을 설명하고, 미세한 시각화 및 이미징을 허용하는 엔도토리온을 지우기 위해 표백합니다.

<table><tbody><tr><td>100 x 15 mm 플라스틱 페트리 디쉬</td><td>SLS</td><td>2175546</td><td>10개 팩</td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L Gilson 피펫</td><td>Gilson</td><td>F144059P</td><td></td></tr><tr><td>20/25 mL 범용 튜브</td><td>Starlab</td><td>E1412-3020</td><td>400 팩</td></tr><tr><td>3 mL 파스퇴르 피펫</td><td>SLS</td><td>G612398</td><td>Greiner 파스퇴르 피펫 3 mL 멸균 개별 포장</td></tr><tr><td>50 mL 팔콘 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>11512303</td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>SLS</td><td>45726-1L-F</td><td>1 L</td></tr><tr><td>케이지</td><td>SLS</td><td>E6099</td><td>30x30x30 스크린 포트</td></tr><tr><td>미세 페인트 브러쉬</td><td>아마존</td><td>UKDPB66</td><td>KOLAMOON 9 개 디테일 페인팅 브러쉬 세트 미니어처 브러쉬 수채화, 아크릴 페인팅, 유화 (와인 레드)</td></tr><tr><td>생선 식품</td><td>아마존</td><td></td><td>Tetra Min Fish Food, 모든 열대어를 위한 건강, 색상, 활력을 위한 완전한 음식, 10 L&nbsp;</td></tr><tr><td>포름알데히드 솔루션</td><td>시그마 알드리치</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>마우스 아스피레이터</td><td>존 호크</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>연못 소금</td><td>아마존</td><td></td><td>블래그던 가디언 연못 토닉 소금, 물고기 건강, 수질, 일반 토닉, pH 버퍼, 9.08 kg, 9,092 L&nbsp를 처리;</td></tr><tr><td>번데기 냄비</td><td>Cater4you</td><td>SP8OZ</td><td>250개의 뚜껑이 있는</td></tr><tr><td>냄비 작은 플라스틱 양동이</td><td>아마존</td><td></td><td>2.5 L 흰색 플라스틱 통 흰색 뚜껑 완성 (10개 팩)&nbsp;</td></tr><tr><td>차아염소산나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S25552</td><td></td></tr></tbody></table>

anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 gal4-uas 시스템을 이용하십시오

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

이중 형 GAL4-UAS 시스템은 기능성 유전 분석을위한 다재다능하고 강력한 도구입니다. 시스템의 본질은 조직 특정 방식으로 효모 전사 인자 GAL4를 표현하는 형질전환 '드라이버' 라인을 교차하는 것으로, GAL4를 결합하는 업스트림 활성화 서열(UAS)에 의해 발현이 조절되는 후보 유전자/RNA 간섭 구조를 운반하는 형질형 '응답자' 라인을 갖는다. 이어지는 자손에서, 유전자 또는 침묵 구조는 이렇게 규정된 현면 방식으로 발현되어 결과 표현형을 분석하고 유전자 기능을 유추할 수 있게 한다. 이 바이너리 시스템은 심한 피트니스 비용이 유도되더라도 여러 조직 별 패턴에서 트랜스진 발현에 의해 생성된 표현형을 선별하는 실험적 접근법의 유연성을 가능하게 한다. 우리는 Anopheles 감비아에 대 한이 시스템을 적응, 아프리카에 있는 주요 말라리아 벡터.
이 문서에서는 GAL4-UAS 분석 중에 사용되는 몇 가지 일반적인 절차를 제공합니다. 우리는 이미 생성 된 An. 감비아 GAL4-UAS 라인뿐만 아니라 업 규제 및 RNAi 노크다운을위한 새로운 응답자 구조의 복제를 설명합니다. 우리는 유전 십자가를 확립하기 위하여 모기 강아지의 성화를 위한 단계별 가이드를 지정합니다, 또한 드라이버와 응답자 삽입을 태그하는 형광 유전자 마커의 상속을 따르는 검열 자성을 포함합니다. 우리는 또한 배아 발달을 연구하기 위하여 An. 감비아 어 태아를 지우기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마지막으로, 대상 유전자의 GAL4 다운스트림의 CRISPR/Cas9 삽입을 통해 드라이버 라인을 생성하는 방법의 잠재적 인 적응을 소개합니다.

eYFP, dsRed 및 eCFP의 3xP3 발현은 안감비아푸에의 눈과 복부 신경리아에서 발현을 생성하는 마커 유전자를 소유한 개인의 신뢰할 수 있고 쉽게 구별할 수 있는 식별을 제공한다(도 3). 성별에 사용되는 남성 및 여성 외성 생식기에서 관찰되는 차동 형태와 식별할 수 없는 pupae의 예는 도 4에서 강조된다. 항문 패들이 생식기의 시각화를 모호하게함에 따라 pupae에서 모든 물을 제거하면 섹스링 어려움이 증가합니다(그림 4D, E). 이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 유비쿼터스(도 6A, C) 및 이노세포 동인(도 6B,D) 라인을...

이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 Anopheles 감비아에서 기능성 유전 분석을 허용하는 제어된 스파티오 측량 방식으로 유전자 발현을 수정하기 위한 다목적 도구입니다. 이 시스템을 사용하기 위해 설명된 절차는 형광 단백질 마커 및 배아 고정을 위한 pupae의 반 표준화된 복제 전략, 섹스링 및 검열입니다.

Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

bipartite GAL4-UAS 시스템은 현면 조절 방식으로 유전자 발현의 유전자 변형을 통해 Anopheles 감비아에 있는 기능적인 유전 분석을 위한 다목적 공구입니다. 이진 시스템은 심각한 피트니스 비용이 유도되더라도 유전자 발현의 표현성 특성화를 위한 실험적 접근법의 유연성을 가능하게 합니다. 이 시스템은 살충제 저항, 병원체 전송, 또는 유전 통제 방법에 사용된 유전자의 현상 특성화를 위해 사용될 수 있습니다.연구 기술자 인 Fraser Coleman은 스테레오 현미경으로 사용하기에 적합한 명확한 평평한 접시에 잘라 3 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 pupae를 수집하여이 절차를 시연하는 데 도움이됩니다. 조심스럽게 강아지 주변의 물의 대부분을 제거합니다. 형광 전구를 켜고 따뜻하게 합니다.형광 마커를 선별할 때 예상되는 다른 표현형의 발현 및 비율의 색상 현면 패턴을 고려하십시오. 형광 스테레오스코프에서 필요한 필터를 선택하고 스테이지 플레이트의 중앙을 향하는 빛의 색광선이 있는지 확인합니다. 백색광 아래에서, 볼 의 필드에 강아지를 중심으로 초점을 가져.백색광을 끄고 미세 한 초점을 사용하여 눈에 보이는 형광 패턴으로 관심표현형을 운반하는 강아지의 영역을 가져옵니다. 미세한 디테일의 페인트브러시를 사용하여 강아지를 부드럽게 돌리고 항문 패들을 움직여 외부 생식기를 식별할 수 있습니다. 특유의 외부 생식기를 기반으로 한 별도의 푸파.남성은 항문 패들의 길이의 약 절반에 달하는 최종 등쪽 세그먼트에서 압출되는 긴 튜브를 가지고 있습니다. 여성 강아지의 외부 생식기는 상당히 짧고 양면. 성별된 푸파를 10밀리리터 튜브에 물로 분리하고 코튼 울 공으로 튜브를 밀봉합니다.튜브에서 원하는 수의 남성과 여성 성인을 케이지 또는 작은 양동이로 흡입하여이 전송 중에 성인을 손상시키지 않도록주의하십시오. 혈액 공급 하기 전에 5 ~ 7 일 동안 십자가를 유지 합니다. 다음 날, 계란은 배아 발달을 연구하기 위하여 집합될 수 있습니다.oviposition 챔버를 조립하 고 신중 하 게 소개 10 받는 것 15 혈액 공급 여성 그것에. oviposition 챔버를 덮고 20 분 동안 둡니다. 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브를 oviposition 냄비에서 조심스럽게 분리하여 모기를 방출하지 않도록 합니다.냄비를 덮고 계란이 관심의 발달 단계로 성숙 할 수 있습니다. 미세한 디테일의 페인트브러시를 사용하여 냄비에서 계란을 집어 40 평방 밀리미터 굴착 유리 블록에 물에 놓습니다. 마이크로파이프로 유리 블록에서 물을 조심스럽게 제거하고 500 마이크로리터의 FAA로 달걀을 덮습니다.실온에서 궤도 셰이커를 30분 동안 부드럽게 진동시합니다. 완전히 FAA 용액의 모든 흔적을 제거하기 위해 증류수로 계란을 15 번 헹구십시오. 1000 마이크로 피펫을 사용하여 한 번에 증류수 1 밀리리터를 제거하여 계란을 손상시키지 않도록 주의하십시오.Trpis 용액 1밀리리터로 고정 된 계란을 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 계란은 일단 삭제된 유백색에 도달하는 잠복의 5 분 후에 창백한 패치를 개발하기 시작합니다. Trpis 용액의 모든 흔적을 제거하기 위해 증류수로 계란을 15 번 완전히 헹구십시오.3xP3 프로모터에 의해 구동되는 형광 마커의 발현은 아노펠스 감비아에 푸파의 눈과 복부 중추에서 관찰된다. 다른 색깔의 형광 마커를 사용하여 다른 GAL4 및 UAS 구성 요소를 운반하는 수정 된 개인의 선택 및 검사를 허용합니다. bipartite GAL4-UAS 시스템으로 작업할 때, GAL4 및 UAS 구성 요소를 모두 운반하는 자손을 얻기 위해 다른 긴장에서 남성과 여성을 교차할 필요가있다.강아지의 남성과 여성 외부 생식기에서 관찰 된 차동 형태는 섹스에 사용됩니다. 식별할 수 없는 pupae의 예가 여기에 강조 표시됩니다. 오른쪽에 표시된 것처럼 강아지에서 모든 물을 제거하면 항문 패들이 생식기의 시각화를 모호하게할 때 섹스링 어려움을 증가시킵니다.이 양파르트 GAL4-UAS 시스템은 제어된 현시성 방식으로 유전자 발현의 변형을 허용합니다. 이는 응답자 라인 UAS-mCherry와 함께 운전자 라인을 표현하는 noenocyte 및 유비쿼터스 GAL4 4를 교차하여 시각화할 수 있습니다. 이중 PARTite GAL4-UAS 시스템을 사용하는 주요 이점은 배아 단계에서도 치명적인 표현형을 연구할 수 있다는 것입니다.이렇게하려면 배아의 내부 형태를 시각화해야합니다. 12, 24 및 36시간 후 포설 후 배아 발달의 다른 단계에서 관찰된 정상적인 형태학적 특성은 배아 청산 프로토콜의 완성 후 볼 수 있다. 이 절차 전반에 걸쳐 푸파와 계란은 담정할 수 없다는 것이 중요합니다.따라서 액체를 제거할 때 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. GAL4-UAS 방법은 우리가 기능적으로 살충제 저항에 관련되고 유전자 드라이브 통제 방법에 있는 잠재적인 사용을 가진 그(것)들을 특성화하는 것을 허용했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 조직에 특정한 FLP는 Gal80 표현식 패턴을 결정 수 있도록 Flippase 유도된 교차 Gal80/Gal4 억압 (FINGR) 메서드를 설명합니다. 어디서나 Gal4 및 FLP의 중복은 Gal4 표현은 켜져 있습니다 (Gal80가 정신이 나갔죠) 또는 해제 (Gal80가 뒤집혀). FINGR 방법은 clonal 분석과 신경 회로 매핑을위한 다목적 있습니다.

매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

대량 병렬 DNA 시퀀싱 기술을 기반으로 한 게놈 어셈블리는 대개 매우 단편화되어 있습니다. 물리적 염색체 지도의 개발은 게놈 어셈블리를 잠재적으로 개선할 수 있습니다. 본 연구에서는 물리적 지도 제작의 처리량을 크게 높일 수 있는 염색체 준비, 형광 in situ 하이브리드화 및 이미징에 대한 혁신적인 접근 방식을 제시합니다.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

이 비디오에서는 배아 미세주입 기술을 통해 Anopheles gambiae 모기의 배아에 유전자 드라이브 구조를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 상동 재조합을 통해 전달된 DNA 구조를 생식세포 세포에 통합하여 형질전환된 모기 개체군을 생성할 수 있습니다.

모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

이 프로토콜은 제브라 피쉬의 차 기자로 기본 기자와 GFP / RFP로 인 Gal4-VP16을 사용하여 유전자 트랩 insertional 돌연변이 유발의 방법을 설명합니다. 약 한 고 표현 F0 물고기 수익률 유전자 트랩 자손을 GFP 및 RFP를 공동으로 표현하는 10 명 중. 심사 절차는 쉽게 insertional 돌연변이 화면을 수행하는 실험실의 크기에 적응하기 위해 확장 할 수 있습니다.

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

이 비디오 문서에서는, 우리는 초파리 비행 성인 과일의 후각에 의존 식품 검색 행동에 대한 배고픔이나 포만감의 효과를 측정 할 수있는 자동화 된 분석을 설명합니다.

먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에 초파리

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

학습하세요 Anopheles gambiae에서 GAL4-UAS 시스템을 이용한 기능 유전학 분석 방법을. 유전자 발현의 시공간적 제어를 통해 살충제 내성 및 유전적 방제 전략 관련 유전자를 연구할 수 있습니다.

Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오

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